Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
Характеристика пептидного семейства меланокортинов 9
Локализация и синтез ме іанокорітшов в мозге м іекопитающих 12
Рег/епторы к мсланокортинам 14
Взаимодействие мечанокортинов с медиаторными системами 19
Поотропные эффекты мечанокортинов 22
Нейропротекторные и нейротрофическне эффекты мечанокортинов 24
Семакс - синтетический аналог АКТГ4 ,,, 27
Гипотеза о реализации ноотропного и нейропротекторного воздействия мечанокортинов через регучяцию
экспрессии белков семейства неиротрофшюв 29
Характеристика билковоі о семейства неиротрофинов 30
Рецепторы неиротрофинов 32
Иейротрофический фактор мозга (BDNF) 35
Функции BDNI в нервной системе 36
Структура и регучяция транскрипции гена bdnf 40
Характеристика транскрипционного фактора creb 43
CREB-зависимая активация транскрипции 45
Функции CREB в нервной системе 49
Характеристика фактора нейрогенеза VEGF 54
Экспрессия VLGF и рецепторов к VEGT в нервной системе 54
Структура и регуляция транскрипции гена \egf 55
Рецепторы VEGF 58
Функции VEGF в нервной систе ме 59
Материалы и методы исследования 64
Эксперименты на культурах астроцит ов и нейронов гиппокампа крысы 64
МТТ тест на количество живых клеток 66
Нммуноцитохимическое окрашивание первичных кучьтур нейронов на ЯШ-тубучин 67
Опредечение уровней мРНК иссчедуемых генов в культурах астроцитов и нейронов гиппокампа крысы
методом ПЦР 68
Определение уровней бечка BDNF в ку іьтурах нейронов гиппокампа крысы методом тшуноферментного
анализа 72
Эксперименты на живо гных in vivo 74
Определение уровней CREB и pCREB в гиппокампе методом иммунобпоттинга 74
Определение уровней бечков BDNF и NGF в гиппокампе крысы методом имиуноферментного анализа 77
Принудительное плавание 78
Почучение плазмы крови крысы 80
Определение уровней АКТГ и а-МСГв образцах плазмы крови с помощью иммуноферментного анализа 80
Статист истичьская оценка результа гов 81
Результаты и их обсуждение 83
1 Влияние острого стресса, вызванного принудительным плаванні м, на уровни а-мсг и актг в плазме крови крысы 84
2 Влияние а-мсг и семакса на уровьнь pcreb в гиппокампь крысы IN VIVO 93
3 Влияние А-МСГ, семакса и меланотана II на BDNF и NGF в гиппокампе крысы in vivo 98
4 Влияние а-мсг и семакса на уровень белка bdnr в первичной культуре нейронов гиппокампа крысы 104
5 Вовлеченность mc4r в осуществление эффектов а-мсг и семакса в культуре пгиронов гиппокампа крысы 109
6 Влияние mfjiahokopthhob на экспрессию мрнк bdnf в культуре астроцитов і иппокампа крысы , вовлеченность mc4r 114
7 Влияние а-мсг на экспрессию мрнк vegf в культуре астроцит ов гиппокампа крысы, роль mc4r 123
Заключение 128
Выводы 130
Список использованной литературы 131
Благодарности 145
- Взаимодействие мечанокортинов с медиаторными системами
- Иейротрофический фактор мозга (BDNF)
- Структура и регуляция транскрипции гена \egf
- Определение уровней АКТГ и а-МСГв образцах плазмы крови с помощью иммуноферментного анализа
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Центральная нервная система (ЦНС) чрезвычайно сложна как на молекулярном и клеточном, так и на структурно-функциональном уровне организации. В число задач, решаемых ЦНС, входит управление движениями, сенсорными и гомеостатическими процессами, многогранными проявлениями высшей нервной деятельности. Успехи современной нейробиологии позволили накопить значительное количество информации о таких важнейших функциях ЦНС, как обучение и память. Однако их молекулярные основы остаются в значительной мере неясными. Основным свойством нервной системы, обеспечивающим эти процессы, является ее пластичность, изучение которой позволит лучше понять механизмы интеграции высших функций мозга. Все процессы, происходящие в нервной системе, направляются на молекулярном уровне целым комплексом веществ-регуляторов. Их поиск, определение способа и области их влияния на пластичность, развитие и регенерацию нервной системы является одной из основных задач нейробиологии.
Неотъемлемой частью современной жизни является такое явление, как стресс -неспецифическая реакция организма на экстремальное воздействие, физическое или психологическое. Согласно концепции общего адаптационного синдрома, умеренное воздействие стрессогенного фактора может повышать защитный потенциал организма в ответ на действие не только данного, но и любого другого повреждающего агента. К адаптациям при стрессе относятся повышение уровня генерализованной активации организма ("arousal"), фокусировка внимания и улучшение памяти, а также стресс-вызванная анальгезия. Однако при таких нарушениях, как генетические заболевания, биогенные или абиогенные повреждения ЦНС, а также слишком резко и драматично меняющиеся внешние условия, центральная нервная система теряет свою способность к адаптации. Нарушения адаптационных функций лежат в основе множества патологических состояний ЦНС, среди которых можно назвать депрессию, хронический стресс и психические заболевания. Изучение физиологии стресса и связанных с ней молекулярных реакций, в частности, в ЦНС, является важнейшей задачей современной биологии и медицины, поскольку только понимание механизмов возникновения и развития заболеваний поможет найти по-настоящему действенные способы их лечения.
Показано, что при стрессе наряду с увеличением концентрации в крови адренокортикотропного гормона (АКТГ) происходит увеличение уровня альфа-
меланокортина (альфа-меланотропин, альфа-меланоцитстимулирующий гормон - а-МСГ). Роль этого представителя пептидного семейства меланокортинов (МК) в осуществлении стрессорных реакций организма до конца не выяснена и представляется крайне интересной в свете ряда его функциональных особенностей. Пептиды семейства меланокортинов способны оказывать нейропротекторные эффекты и вызывать регенерацию нервной ткани (Strand, 1999). Кроме того, в многочисленных исследованиях у МК была выявлена способность стимулировать внимание, обучение и формирование памяти (Stratton and Kastin, 1975). Таким образом, эти пептиды обладают одновременно нейропротекторными и ноотропными свойствами. Однако механизмы их действия на нервную систему до сих пор во многом остаются неясными. Одним из возможных путей развития эффектов МК является их влияние на уровни экспрессии в ЦНС нейротрофических факторов -мощных регуляторов как выживания и дифференцировки нейронов, так и когнитивных функций.
Изучение механизмов нейропротекторного действия меланокортинов является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярно-биологических процессов, лежащих в основе поддержания нормального функционирования ЦНС в неблагоприятных условиях, в частности, при стрессе.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы являлось изучение механизмов нейропротекторных и когнитивных эффектов а-МСГ и его аналогов, включая исследование влияния данных соединений на экспрессию в гиппокампе крысы ряда нейротрофических факторов.
Основные задачи исследования состояли в следующем:
изучить изменения уровня а-МСГ в плазме крови крысы в условиях острого стресса, вызванного принудительным плаванием
изучить влияние меланокортинов на уровень активации транскрипционного фактора CREB {cyclic AMP response element-binding protein) в гиппокампе крысы
изучить влияние меланокортинов на уровни нейротрофинов (BDNF, brain-derived neurotrophic factor и NGF, nerve growth factor) в гиппокампе крысы in vivo
изучить влияние меланокортинов на уровни экспрессии нейротрофических факторов BDNF и VEGF (vascular endothelial growth factor) в клетках гиппокампа крысы in vitro
оценить вовлеченность меланокортинового рецептора 4-го подтипа MC4R в осуществление эффектов представителей семейства меланокортинов на уровни BDNF и VEGF в клетках гиппокампа крысы in vitro
Научная новизна и практическая значимость работы.
В представляемой работе было впервые показано, что эндогенный меланокортин а-МСГ способен оказывать влияние на экспрессию BDNF в гиппокампе крысы in vivo, и получены данные в пользу участия транскрипционного фактора CREB в осуществлении этого влияния. Впервые изучено изменение уровня BDNF в первичной культуре нейронов гиппокампа крысы, а также изменение уровней нейротрофических факторов BDNF и VEGF в первичной культуре астроцитов гиппокампа крысы под действием представителей семейства меланокортинов. Получены данные об участии MC4R в реализации этого эффекта. Впервые получены данные о динамике изменения уровня а-МСГ в плазме крови крысы при остром стрессе, вызванном принудительным плаванием.
Результаты исследования представляют научно-практический интерес в связи с тем, что регуляция экспрессии нейротрофинов и их рецепторов в мозге рассматривается как один из перспективных путей воздействия на ряд патологических состояний ЦНС, связанных с дегенерацией и гибелью нейронов, в том числе обусловленных таким негативным, и в то же время широко распространенным в современной жизни, явлением, как дистресс. Известные к настоящему времени соединения, которые могут рассматриваться в качестве кандидатов на роль регуляторов экспрессии нейротрофинов в мозге, например, антидепрессанты, обладают существенными побочными эффектами, что ограничивает их применение.
Данные о влиянии МК на экспрессию нейротрофических факторов в гиппокампе крысы позволяют предложить возможный механизм наблюдаемых ноотропных и нейропротекторных эффектов этих соединений, что может быть использовано для разработки новых пептидных фармакологических средств, а также для расширения спектра показаний и противопоказаний использования уже известных лекарственных форм. В частности, данные об участии Семакса в регуляции экспрессии нейротрофинов могут предоставить дополнительную информацию для дальнейших клинических исследований лекарственного препарата "Семакс". Доказательства вовлеченности MC4R в регуляцию экспрессии нейротрофических
факторов в мозге позволяют вести поиск новых ноотропных и нейропротекторных препаратов среди соединений - агонистов указанного типа рецепторов.
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы были представлены автором на Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, Россия, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, Россия, 2008), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009), а также на семинарах ОВКМГ Института молекулярной генетики РАН и межлабораторных семинарах, совместных с ОХФАВ Института молекулярной генетики РАН. В завершенном виде результаты диссертационной работы были представлены на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН 02 ноября 2009 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней и тезисы 6 докладов в материалах российских конференций.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 2 таблицы и 32 рисунка. Библиография включает 359 названий.
Взаимодействие мечанокортинов с медиаторными системами
Еще в 70-е годы прошлого столетия голландский исследователь Дэвид де Вид (De Wied et al., 1975) установил, что АКТГ не только усиливает синтез гормонов в клетках коры надпочечников, но и непосредственно влияет на мозг экспериментальных животных, стимулируя внимание и память. Дальнейшие исследования показали, что таким ноотропным действием обладает не только целая молекула гормона, но и его фрагменты. Наиболее эффективным из них оказался пептид из семи аминокислот, АКТГ4. ю, занимающий в молекуле положение с 4-го по 10-е, а самый короткий фрагмент, сохраняющий активность целой молекулы гормона, - пептид АКТГ4.7- Выяснилось, что меланокортины ускоряют восстановление поврежденных нервов и созревание нервно-мышечной системы, а также оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие; влияют па болевую чувствительность; регулируют работу сердечно-сосудистой системы; моделируют половое поведение; обладают антиопиоидной активностью; снижают потребление пищи и массу тела. И В дальнейшем было обнаружено, что и ПОМК, и АКТТ, и фрагменты АКТГ (в том числе и а-МСГ) иммунохимически детектируются в мозге (Oliver and Porter, 1978). Более того, было обнаружено присутствие мРНК для проопиомеланокортина в ряде отделов мозга (Civelli et al., 1982). Эти данные позволили прийти к выводу, что АКТГ и меланокортины являются эндогенными по отношению к мозгу соединениями, и центральная нервная система не только служит мишенью для этих пептидов, но может сама продуцировать их.
Локализация и синтез меланокортинов в мозге млекопитающих. В ходе эмбрионального развития ПОМК детектируется в гипоталамических нейронах эмбриона крысы начиная со срока 12 дней, в то время как в гипофизе иммунореактивность к ПОМК регистрируется лишь начиная с 15 - 16-го дня эмбрионального развития. Наибольший уровень иммунореактивности к ПОМК отмечается на 21 - 29 день постнатального развития (Khachaturian et al., 1983).
Иммунохимическая локализация меланокортинов в основном проводилась с использованием антител к а-МСГ и АКТГ ю АКТГ4-ю был иммунохимически обнаружен в мозге взрослой крысы только в волокнах аркуатного ядра и средней септальной области. Совершенно иная ситуация с распределением АКТГ4.ю возникает при исследовании неонатального (то есть развивающегося) мозга, в нем АКіГ4.10 обнаруживается как в аркуатном ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области. При повреждении черной субстанции взрослой крысы АКТГ4-ю обнаруживался в стриатуме и ряде других отделов мозга (Antonawich et al., 1994). Вопрос о происхождении АКТГ4-ю практически не освещен в доступной литературе; по-видимому, постулируется его протеолитическое выщепление из а-МСГ, на что указывает и сходное распределение этих пептидов в мозге. Таким образом, из данных по экспрессии АКТГ4.ю в мозге крысы следует, что, по-видимому, значение этого меланокортина в функционировании взрослого мозга весьма ограничено. Значительно более широкое распространение АКТГ4-ю в неонатальном мозге свидетельствует о его роли в развитии центральной нервной системы, а появление АКіТ4_10 в отделах поврежденного мозга (по крайней мере, в рамках нигростриатной системы мозга) указывает на вероятное участие АКТГ4.ю в процессах регенерации ЦНС.
В разных отделах мозга взрослой крысы концентрация а-МСГ существенно различается. Наибольшая концентрация а-МСГ обнаружена в гипоталамусе, а в пределах гипоталамуса — в аркуатном ядре (Eskay et al., 1979b). Учитывая, что это ядро дает проекции в другие отделы мозга, можно предположить, что именно оно является для них источником а-МСГ. Действительно, разрушение аркуатного ядра приводит к существенному снижению уровня а-МСГ в остальных отделах мозга (Eskay et al., 1979b; Eskay et al., 1979a). В мозге человека наибольшая концентрация а-МСГ была также обнаружена в гипоталамусе, а кроме того - в черной субстанции (Arai et al., 1986). Интересно, что у больных, страдающих болезнью Альцгеймера, концентрация этого пептида в черной субстанции существенно снижена.
С другой стороны, при удалении гипофиза происходит снижение уровня а-МСГ в гипоталамусе (Brownstein, 1980). В пользу предположения о регуляции гипофизом синтеза предшественника меланокортинов в гипоталамусе были получены дополнительные свидетельства - удаление части ПОМК-синтезирующих клеток гипофиза мыши приводило к увеличению уровня мРНК для ПОМК в гипоталамусе (Zhou et al., 2001). ПОМК или мРНК для ПОМК были обнаружены и в других отделах головного мозга: гиппокампе, амигдале, дорсолатеральном гипоталамусе и среднем мозге (Civelli, 1983; Tranchand-Bunel, 1987). а-МСГ продуцируется не только в ЦНС. Было показано, что уровень а-МСГ в коже ряда грызунов сравним с уровнем этого пептида в отделах головного мозга, не связанных с гипоталамусом (Thody et al., 1983), а ежедневная внутривенная инъекция меченного а-МСГ не привела к увеличению уровня а-МСГ в коже. Таким образом, было предположено, что а-МСГ продуцируется непосредственно в коже. Высокая его концентрация была выявлена в меланоцитах и клетках Лангерганса (Wakamatsu et al., 1997), а также в кератиноцитах (Rousseau et al., 2007).
Рецепторы к меланокортинам. Меланокортиновые рецепторы (MCR) были выделены и клонированы в 1992-1994 годах. Они принадлежат к семейству рецепторов, связанных с G-белками, и представляют собой семидоменные трансмембранные белки. В отличие от других рецепторов, связанных с G-белками, MCR имеют в своей структуре короткую вторую экстрацеллюлярную петлю, интрацеллюлярпые домены на С-конце и короткий экстрацеллюлярный N-концевой домен (Starowicz and Przewlocka, 2003). Существует 5 типов МС рецепторов: MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, MC5R (Mountjoy et al., 1992; Gantz et al., 1993; Chhajlani et al., 1993). Bee 5 типов MCR схожи по строению: на N-конце расположен участок, способный к N-гликозилировапию, а также цистеиновый остаток на С-конце, который является потенциальным сайтом для ацетилирования жирных кислот. Меланокортиновые рецепторы содержат в своей структуре участки, узнаваемые протеинкиназой С и протеинкиназой A (Mountjoy et al., 1992), что указывает на возможность фосфорилирования. Подтипы рецепторов различаются по аминокислотному составу. Наиболее схожи МС4 и МС5 рецепторы - их структуры одинаковы на 60%. Аминокислотный состав MC1R и MC3R совпадает на 45%, а состав MC2R и MC4R - лишь на 38% (Schioth et al., 1998).
МСГ (а- и Р") обладает высокой афинностыо ко всем видам MCR, за исключением рецепторов 2 типа. MC2R селективны к АКТГ (Starowicz and Przewlocka, 2003). Гены MC1R были клонированы впервые из клеток меланомы мыши и из культуры клеток человеческих меланоцитов (Chhajlani et al., 1993; Schioth et al., 1998). Из всех клонированных MC рецепторов MC1R обладали наиболее высокой аффинностью к а-МСГ (Mountjoy, 1994), который является физиологическим регулятором быстрого изменения цвета у низших позвоночных, включая рыб, амфибий и рептилий; а также стимулирует меланогенез в меланоцитах млекопитающих (Sawyer et al., 1980). MCIR были найдены во многих периферических тканях, а также в ЦНС (Hartmeyer et al., 1997; Wikberg, 1999). MCI рецепторы контролируют способность меланоцитов выделять пигмент меланин. Опыты показали, что активация рецепторов приводит к увеличению черно-коричневой пигментации животных, а уменьшение рецепторной активности к увеличению красно-желтой пигментации (Wikberg et al., 2000).
MC2R главным образом экспрессируется в пучковой зоне (сайт глюкокортикоидной продукции) и клубочковой зоне (сайт минералкортикоидной продукции) коры надпочечноков (Chhajlani et al., 1993). MC2R опосредуют стероидные эффекты АКТГ (Xia and Wikberg, 1996). Кроме того, мРНК MC2R экспрессируется в коже человека (Slominski et al., 1996). Экспрессия MC2R была также обнаружена в белой жировой ткани грызунов (но не человека). Было высказано предположение, что MC2R, экспрессируемые в адипоцитах различных млекопитающих, опосредуют липолитическую активность АКТГ (Boston and Cone, 1996). Мутации гена, кодирующего МС2 рецепторы, которые вызывают ослабление рецепторных функций, приводят к наследственной глюкокортикоидной недостаточности (Elias et al., 1999). Однако иногда этот синдром проявляется у людей с нормальным МС2-геном, что говорит о существовании других нарушений, приводящих к этому заболеванию.
Иейротрофический фактор мозга (BDNF)
Структура и регуляция транскрипции гена bdnf. Ген bdnf (рис. 6) состоит из восьми З -нетранслируемых экзонов и одного З -концевого экзона, кодирующего белок, и транскрибируется с нескольких промоторов, расположенных левее З -некодирующих экзонов, что приводит к образованию гетерогенной популяции мРНК. BDNF-транскрипты содержат один из восьми 5 -экзонов, который сплайсирован с 3 -кодирующим экзоном. Все сплайс-донорные и сплайс-акцепторные сайты в местах сочленения экзонов и интронов весьма консервативны. Гомология З -экзонов человека и грызунов колеблется от 45% до 95%, составляя 95, 93, 62, 91, 86 и 45 процентов соответственно для I, II, III, IV, VI и VII экзонов. В результате альтернативного сплайсинга образуются транскрипты, которые отличаются только 5 -экзоном и являются специфичными для определенных тканей и различных областей мозга. Экзон-интронная структура гена BDNF (Aid et al., 2007). A - структура гена BDNF крысы, описанная (Timmusk et al., 1993). В - структура гена BDNF крысы, описанная (Aid et al., 2007). Каждый из 11 вариантов, полученных в ходе альтернативного сплайсинга, подвергается полиаденилированию по одному из двух сайтов, расположенных в 3 области IX экзона. Неясно как происходит сплайсинг внутри II экзона в гене BDNF крысы, вероятно, используются альтернативные сплайс-донорные сайты (А, В, С) в этом экзоне, что приводит к образованию трех различных транскриптов.
Транскрипты, включающие I и III - VIII экзоны были обнаружены как в различных отделах мозга, так и в ненеирональных тканях, таких как семенники, легкие, сердце, тимус, печень и селезенка. мРНК несущая II экзон, представлена сплайс-вариантами А, В, С в мозге и не обнаружена в периферических тканях. (Aid et al., 2007).
Рисунок 7. Комплекс транскрипционных факторов IV промотора BDNF в репрессированном и активированном состояниях (Greer and Greenberg, 2008).
В настоящий момент охарактеризовано несколько транскрипционных факторов, под контролем которых находятся промоторы гена BDNF. К таким факторам относятся CREB (cAMP-responsive element binding protein), USF1/2 (upstream stimulatory factors 1/2), CaRF (calcium-responsive transcription factor), MeCP2 {methyl-cytosine binding protein), MEF2 (myocyte enhancer factor 2) и Npas4 (neuronal PAS domain-containing protein 4).
Промоторы I и IV являются наиболее чувствительными к нейрональной активации, причем последний остается наиболее хорошо изученным и охарактеризованным. В отсутствии стимулов, IV промотор BDNF репрессирован и связан, по крайней мере, с четырьмя из вышеперечисленных транскрипционных факторов (CREB, USF1/2, МеСР2 и MEF2).
После активации Са2+-зависимого сигнального пути под действием нейромедиатора (Shieh et al., 1998; Tao et al., 1998) репрессорный транскрипционный комплекс преобразуется в активаторный и запускает транскрипцию BDNF (рис. 7). Для полной активации транскрипции гистоны должны перейти из метилированного состояния в ацетилированное. Деметилирование гистонов в области IV промотора осуществляет гистондеметилаза JARID1C/SMCX. Повышение концентрации Са в ядре приводит к диссоциации MEF2 от гистондеацетилазы (HDAC). Это становится возможным благодаря дефосфорилированию MEF2 кальцинеурином и фосфорилированию HDAC4 СаМКИ. В это же время происходит фосфорилирование CREB и его ассоциация с коактиватором СВР (CREB-binding protein). Последний обладает гистонацетилтрансферазной активностью и способностью собирать компоненты комплекса РНК полимеразы II. Все эти события происходят в течение 5 минут после высвобождения нейромедиатора в синаптическую щель. Через 15-30 минут ядерная форма СаМКП фосфорилирует МеСР2, вызывая диссоциацию репрессорного комплекса, состоящего из Sin3/ HDAC и метилтрансферазы, от IV промотора BDNF, что приводит к активации транскрипции. В это же время с областью промотора IV экзона связывается следующий транскрипционный фактор - Npas4, поддерживающий активацию транскрипции (Greer and Greenberg, 2008).
Очевидно, что такой сложный механизм регуляции транскрипции обеспечивает образование строго определенного количества BDNF в надлежащем месте, за ограниченный временной интервал. Многообразие транскрипционных факторов позволяет по-разному отвечать на различную частоту стимуляции и уровень Са" в ядре и цитоплазме. Возможно, различные типы клеток экспрессируют и используют только некоторые транскрипционные факторы в определенных комбинациях. Из всего множества факторов регуляции транскрипции, влияющих на экспрессию BDNF, в данном обзоре рассмотрим подробнее такой широко распространенный белок, как CREB. Характеристика транскрипционного фактора CREB.
Белок CREB {cyclic AMP response element-binding protein) — один из наиболее хорошо изученных и важных транскрипционных факторов. К настоящему времени накоплено достаточно большое количество экспериментальных данных, позволяющих утверждать, что CREB-зависимая экспрессия генов играет важнейшую роль в развитии и функционировании нервной системы. В связи с тем, что транскрипция генов нейротрофинов, в частности BDNF, находится под контролем CREB, представляется целесообразным уделить внимание этому транскрипционному фактору.
CREB принадлежит к так называемому bZIP надсемейству транскрипционных факторов, характерной особенностью строения которых является наличие в С-концевой части молекулы домена, регулирующего связывание с ДНК, и лейциновая застежка, обеспечивающая димеризацию. Несмотря на наличие экспрессии CREB в различных тканях, особенно важна его роль в функционировании нервной системы. К изменению уровня активации CREB в нервной системе приводят такие разнообразные внешние воздействия на организм, как обучение, новизна стимула, физическая нагрузка, боль, воспаления, травмы, гипоксия, гипогликемия и др. CREB-зависимая экспрессия генов играет значительную роль как для развивающейся, так и для взрослой нервной системы. Она активируется под действием нейромедиаторов и факторов роста и участвует в регуляции таких процессов, как рост, дифференцировка, выживаемость нейронов, циркадные ритмы. Особенно важным и интересным моментом является регуляция синаптической пластичности — основы основ обучения и памяти.
В 1986 году в промоторе соматостатина была обнаружена последовательность из восьми пар нуклеотидов (TGACGTCA3-5), ответственная за активацию гена в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ (Montminy et al., 1986). Данная последовательность получила название CRE (cyclic AMP response element), и позже была обнаружена и в промоторах других генов. В 1987 году в ядерных экстрактах клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12 с помощью CRE-афинной колонки был обнаружен фосфопротеин массой 43 кДа, связывающийся с CRE последовательностью и названный CREB (Montminy and Bilezlkjian, 1987). В 1988 году была клонирована и секвенирована ДНК, кодирующая CREB (Hoeffler et al., 1988). А в начале 90х гг. прошлого века были обнаружены несколько изоформ CREB, образующихся при альтернативном сплайсинге, в частности альфа и дельта изоформы. Со временем были описаны и другие транскрипционные факторы похожей структуры, в совокупности образовавшие семейство белков CREB. Кроме обнаруженного первым CREB1 к нему относятся такие белки, как CREM (cAMP response element modulator) и ATF1 (activating transcription factor 1). В настоящем обзоре основное внимание будет направлено на строение и функции наиболее исследованного представителя семейства CREB - белка CREB1 (далее - CREB).
На С-конце белка CREB расположен богатый лизином и аргинином основной домен, отвечающий за связывание с ДНК и лейциновая застежка (bZIP), обеспечивающая димеризацию. В центре расположен 60-ти аминокислотный индуцируемый киназой домен KID - (kinase-inducible domain), который содержит участки фосфорилирования. KID фланкирован гидрофобными богатыми глутамином участками, обозначенными Q1 и Q2 (Mayr and Montminy, 2001).
Структура и регуляция транскрипции гена \egf
Western-иммуноблоттинг. Оценку уровня pCREB и тотального CREB в гиппокампе крысы проводили при помощи Western-иммуноблоттинга. Проводили электрофорез белков в системе Лэммли в 5% (концентрирующем) и 12% (разделяющем) полиакриламидном геле. Для приготовления разделяющего геля использовали 30% смесь акриламида (АА, 29,2%) и бис акриламида(бис-АА, 0,8%) которую разбавляли 1,5 М Трис-HCl буфером (рН 8,8) и дистиллированной водой до конечной концентрации Трис-НО 375 мМ. В смесь также добавляли 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), 0,1% APS (персульфат аммония) и 0,1% TEMED (Ы3Ы,К 3К -тетраметидэтилендиамин). Для приготовления концентрирующего геля 30% смесь АА и бис-АА разводили до 5% 0,5 М Трис-HCl буфером (рН 6,8) и дистиллированной водой до конечной концентрации Трис-НО 125 мМ. В смесь также добавляли 0,1% SDS, 0,1% APS и 0,1% TEMED. В работе использовали стекла 8x10см со спейсерами толщиной 0,75 мм. Образцы белковых экстрактов смешивали с буфером, содержащим 0,125 М Трис-HCl (рН 6,8), 4% додецилсульфата натрия (SDS), 20% глицерина, 0,005% бромфенолового синего и 10% Р-меркаптоэтанола, кипятили 5 мин на водяной бане, остужали на тающем льду, осаждали капли кратковременным центрифугированием и вносили образцы в лунки геля. Для проведения электрофореза использовали Трис-глициновый электродный буфер, содержащий 25мМ Трис-HCl, 192мМ глицин, 0,1%о SDS (рН 8,3). Электрофорез проводили при постоянном напряжении 50 В в течение 19 часов.
Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещали в кювету, заполненную буфером для электрофоретического переноса (37мМ Трис-НО, 287мМ глицин, 22,5 % этанол). В другой кювете, заполненной буфером, собирали кассету для переноса по следующей схеме: 3 листа бумаги Whatman 3 ММ, предварительно активированная в метаноле PVDF-мембрана, гель, а затем еще три листа бумаги Whatman. Полученный сэндвич зажимали в кассете и помещали между электродами камеры для переноса, заполненной вышеуказанным буфером, так, чтобы мембрана была обращена к аноду. Электроперенос осуществляли при +4 С и постоянном токе силой 500 мА в течение часа. Качество переноса оценивали окрашиванием мембраны 0,5% раствором Ponceau С, приготовленном на 1%о уксусной кислоте. PVDF-мембрану отмывали буфером TBS (20 мМ Трис-НО, 150 мМ Nad, рН 7,6) до полного исчезновения окраски и инкубировали в течение 1 часа на шейкере при комнатной температуре в буфере TBS, содержащем 3% БСА.
Далее мембрану обрабатывали моноклональными антителами, (Mouse anti-CREB monoclonal antibodies(Chemicon, США), разведение 1:5000 в буфере TBS; Mouse anti-phospho-CREB (Serl33) monoclonal antibodies(Upstate, США), разведение 1:3000 в буфере TBS в течение ночи на шейкере при температуре 4С.
По окончании инкубации мембрану промывали буфером TBS, переносили в раствор, содержащий конъюгат пероксидазы хрена с антителами козы к иммуноглобулинам мыши (ИМТЕК, Россия) в разведении 1:10000 и инкубировали в течение 2 часов на шейкере при комнатной температуре. По окончании инкубации мембрану промывали буфером TBS.
Далее мембрану 1 мин инкубировали в свежеприготовленном растворе, содержащем люминол (ECL, Amersham Bioscinces, США). Мембрану заворачивали в пленку SaranWrap и помещали в фотокассету.
Обработанную вышеописанным образом мембрану 10-20 мин выдерживали с синечувствительной рентгеновской пленкой Retina ХВМ, которую затем проявляли. Проявленную пленку сканировали. Результаты обрабатывались с помощью программы Alpha Imager (оценка относительной оптической плотности) и Sigma Plot (математические вычисления и построение графиков). Определение уровней белков BDNF и NGF в гиппокампе крысы методом иммуноферментного анализа. Гомогенизацию образцов ткани проводили на льду в полистирольных пробирках. Образцы взвешивали, помещали в пробирки и, из расчета на вес (20 мкл буфера на 1 мг ткани), добавляли модифицированный экстракционный буфер (Pollock et al, 2001) (100 мМ PIPES, рН 7,0, 500 мМ NaCl, 0,2% Triton X-100, 0,1% NaN3, 2% BSA, 2 мМ Ыа2-ЭДТА, 200 мкМ PMSF, 10 мкМ леупептина, 0,3 мкМ апротинина, 1 мкМ пепстатина, 0,5 мМ ванадата натрия). Образцы ткани измельчали с помощью пипетирования, затем гомогенизировали политроном (Tissue Tearor Biospec products, Inc). Полученные гомогенаты переносили в микропробирки «эппендорф», разбавляли экстракционным буфером в 5 раз, центрифугировали 1 час (16000 g, 4C), супернатант переносили в новые пробирки, повторно центрифугировали 1 час (16000 g, 4С) и вновь переносили супернатант в новые пробирки. Полученные экстракты хранили при -70 С.
Определение уровня BDNF в полученных экстрактах проводили с использованием набора «BDNF Emax» ImmunoAssay System (Promega, США) и автоматического промывателя планшетов 11112 428 (Иммедтех, Россия) по вышеописанной методике (см. раздел «определение уровня белка BDNF в культурах нейронов гиппокампа крысы методом иммуноферментного анализа»).
Для определения уровня NGF в полученных экстрактах иммуноферментный анализ проводили с использованием набора "NGF Emax" ImmunoAssay System (Promega, США) и автоматического промывателя планшетов 11112 428 (Иммедтех, Россия) по методике, аналогичной вышеописанной для BDNF со следующими отличиями. В лунки 96-ти луночного планшета (Nunc-Immuno MaxiSorp, Nunclon, Дания) вносили по 100 мкл раствора поликлональных антител против NGF (до конечной концентрации 1 мкг/мл) в карбонатном буфере. В качестве вторых антител использовали моноклональные антитела крысы против NGF. В связи с тем, что наши образцы были получены из тканей головного мозга крысы, существовала вероятность неспецифического связывания конъюгированных с пероксидазой антител к иммуноглобулинам крысы. Для контроля такого неспецифического связывания в некоторые лунки мы не вносили поликлональные антитела против NGF, все дальнейшие манипуляции (в том числе и внесение белковых экстрактов гиппокампа) с ними проводили наравне с остальными лунками. Интенсивность окраски в этих лунках была сравнима с нулевой точкой «стандартов».
Определение уровней АКТГ и а-МСГв образцах плазмы крови с помощью иммуноферментного анализа
Нами было исследовано влияние меланокортинов на уровень белка BDNF в первичной культуре нейронов гиппокампа крысы. Мы показали, что а-МСГ и Семакс в дозе 1 нМ не оказывают влияния на уровень белка BDNF в культуре нейронов гиппокапа крысы через 3 часа и через 6 часов после введения пептида (рис. 21). Однако через 24 часа уровень BDNF возрастает под действием а-МСГ в 1,5 раза по сравнению с контролем, а под действием Семакса - в 1,7 раза (рис. 22).
Исходя из полученных данных по временной динамике эффекта исследуемых пептидов, мы выполнили серию экспериментов по выявлению зависимости величины эффекта от вводимой дозы через 24 часа после внесения а-МСГ и Семакса. В лунки культурального планшета с клетками вносили пептиды в концентрациях ОД - 1000 нМ. Этот диапазон концентраций был выбран в связи с тем, что ранее (Grivennikov et al., 2008) было показано, что Семакс в концентрации 100 нМ оказывает нейропротекторное воздействие на холинергические нейроны базальных ядер переднего мозга крысы. Все вышеуказанные концентрации а-МСГ приводили к увеличению уровня BDNF в культуре нейронов гиппокапа крысы примерно в 1,5 раза по сравнению с контролем (рис. 21). Статистически значимых различий между величинами эффектов разных доз выявлено не было. Различные дозы Семакса приводили к увеличению уровня BDNF в 1,7-2 раза по сравнению с контролем (рис. 22). Наибольший эффект достигался при концентрации Семакса 100 нМ. Однако и в этом случае статистически значимых различий между величинами эффектов разных доз выявлено не было.
К настоящему моменту описано пять типов меланокортиновых рецепторов. В ЦНС преимущественно экспрессируются два из них: MC3R и MC4R. Показано, что нейропротекторные эффекты при повреждении спинного мозга в большей степени оказывают агонисты MC4R (Sharma, 2005). Показано, что синтетический агонист MCR NDP-MSH ([Nle4, d-Phe7] a-MSH) обладает нейропротекторным эффектом при глобальной ишемии мозга у песчанок, улучшает обучение и консолидацию памяти в тесте «водный лабиринт Морриса». Эти эффекты предотвращаются предварительным введением селективного антагониста MC4R — HS024 (Giuliani et al., 2006). Кроме того, в исследованиях, связанных с меланокортино-лептиновой системой и контролем веса тела, выявлена связь между BDNF и MC4R. Так мышам, мутантным по 4 типу меланокортиновых рецепторов, свойственна гиперфагия и набор веса. Внутрижелудочковое введение BDNF снимало эти симптомы (Xu et al., 2003а). По мнению авторов, такой эффект указывает на несомненную роль меланокортинов в функционировании системы BDNF/TrkB, причем влияние опосредовано именно MC4R. В свете вышеизложенного нам представилось наиболее интересным изучить вклад в осуществление эффектов а-МСГ и Семакса на экспрессию BDNF в культуре нейронов гиппокампа крысы именно 4го подтипа меланокортиновых рецепторов.
Прежде чем приступить к исследованию вовлеченности MC4R в реализацию эффекта МК на экспрессию нейротрофииов, мы проверили, экспрессируется ли этот тип рецепторов в культивируемых нейронах гиппокампа крысы. мРНК MC4R была обнаружена (рис. 25). В качестве отрицательного контроля для исключения контаминации геномной ДНК использовали негативную пробу (см. Методы исследования), в качестве положительного контроля - тотальную РНК, полученную из гиппокампа взрослой крысы.
Для оценки вовлеченности MC4R в осуществление влияния а-МСГ и Семакса на уровень BDNF в культуре нейронов гиппокампа крысы использовали селективный антагонист этого типа рецепторов - HS028.
Как видно на рис. 26, а-МСГ в концентрации 1 нМ увеличивает уровень BDNF в 1.4 раза по сравнению с контролем. Предварительное добавление HS028 предотвращает это увеличение. Уровень белка BDNF через 24 часа после введения HS028 (в том числе и в присутствии а-МСГ) оказался ниже контрольного. Возможно, это объясняется тем, что в культуре нейронов гиппокампа крысы происходит фоновая экспрессия меланокортинов, агонистов MC4R, регулирующих экспрессию BDNF, и блокирование MC4R снижает уровень BDNF.
Аналогичная картина наблюдалась для Семакса (рис. 27). Семакс в концентрации 1 нМ увеличивает уровень BDNF в 1.8 раза по сравнению с Влияние а-МСГ, Семакса и HS028 на количество живых клеток в первичной культуре нейронов гиппокампа крысы через 24 часа после введения. МТТ-тест на количество жизнеспособных клеток. Mean+SEM, п=8 1 - контроль, 2 - а-МСГ (1нМ), 3 - Семакс (1нМ), 4 - HS028 (1 нМ) контролем. Предварительное добавление HS028 предотвращает это увеличение. Уровень белка BDNF через 24 часа после введения HS028 (в том числе и в присутствии Семакса) оказался ниже контрольного.
Чтобы проверить, не связано ли различие в определяемых уровнях BDNF с изменением количества живых нейронов в культуре, была проведена оценка количества живых клеток с помощью МТТ-теста. Как видно на рисунке 28, через 24 часа после введения пептидов и антагониста HS028 не было обнаружено существенных различий в количестве живых клеток. Таким образом, ни а-МСГ (1нМ), ни Семакс (1нМ), ни HS028 (1нМ) за сутки не оказывали влияния на выживаемость нейронов.
Глиальные клетки, и в частности астроциты, являются, наряду с нейронами, важнейшим компонентом нервной ткани. Значительное количество трофических факторов (в том числе и нейротрофинов) синтезируется именно астроцитами. В связи с этим мы провели ряд экспериментов с целью выяснить, оказывают ли меланокортины влияние на экспрессию BDNF в культивируемых астроцитах гиппокампа крысы. Помимо этого мы проверили, вовлечен ли меланокортиновый рецептор 4 типа, ответственный, по нашим данным (см. выше) за трансдукцию сигнала МК в культивируемых нейронах гиппокампа крысы, в осуществление эффекта меланокортииов на экспрессию BDNF в культуре астроцитов гиппокампа крысы.
Предварительно мы проверили, экспрессируется ли этот тип рецепторов в культивируемых астроцитах гиппокампа крысы. мРНК MC4R была обнаружена (рис. 29). В качестве отрицательного контроля для исключения контаминации геномной ДНК использовали негативную пробу (см. Методы исследования), в качестве положительного контроля — тотальную РНК, полученную из гиппокампа взрослой крысы.
При инкубации астроцитов гиппокампа крысы в течение 1 часа с а-МСГ в концентрации 1 нМ происходит пятикратное увеличение количества мРНК для BDNF (рис. 30). Семакс в той же концентрации увеличивает экспрессию BDNF на уровне мРНК в 3 раза. В случае если одновременно с меланокортином был введен антагонист MC3R и MC4R Shu9119, эффект пептидов предотвращался и уровень мРНК для BDNF не отличался статистически значимо от контроля.
