Введение к работе
Актуальность проблемы. Современные методи низкотемпературного консервирования и длительного хранения различных биологических объектов основаны на применении криозащитных сред, главным компонентом которых являются криопротекторы.
Одним из классов соединений, используемых в качестве крио-протекторов является амиды алифатических карбоновых кислот. Некоторые из этих соединений нашли применение з практике низкотемпературного консервирования лейкоцитов и тромбоцитов человека (Агра-ненко В.А. ,1983), спермы птиц (Курбатов А.Д.,1985), спермиев человека (Паращук Ю.С. ,1985). Однако алифатические амиды в ряде случаев окаэывавт выраженное токсическое действие как на органиэмен-ном, так и на клеточном уровне, что значительно ограничивает их использование в прикладной криобиологии.
Ранее установлено, что одним из возможных способов уменьшения токсичности веществ, не снижавших их криопротскторной активности, является оксиэтилирование (Гучок М.М.,Шраго Н.И.,1978). Так, Оксиэтилирование глицерина, этиленгликоля и морфолина позволило в значительной мере понизить их токсичность и рекомендовать в качестве криопротекгоров для многих биологических объектов (тромбоцитов, лейкоцитов, спермы хряка и т.д.) (Ханина Л.А.,1984," Іраго Ы.И.Д985; Грищенко В.И.,1988).
Естественно предположить, что оксиэтилирование амидов также будет в определенной степени сопровождаться снижением их токсичности, сохраняя криозащитную.активность. Между тем, до настоящего времени вещества ряда оксиэтилированных амидов не испытаны в качестве криопротекторов.
Следует отметить, что оксиэтилирование веществ дает возможность вироко варьировать их степень полимеризации и молекулярно-массовое распределение (ММР) и получать при этом смесь полимерго-мологов, вклвчавщих как низко-,так и высокомолекулярные соединения. Известно (Шенфельд h. ,1982), что механизм взаимодействия амидов с оксидами алканов является сложным процессом, течение которого определяется многими факторами: температурой проведения реакции, природой исходного амида, степеньп оксиэтилирования, полярностью среды. Вместе с тем, многие конкретные вопросы оптимизации условий синтеза аддуктов окиси этилена с амидами недостаточно разработаны, а также не изучены их структура и физико-химические свойства, токсичность и криопротекторная активность.
Таким образом, можно полагать, что оксиэтилированные аниды, представляющие широкую возможность варьировать их степень полимеризации и структуру, является перспективными для создания новых криопротекторов, а также для выяснения возможной зависимости крис— защитной активности исследуемого ряда соединений от их химической структуры и физико-химических свойств не конкретных биологических вбгектах.
Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным цельо настоящей работы явилось: синтезировать ряд оксиэтильных производных амидов, исследовать их физико-химические свойства, токсичность и криопротекторную активность на разных биологических объектах.
Для этого предполагалось реиить следувщие задачи:
-
Определить оптимальные условия синтеза аддуктов окиси этилена с амидами с заданной степени полимеризации и молекулярно-нассовым распределением, исследовать зависимость молекулярно-массо-вого распределения от условий синтеза (на примере М -ацетил этан о-ламина).
-
Провести синтез, очистку, идентификации и изучить физико-химические свойства окриэтилированных амидов со степеньо полимеризации п-2-12.
-
Изучить острув токсичность оксиэтилированных амидов.
-
Изучить цитогоксичность и криопротекторнуо активность оксиэтилированных амидов при криоконсервировании различных биологических объектов (клетки костного иозга крыс и'перевиваемая клеточная культура почки эмбриона свиньи (CIWB).
Научная новизна. Синтезированы новые оксиалкильные производные алифатических амидов (19 соединений). Исследован функциональный и фракционный состав синтезированных аддуктов оксиэтилированных амидов. Впервые определены оптимальные условия синтеза, позволяющие получать оксиэтилированные амиды с заданной степеньо полимеризации и молекулярно-массовым распределением (температура, катализатор, давление и мольное соотношение окиси этилена : анид). Оценены также кинетические параметры синтеза оксиэтилированного-h/ -ацетилэтаноламина : константы скоростей расходования и образования конечных продуктов оксизтилирования; константы распределения и энергии активации для каждого компонента смеси.
доказано, что оксиэтилирование амидов сопровождается в большинстве случаев снижениемих общей токсичности по сравнение с исходными амидами.
Впервые Испытаны вещества с различной степенью полимеризации Из ряда оксиэтилированных амидов (25 соединений) в качестве крио-протесторов при криоконсервировании клеток костного мозга крыс и клеточной культури ігачки эмбриона свиньи (СІШ). В ряду изученных вецеств определены перспективные криопротекторы для перевиваемой клеточной культуры СПЭВ и клеток костного мозга крыс, к которым можно отнести оксиэтилированные ацетамиды со степенью полимеризации п-3-4, 6. 9-10. Разработан оригинальный способ получения нового криопротектора - оксиэтилированного ацетамида со степенью полимеризации п»3-4. предложен метод криоконсервирования клеток перевиваемой культуры СПЭВ под его защитой (А. с.К 1448627).
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты, касавшиеся определения оптимальных условий синтеза оксиэтилированного Л/-ацетидЭтанолемина, а также способа анализа полидисперсных продуктов реакции оксиэтилирования имеют определенное значение в области химии полимеров и могут быть рекомендованы для получения аддуктов окиси этилена с другими амидами в лабораторных условиях.
Экспериментальные величины физико-химических свойств оксиэти-лированных амидов, а также кинетические параметры синтеза оксиэтилированного Л'-ацетилэтанолаиина могут быть использованы как справочные данные.
Установленные зависимости' обдей токсичности, цитотоксичности И криопротекгорной активности оксиэтилированных амидов от их структуры могут служить.методическим подходом для применения новых оксиалкилированных соединений из других классов химических веществ в качестве криозащигных агентов экзо- и эндоцеллилярного механизма действия.
Разработанный режим замораживания-оттаивания для криоконсервирования клеток перевиваемой культуры СПЭВ под защитой оксиэтилированного ацетилэтаноламина со степеньи Полимеризации п«3-4 (А. с. * 14ч8627). Имеет прикладное значение и может быть использован в практике криоконсервации клеточных культур.
Оксиэтилированные ацетамиды со степенью полимеризации п»Э-4, 6,9-10 являются криопротекторами клеток костного мозга крыс, а со степенью полимеризации п»3-4 для клеток СПЭВ и поэтому рекомендуются для дальнейшего исследования их в качестве криопротектеров для других клеток и тканей.
На защиту выносятся следующие положения
-
На основания изучения кинетических параметров реакции оксиэтилировакия амидов (^'-ацетилэтаноламина) оптимальными условиями для синтеза целевых фракций низкомолекулярных олигомеров (п-3-4) с минимальный содержанием примесей являются: соотношение амвдюксид этилена'1:4, температура реакции -І0О-ІІОС, в присутствии катализатора (0,008 Ц КОН), в течение 100 минут.
-
Оксиэтилирование амидов приводит, как правило,к снижении общей токсичности и цитотоксичности полученных олигомеров в сравнении со "стартовыми" амидами, при этом в ряде случаев сохраняется криопротекторная активность их на уровне исходных амидов. В связи с этим реакция оксиэтилирования амидов может быть экспериментально обоснованным подходом для создания новых экзоцеллюляр-ных криопротекторов.
Публикации материалов- исследования. Основные положения диссертации опубликованы в 10 печатных работах и Г авторском свидетельстве на изобретение.
Апробация работы. Материалы раОогы доложены и обсуждены на П Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладный вопросам криобиологии (Харьков,1984), конференции молодых ученых ИПКиК АН Украины (1968), У Всесоюзной конференции го жидкостной хроматографии (Рига ,1990), ІУ Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1991), П Международной-конференции "Успехи современноЯ криобиологии" (Харьков,1992).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 154 стр. машинописного текста и иллв стрирована 21 таблицей и 23 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, б глав собственных исследовании и их обсуждения, выводов и указателя литературы, который включает 132 источника.
