Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Объект исследования и экспериментальная методика 9
1.1. Кристалл моногидрата оксалата кальция 9
1.2. Получение затравочных кристаллов 12
1.2а. Кристаллы, полученные из мочи 13
1.26. Встречная диффузия в различных гелях 15
1.2в. Получение кристаллов СОМ из растворов 20
1.3. Приготовление растворов с заданным пересыщением 25
1.4. Устройство АСМ и жидкостной ячейки, режимы получения изображений 26
ГЛАВА 2. Механизм и кинетика роста и растворения кристаллов СОМ 32
2.1. Грань (010) 33
2.2. Грань (100) 42
2.3. Основные результаты главы 2 50
ГЛАВА 3. Влияние примесей на кинетику роста и растворения кристаллов СОМ 51
3.1. Влияние известных примесей на рост кристаллов 56
3.1а. Влияние натриевой соли фитиновой кислоты . 56
3.16. Калий-натриевая соль этидроновой кислоты (ксидифон)...66
3.2. Другие примеси 68
3.2а. Метафосфат магния 68
3.2б.ИоныА13+иРе3+ 76
3.3. Основные результаты главы 3 85
ГЛАВА 4. Влияние нестехиометрии раствора на скорость роста кристаллов СОМ 87
4.1. Экспериментальные данные 88
4.2. Сопоставление с теорией 92
4.3. Основные результаты главы 4 101
Заключение 103
Список литературы 106
Работы автора по теме диссертации 120
- Встречная диффузия в различных гелях
- Устройство АСМ и жидкостной ячейки, режимы получения изображений
- Влияние натриевой соли фитиновой кислоты
- Сопоставление с теорией
Введение к работе
Появление атомно-силового микроскопа (АСМ) открыло уникальные возможности, которые были сразу применены во многих областях науки, в том числе и в исследованиях роста кристаллов. Однако это слабо коснулось кристаллов малорастворимых соединений, что связано с экспериментальными трудностями.
Изучение этого класса кристаллов особенно важно и интересно в связи с бурным развитием в последнее время междисциплинарных областей, особенно проблем связанных с медициной, со здоровьем человека. Кристаллы, встречающиеся в организме человека, являются именно малорастворимыми соединениями. Это в первую очередь кальциевые соли [59]: карбонат кальция (твердые ткани зубов), фосфат кальция (кости и почечные камни): и оксалат кальция (почечные камни, практически неподдающиеся ультразвуковому дроблению). Успешно с помощью АСМ исследовались только кристаллы карбоната кальция; например [82, 83, 84]. Несколько вышедших в свет работ по изучению кристаллов оксалата кальция посредством АСМ [27, 34, 45, 72, 73] были, в основном, описательного характера, и их можно рассматривать скорее как предварительные, так как ни механизма, ни кинетики роста изучить не удалось.
Эта работа посвящена исследованиям методом in situ атомно-силовой микроскопии роста и растворения кристаллов моногидрата оксалата кальция (СОМ) — основного компонента почечных камней.
Моногидрат оксалата кальция содержится почти в 80% клинически исследованных почечных камней [36, 63, 100]. За последние 20 лет только в журналах химического и физического профиля появилось более 300 публикаций, посвященных кристаллизации оксалата кальция. Однако до сих пор неизвестны ни причины, ни способы предотвращения и лечения [7] этой вызывающей большие страдания болезни.
Исследуя причины кристаллизации оксалата кальция, биологи концентрировали свое внимание преимущественно на составе, структуре и морфологии эпителиальных тканей мочевыделительной системы, в то время как химики в основном интересовались такими параметрами, как состав раствора, ионная сила, коэффициент ионной активности, константа диссоциации, рН и температура. Физические работы по изучению СОМ были посвящены, в основном, структуре кристаллов. Использовались следующие методики: рентгеноструктурный анализ, клинические наблюдения, химический анализ (оценка скорости образования кристаллов в растворе), сканирующая электронная микроскопия.
Во многих работах, например [64, 65, 66], было показано торможение движения элементарных слоев роста примесью. Это дает основание полагать, что рост кристаллов СОМ также можно затормозить посредством различных примесей. Задачу осложняет тот факт, что не всякая добавка может быть безопасной для человеческого организма и не всякая добавка может пройти почечную фильтрацию.
Каждые 4-5 минут вся кровь организма проходит через почки. То есть в день почки, средний размер которых составляет всего 12x7x3 см3, прокачивают около 2 тонн крови. Скорость общего почечного тока крови 1200 мл/мин [102]. Проходя через почки, кровь освобождается от излишков воды и ненужных веществ. В день выводится 1-1.5 литров мочи.
Поверхность почки подобна губке, она покрыта множеством мельчайших канальцев — нефронов. Диаметр одного нефрона составляет 30 нм. Нефрон можно условно разбить на несколько участков [38], каждый из которых отвечает за свой физико-химический процесс. Вещества с молекулярным весом меньше 68000 г/моль выводятся из крови. Вообще, адресная доставка лекарств в организме - сложная междисциплинарная задача. Мы в выборе примесей ограничились отбором только поі молекулярному размеру и весу вещества.
Исследование кристаллизация малорастворимых веществ важно также для многих крупнотоннажных процессов массовой кристаллизации. Новые возможности эксперимента позволяют изучить эти процессы на микроскопическом уровне.
Классическая модель Ко сселя [44] кристалла, состоящего из кубиков,
не учитывает тот факт, что множество кристаллов имеют больше, чем одну
молекулу, атом или ион в неэквивалентных по симметрии позициях в ячейке
решетки. Безусловно, эта модель дала мощный толчок развитию теории и
практики выращивания, но необходимо делать следующие шаги к описанию
кристаллизации реального кристалла.
Данная работа содержит первые экспериментальные подтверждения развивающейся теории кристаллизации некосселевского кристалла [17, 18]. Целями настоящей диссертационной работы были:
посредством in situ атомно-силовой микроскопии исследовать механизм и кинетику роста и растворения кристаллов СОМ,
исследовать механизм влияния применяемых примесей-ингибиторов роста,
найти новые примеси, способные остановить рост и ускорить растворение кристаллов СОМ,
- проанализировать кинетику роста кристаллов СОМ в зависимости от
соотношения в растворе его компонентов при постоянном пересыщении.
Работа состоит из четырех глав и заключения.
Первая глава посвящена получению кристаллов СОМ и методике проведения эксперимента.
Во второй главе приводятся результаты исследования механизма и кинетики роста в растворе, приближенном к физиологическим условиям.
Третья глава, имеющая наибольшее практическое значение, посвящена исследованию влияния различных примесей на рост и растворение кристаллов СОМ.
В четвертой главе описаны опыты, демонстрирующие сильную зависимость скорости роста СОМ от стехиометрии раствора, несмотря на то, что пересыщение поддерживалось постоянным.
В результате проведенных исследований стало понятным, как растут кристаллы СОМ, найдено вещество, которое быстро останавливает рост СОМ, и два вещества, способствующие растворению кристаллов СОМ даже в пересыщенном по оксалату кальция растворе. Это происходит при концентрациях примеси в растворе менее 0.001 моль/л.
Встречная диффузия в различных гелях
При непосредственном сливании растворимой соли щавелевой кислоты и хлористого кальция размер кристаллов GOM. не превышает 30А. Кристаллы таких размеров невозможно использовать для исследований в АСМ. Необходимо получить кристаллические образцы, размеры которых составляли бы хотя бы десятки микрометров, и желательно, чтобы кристаллы росли на подложке, которую можно было бы напрямую установить в прибор.
Сложность поставленной задачи состоит в том, что растворимость СОМ чрезвычайно мала. Его произведение растворимости при 25С Ksp = 2.0-10"9 моль2/л2 [58], а при 37С Ksp = 2.8-10 9 моль2/л2 [92]. Соответственно, растворимость в этих условиях равна 0.00065 масс% « 4.5-10"5 моль/л и 0.00077 масс%« 5.3-10 5 моль/л.
Так как результативных работ по in situ атомно-силовой микроскопии не было, то подбирать способ приготовления затравочных кристаллов, пригодных нашим целям, мы стали, опробуя все известные варианты. Нам хотелось получить хорошо ограненные кристаллы размером 50-100 мкм. Опробованный образец природного минерала вевеллита имел большое количество включений. Тот же недостаток был у прозрачного; кусочка почечного камня со следами огранки. Была надежда вырастить такие кристаллы в моче. Затем мы пытались получить кристаллы методом встречной диффузии в различных гелях. В итоге пришлось удовлетвориться кристаллами размером 10-30 мкм, полученных спонтанной кристаллизацией из раствора, приготовленного по описанному в [73] рецепту.
В работе использовались реактивы фирмы Merck, содержащих более 99.5 %: СаСЬ, К2С2О4, КС1 и ацетатный буфер с рН=5.6. Применялась дистиллированная вода, прошедшая ионообменную колонку Milli-Q.
Первые кристаллы оксалата кальция были получены нами из мочи людей, страдающих мочекаменной болезнью с выявленной склонностью к образованию оксалатных камней. Если оставить свежую мочу без каких-либо добавок в стерильной колбе на несколько дней, то на дно сосуда выпадут кристаллы СОМ размером до 30-50 мкм. Этот процесс проходит существенно быстрее (около суток) при введении в пищевой рацион продуктов, содержащих большое количество щавелевой кислоты и кальция. За 1-2 недели можно получить кристаллы СОМ длиной 100-500 мкм (рис. 1.2 {1,2}). Возникали также единичные кристаллы COD (рис. 1.2 {3}), обычно имеющие форму четырехугольной пирамиды [9, 13]. При добавлении в мочу хлористого кальция и оксалата калия, кристаллы СОМ достигали размеров до 1-2 мм.
Все это говорит о том, что в почках раствор всегда пересыщен относительно оксалата кальция. К сожалению, кристаллы, полученные из мочи, содержали неизвестные включения и имели очень плохую поверхность, что не позволило использовать их для исследований с помощью АСМ. Несложно получить кристаллы оксалата кальция методом встречной диффузии в различных гелях [23, 25, 29]. Используемый нами метод технически подробно описан в работе Ракина [104], который получал СОМ размером до 0.5 мм. Трубка, в которой находится гель, помещается вертикально в раствор одного реагента, другой заливается в трубку. В наших опытах это были 10%-раствор СаС12 (он заливался в трубку) и 5%-раствор К2С2О4. В ходе реакции: постепенно происходит смешение растворов. Скорость реакции зависит от размеров пор геля и концентрации реагентов. Также, как при получении этим способом кристаллов лизоцима [30, 56], имелось распределение кристаллов вдоль трубки с гелем по количеству, размерам и совершенству. Наиболее совершенные кристаллы, как правило, находились в верхней части столбика геля, где пересыщение было наименьшим. Хорошо ограненные кристаллы СОМ можно получить в силикатном геле [104]. На рис. 1.3а {1,2} представлены кристаллы СОМ типичной формы, полученные нами в силикатном геле. Наряду с кристаллами правильной огранки часто встречаются кристаллы, сдвойникованные по плоскости (100) (рис. 1.3а {3}). В нижней части столбика вблизи границы с хлористым кальцием преимущественно образовывались дендриты. В такой плотной пористой среде как полиметилметакрилат также вырастают хорошо узнаваемые кристаллы СОМ (рис. 1.36). Часто встречаются двойники и агрегировавшие кристаллы. Средний размер кристаллов — 30-50 мкм. В желатине обычно образуются сферолиты (рис. 1.4). Призмы кристаллов СОМ начинают расщепляться в то время, когда их размеры составляют еще несколько микрон, а когда кристалл достигает 50 мкм, он имеет уже правильную сферическую форму. Редко, но все же встречаются кристаллы COD, причем их размеры сравнимы с размерами кристаллов СОМ. В агарозе и агар-агаре преимущественно возникают дендритные кристаллы COD (рис. 1.5). Как описано в [61], четырехугольные пирамиды превращаются в четырехконечные звезды, края их расщепляются, и кристаллы становятся дендритными. Размер дендритов достигал 1 мм. Кристаллы СОМ возникают редко, в виде сферолитов, размеры их по сравнению с кристаллами COD малы.
Устройство АСМ и жидкостной ячейки, режимы получения изображений
Типичное пересыщение было больше 1-2, так как при меньших s роста кристаллов заметить не удавалось. При s 8 в растворе возникали новые кристаллы, падавшие на исследуемую грань и неконтролируемо снижавшие пересыщение. Для каждого этапа эксперимента использовались свежеприготовленные растворы, так как опасались снижения пересыщения за счет спонтанной кристаллизации. Соотношение молярных концентраций кальция и оксалата (кроме специально отмеченных случаев) было равно 20, что близко к физиологическим условиям. Для экспериментов использовался сканирующий атомно-силовой микроскоп типа Nanoscope III фирмы Digital Instruments.
Зонд атомно-силового микроскопа (АСМ) представляет собой острие из твердых материалов, сформированное методами литографии, и крепится на свободном конце упругой пластинки (кантилевера), длина которой варьируется от 0.10 до 0.25 мм. Сканирование поверхности осуществляется за счет перемещения образца относительно зонда. Обеспечивает эти перемещения пьезоманипулятор (рис. 1.8). Прикладывая разность потенциалов к балке прямоугольного сечения, вырезанной из пьезоматериала, можно получить изменение ее геометрических размеров с точностью до тысячных долей нанометра. Комбинация трех балок позволяет перемещать образец по трем координатам.
В экспериментах применялась игла из нитрида кремния с углом при вершине 36 и радиусом закругления 5-20 нм. Максимальная площадь сканирования- 13x13 мкм2. Принцип работы ACM основан на контроле силы взаимодействия между иглой и поверхностью образца [108]. При движении: зонда вдоль поверхности с помощью луча лазера, отражение которого попадает на один из четырех сегментов фотодиода (рис. 1.8), регистрируется отклонение кантилевера. Полученная таким образом информация представляется в компьютере в виде двумерной матрицы целых чисел. Все числа лежат в некотором диапазоне. Этот диапазон сопоставляется с цветовой палитрой, содержащей сотни оттенков. Каждое значение элемента матрицы принимается за. координату Z соответствующей точки и отображается пикселом определенного цвета на прямоугольном изображении. Строка и столбец матрицы, в которых находится это значение, становятся координатами X и Y. В результате получается картина, на которой высота-участка поверхности передается цветом, чем участок выше - тем он светлее, подобный принцип используется в географии.
Из предлагаемых программой возможностей обычно мы пользовались двумя режимами сканирования одновременно: Height- передача рельефа поверхности через гамму цветов и Deflection— подсветка; контрастных предметов для лучшего восприятия человеческим взглядом. Кроме специально отмеченных, все приведенные АСМ-изображения получены в режиме Deflection. Частота сканирования менялась от 10 до 30 Гц в зависимости от скоростей продвижения ростовых слоев. Величина контактной силы между зондом и образцом порядка 10 Н. Для получения изображений с высоким разрешением обычно использовался режим Friction. Ряд возможных артефактов АСМ можно предусмотреть. Так, например, используемая нами программа обработки изображений "FemtoScan Online" (версия 4.8) [60, 105], позволяет вычитать средний наклон поверхности, с помощью усреднения убирать шумовую составляющую, применять усреднение по строкам, медианную фильтрацию и др.
При помощи АСМ возможно наблюдать кристаллы непосредственно в процессе роста. Осуществить это позволяет специальная жидкостная ячейка той же фирмы. Жидкостная ячейка представляет собой перевернутую кювету (рис. 1.9) с двумя отверстиями, в которые вставляются шланги для протока раствора. Кладется она на образец сверху. Кантилевер при этом крепится внутри ячейки, а герметичность обеспечивается за счет резиновой прокладки между подложкой образца и ячейкой с раствором.
Температура раствора в жидкостной ячейке АСМ равнялась tK0MH+5C, т.е. 25-30С. Повышение температуры приблизительно на 5С относительно комнатной связано с нагреванием кюветы лазером АСМ.
Жидкости прокачивались через ячейку с постоянной скоростью перистальтическим насосом. Измерения проводились в кинетическом режиме роста, то есть когда скорость роста не зависит от скорости потока. Для определения скорости потока, при которой выполняется условие кинетического режима, был сделан ряд измерений, отраженных в таблице 1.
Влияние натриевой соли фитиновой кислоты
Регенерация поверхности после повторного введения чистого раствора с тем же пересыщением происходит приблизительно за 15 минут (рис. 3.4г-е).
Форма искривленных после адсорбции примеси ступеней дает основание считать, что торможение ступеней происходит по механизму Кабрера-Вермилли. Тогда повышение пересыщения должно привести к тому, что ступень преодолеет стопоры и будет двигаться с прежним кинетическим коэффициентом.
Для проверки этого предположения были приготовлены растворы, содержащие 1-Ю"6 моль/л фитата, с пересыщениями s 6 и s l2: На рис. 3;6а представлена фотография слюды с кристаллами характерной формы и длины мкм, полученными путем спонтанной кристаллизации из чистого раствора с s 6. В присутствии примеси при том же пересыщении подобных четких кристаллов уже нет: на поверхности подложки, кое-где встречаются мельчайшие зародыши и посторонние образования (рис. 3.66). Резко отличается картина при s 12 (рис. З.бв). Почти вся поверхность слюды покрыта мелкими кристаллическими зародышами; кроме того, встречаются более крупные кристаллы СОМ и COD. Таким образом, можно сделать вывод, что, действительно, при увеличении пересыщения раствора «мертвая зона» преодолевается, кристалл снова начинает расти, а наша интерпретация действия примеси верна. Ответ на другой вопрос остается неясным: почему со временем поверхность превращается в «булыжную мостовую»? Одно из возможных объяснений - это нормальный механизм роста отдельных островков, сформированных дугообразным искривлением ступеней. Как уже отмечалось, даже при малой концентрации примеси в растворе, ее концентрация на поверхности может быть очень большой. Оценим, поверхностную концентрацию примеси, используя формулу 3.3. Если считать, что в растворе, содержащем 1-Ю"6 моль/л: фитата натрия, приблизительно равно 9, то диаметр критического зародыша 10"9м, и поверхностную концентрацию примеси можно оценить как 106 мкм"2. Учитывая параметры решетки кристалла СОМ, посчитаем количество строительных единиц на участке той же площади 1 мкм2 и получим 106-107. Таким образом, количество примесных и строительных частиц на поверхности кристалла сопоставимо. Т.е. возможно, что поверхность становится атомно-шероховатой [106], и начинается нормальный; рост кристалла с включениями примесных частиц. Для того чтобы узнать, так ли это, было получено молекулярное разрешение (рис. 3:7) поверхности одного из «булыжников» на рис. 3.2г. Параметры структуры поверхности по данным AGM: я=6.28 і А, с=11.9 А, /2=109.4. Параметр решетки а можно считать совпадающим с рентгеновскими данными (см. гл.1). Параметр с имеет заметное; но не разительное отличие, и его можно связать с дрейфом образца в данном направлении. Поэтому однозначно утверждать, что исследуемая поверхность кристаллов СОМ включает теперь фитат натрия, нельзя. Другое возможное объяснение обсуждается в пункте 3.4.
Ксидифон продается в аптеках в качестве лекарства. Его применяют как средство, регулирующее кальциевый обмен при мочекаменной болезни и других заболеваниях почек; он предупреждает чрезмерный выход кальция из костей и патологическую кальцификацию мягких тканей [103].
Ксидифон - калий-натриевая соль 1-гидроксиэтилендифосфоновой кислоты (этидроновая кислота). Это соединение является сильным комплексантом кальция. Исследовался рост кристаллов СОМ из раствора, содержащего 1-10"5 моль/л ксидифона (концентрация в 100 раз меньше дозы, назначаемой врачами), 5=5.6.
Эффект связывания ионов кальция в недиссоциирующие комплексы конечно имел место, но это не могло существенно снизить пересыщение, так как концентрация ксидифона на 2 порядка была ниже концентрации кальция. Главным оказалась адсорбция примеси на растущей поверхности, изменение морфологии которой было аналогично случаю с фитатом натрия (рис. 3.8).
Сопоставление с теорией
Принято считать, что при прочих равных условиях скорость роста определяется пересыщением раствора, однако одно и то же значение пересыщения можно получить при различных соотношениях концентраций ионов кальция и оксалата, если их произведение [СаИСгО и коэффициент активности остаются постоянными. Возникает естественный вопрос: влияет ли в этом случае соотношение [Са]/[Сг04] на скорость рост кристаллов СОМ?
До сих пор считалось, что не влияет, хотя это противоречит здравому смыслу, ведь при равенстве концентраций в растворе намного больше материала для строительства кристалла. По-видимому, это устоявшееся заблуждение, как и перенос многих закономерностей кристаллизации кристалла Косселя на более сложные объекты.
Ранее проводились опыты по определению зависимости скорости кристаллизации от величины пересыщения при постоянном соотношении кальция и оксалата [41]. Изучалось и влияние концентрации оксалат-ионов, но пересыщение раствора не вычислялось [13]. В работах [10, 58, 98] скорости кристаллизации оксалата из растворов различной стехиометрии исследовались путем измерения концентрации кальция в растворе при массовой кристаллизации. Там было обнаружено, что скорость роста меняется, когда меняется стехиометрия раствора. Однако значение пересыщения оставалось неизвестным.
Были проведены опыты по росту кристаллов СОМ в растворах с постоянным пересыщением, вычисленным по формуле (1.1) при соотношениях ионов кальция и оксалата равных 0.05; 0.1; 0.17; 0.25; 0.5; 1; 10 и 20. Изображения дислокационного холмика на грани (100) при s=5.6 для [Са]/[Сг04] = 20, 1, 0.05 представлены на рис. 4.1. Измерялась скорость ступеней для двух направлений [001] и [021], в среднем ошибка составляла 10-20%. График зависимости скорости ступеней от [Са]/[С204] (рис. 4.2) наглядно демонстрирует, что скорость ступени V ддя обеих ориентации максимальна при [Са]/[С204І =-1. Наблюдается изменение анизотропии холмика вследствие изменения скоростей ступеней в различных направлениях. Эксперименты для грани (010) были поставлены при двух значениях пересыщений: s=4.6; s=5.6. Изменений внешнего вида дислокационного холмика не происходило. Скорости ступеней измерялись для направлений [001] и [100]. Как видно из графика на рис. 4.3, зависимости скорости ступеней от отношения [Са]/[Сг04] аналогичны результатам для грани (100). Приход к данному месту ступени одного излома означает продвижение ступени вперед на расстояние (а) между рядами строительных единиц (рис. 4.4а). Поэтому скорость ступени где р и Vu - плотность и скорость изломов. Если w+ и w. - частоты присоединения строительных единиц к излому и их отрыва от него, то где Ъ — расстояние между строительными единицами в ступени. Пересыщение раствора определяется как s = (w+-w.)/w., причем w. не зависит от пересыщения [101]. Поэтому Как же будет выглядеть выражение (4.2), если в излом последовательно входят две частицы (катион и анион), каждая из которых характеризуется своими частотами: w+к, W.K И W+A, w./l А.А. Чернов, основываясь на развитой им ранее теории образования полимерной цепи из различных мономеров [107], путем громоздких расчетов получил следующее выражение для скорости излома, в который входят две частицы [17, 18]: Он исходил из того, что электростатическое взаимодействие требует строго определенной последовательности в присоединении новых ионов к изломам. Следовательно, кристаллизация бинарной (или многокомпонентной) системы контролируется кооперативным взаимодействием в каждом изломе (элементарной ячейке). Так как компоненты должны отбираться в изломы, обеспечивая определенную стехиометрию кристалла, то при разных концентрациях компонентов в растворе частота их присоединения может быть различной и, следовательно, скорости роста будут зависеть от этих концентраций. Частица К встроится в излом только в том случае, если на месте останется частица А, и наоборот (рис. 4.46). «Ожидание» частицей одного типа присоединения частицы другого типа лимитирует скорость излома.
