Введение к работе
Актуальность проблеми. В настоящее время изолированные клетки печени находят все более широкое применение в фундаментальных и прикладных областях биологии и медицины. Сохраняя селективные свойства плазматической мембраны и интактность внутриклеточных структур, изолированные гепатоциты адекватно отражают специфические реакции целого органа CThurman R.G., Kauffnan F.C., 1980]. Их использование в фармакологии и токсикологии позволяет не только изучать особенности метаболизма лекарственных и токсических соединений, но одновременно и определять их цито- и гепатотоксичиость CFerro М. et al,19843.
В последнее время интенсивно разрабатываются также вопросы применения изолированных гепатоцитов в клинике для коррекции патологических состояний, вызванных нарушениями функционального состояния печени СОстороверхов Т.Е., 1979; Matas A.J. et al, 19763. В связи с этим становится весьма актуальной проблема направленной регуляции поглощения и биотрансформацни ксенобиотиков, поскольку интенсификация в клетке этих процессов будет способствовать повышению детоксикационных свойств гепатоцитов. В литературе содержится достаточно много сведений о регуляторном влиянии на метаболизм ксенобиотиков гормонов CFrolkis V.V., Valueva G.V., 1.978; McGeoch С. et al,19853, индукторов СЛяхович В.В.,Цырлов Н.Б.,1981; Conney А.Н., 19863, факторов питания [Thurman R.G., Rauffman F.C., 1980; Alvares А.P. et al, 1976; Schwass D.E., Finley J.H., 19853, биологически активных соединений [Тиунов Л.А., 1981; Лукиенко П.И. и др., 19873. Однако целенаправленных исследований в этой области не проводилось, а вопросы регуляции поглощения ксенобиотиков практически не изучены.
Наиболее перспективным решением проблемы хранения изолированных клеток печени на данный момент является создание банка криокон-сервированных гепатоцитов. В литературе освещаются вопросы подбора адекватных режимов замораживания-отогрева [Fuller B.J. et al, 1980; Gonez-Lechon H.J. et al, 19843, соответствующих криопротекторов [Fowls G. et al, 1987; Chesne C, Guillouzo A., 19883 и сред замораживания [Coundouris J. et al, 1986; Maganto P. et al, 19883. В деконсервированных клетках обычно определяют сохранность плазматической мембраны, белок-синтеэирующей активности [Gonez-Lechon H.J. et al, 1984; De Loecker R. et al, 19903, систем глюконеогенеза
CInnes G.K. et al, 19883 и синтеза мочевины CMaganto P. et al, 1988], способности приживляться в культуре CRijntjes R.J.H. et al, 1985; Innes G.K. et al, 19881. В то хе время вопросы влияния крио-консервирования на детоксикационные свойства гепатоцитов, которые играют определяющую роль при использовании этих клеток в медицинской практике, изучены в недостаточной мере.
Б сеязи с этим целью настоящей работы явилось исследование биотрансформации и поглощения ксенобиотика р-нитроакизола (р-НА) изолированными гепатоцитами крыс в зависимости от исходного состояния животного и метода получения клеток, а также изучение действия кпиоконсервирования на детоксикационную способность клеток печени.
В конкретные задачи исследования сходило:
-
Изучение основных характеристик и определение скорость-лимитиру-ющих стадий биотрансформации ксенобиотика р-НА в изолированных гепатоцитах крыс в зависимости от исходного состояния животного (пол, условия питания) и метода выделения клеток.
-
Исследование поглощения и биотрансформации р-НА в гепатоцитах крыс в норме и после введения индуктора фенобарбитала и определение кинетических характеристик этих процессов.
-
Исследование влияния замораживания-отогрева в среде без криопро-тектора на о-деметилирование р-нитроаниэола изолированными гепатоцитами. Проведение сравнительного изучения О-деметилазной активности замороженно-отогретых и пермеабилизированных клеток Печени.
-
Изучение действия отдельных этапов криоконсервирования на биотрансформаци») р-НА гепатоцитами крыс и выявление основных причин нарушения детоксикационной активности.
Научная новизна. В работе впервые исследованы кинетические параметры и скорость-лимитирующие стадии метаболизма ксенобиотика 'р-НА гепатоцитами крыс б зависимости от исходного состояния животного и метода Еыделения клеток. Максимальная активность биотрансформации р-НА обнаружена в гепатоцитах сытых самцов крыс.
Параллельно с биотрансформацией впервые изучался процесс поглощения ксенобиотика р-НА в норме и после введения индуктора фенобарбитала. Установлено, что введение фенобарбитала увеличивает способность клеток печени поглощать и метаболиэировать ксенобиотик, а скоросгь-лимитирующим фактором в этом случае является содержание восстановительных эквивалентов. Сравнение кинетических параметров
поглощения и биотраисформацин p-Hft показало, что процесс поглощения не лимитирует дальнейшего метаболизма ксенобиотика.
Выяснено, что снижение детоксикационной активности криоконсер-вировашшх гепатоцитов не связано с потерей или инактивацией цито-хрона Р-450. Сравнительная оценка Функциональней активности свежо-выделенной и деконсервированиой суспензии гепатоцитов с одинаковой жизнеспособностью, полученной в результате разделении клеток в градиенте плотности перколла, позволила установить, что после крио-консервирования клетки обладают повышенной чувствительностью к изотермической инкубации в присутствии ксенобиотика.
Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования позволяют рекомендовать для наиболее эффективного использования изолированных гепатоцитов в медицинской практике с целью детокенка-ции крови больных применение клеток, выделенных из печени сытых самцов, а также полученных от яивотных, подвергнутых действию индуктора фенобарбитала.
Введение цитрата в среду перфузии оказывает стимулирующее воздействие на монооксигеназную активность изолированных гепатоцитов, если скорость-лимнтируюншм фактсром биотрансформирующей активности является содержание в клетке восстановленного НАДФН.
Эксперименты по функционированию детоксикационной системы гепатоцитов после крноконсервирования в присутствии различных криопро-токторов позволяют сделать вывод о преимуществах использования глицерина, так как это позволяет избежать этапа отмывки от криопротектора.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Детоксикационная активность изолированных гепатоцитов зависит от исходного состояния животного (пола, условий питания, введения индуктора) и может быть дополнительно увеличена включением цитрата в среду выделения клеток. Введение индуктора фенобарбитала стимулирует не только биотрансформацию, но и поглощение ксенобиотика р-нитроанизола.
-
Криоконсервирование гепатоцитов под защитой глицерина или ДМСО позволяет в значительной степени сохранить жизнеспособность и биотрансформирующук; активность суспензии изолированных клеток печени, использование глицерина позволяет исключить этап отмывки от криопротектора.
Апробация работы. Материли диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых Института проблем
криобиологии и криомедицины АН УССР (Харьков, 1989, 19S1 гг) и Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы лекарственной токсикологии" (Купавна, 1990 г).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных работы.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоящего из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Содержит 13 таблиц и 22 рисунка. Список использованной литературы включает ПО наименований.
