Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 11
1.1 Цепные твердофазные реакции свободных радикалов в облученных кристаллах углеводов 11
1.1.1 Общие закономерности реакций свободных радикалов в органических кристаллах 12
1.1.2 Реакции СР в облученных кристаллах моногидрата лактозы 17
1.1.3 Реакции СР в облученных кристаллах рамнозы 23
1.1.4 Реакции СР в облученных кристаллах сахарозы 26
1.2 Лиохимические реакции свободных радикалов облученных углеводов 29
1.2.1 Мономолекулярные перегруппировки свободных радикалов .30
1.2.2 Реакции рекомбинации и окисления свободных радикалов .31
1.2.3 Реакции перекисных свободных радикалов 32
2 Подготовка образцов и методы их исследования 37
2.1 Подготовка образцов 37
2.2 Методы исследования 37
2.2.1 Спектрофотометрия 37
2.2.2 Хроматография 38
2.2.3 Методы химического анализа 39
2.2.4 Математическая обработка экспериментальных данных и расчет межатомных расстояний в кристаллах УВ 44
3 Экспериментальные результаты 46
3.1 Лактоза 46
3.1 Рамноза 63
3.2 Сахароза 82
4 Обсуждение результатов. 100
Выводы 114
- Лиохимические реакции свободных радикалов облученных углеводов
- Методы исследования
- Математическая обработка экспериментальных данных и расчет межатомных расстояний в кристаллах УВ
- Сахароза
Введение к работе
Актуальность темы
Одним из наиболее эффективных и широко применяемых в мире направлений прикладных радиационных технологий является облучение ионизирующими излучениями изделий для медицины и продуктов питания. Радиационная обработка таких объектов проводится, как правило, для полного (стерилизация) или частичного (деконтаминация) подавления жизнедеятельности микроорганизмов в объектах обработки [1 — 3].
Обработка продуктов питания ионизирующим излучением относится к так называемым высоким технологиям и применяется в Европе, Америке и Азии в промышленных масштабах уже несколько десятилетий [2]. Для этих целей используются ускорители электронов или специальные гамма-установки с различными источниками ионизирующего излучения.
Для облучения пищевых продуктов используются лишь определенные радиационные источники: изотопы кобальт-60 или цезий-137, электронные ускорители с максимальной энергией не более 10 МэВ. Энергия этих излучений сравнительно невелика и не вызывает наведенную радиоактивность в любом материале, в том числе и в продуктах питания. Радиационный метод, позволяющий существенно продлить сроки хранения, уничтожить патогенную микрофлору применяется для ряда продуктов питания: яичного порошка, лактозы, различных специй, желатина, мяса птицы и других [4, 5]. Кроме того, радиационную обработку предлагается использовать для утилизации углеводов [6].
Радиационная стерилизация является наиболее безопасным и эффективным методом для обработки продуктов с объемным распределением загрязняющей микрофлоры. Уже в 1978 г. было предложено обрабатывать у-лучами трутневой расплод для увеличения срока хранения при его массовом употреблении как диетического продукта [7]. С 90-х годов появились сообщения о сравнительно небольших потерях биологической активности меда при радиационной стерилизации [8].
В практической медицине давно используются медикаменты, стерилизованные ионизирующим излучением. Радиационным путем стерилизуют такие изделия как шприцы, катетеры, системы переливания крови, шовный материал, перевязочный материал, искусственные сосуды, сердечные клапаны, тальк и др. В Великобритании налажен промышленный выпуск некоторых обработанных ИИ антибиотиков, талька, парафина, физраствора в п/э упаковке. В Австралии — для ряда порошкообразных антибиотиков, глазных мазей, глины, сульфаниламидов [1, 2]. В России радиационной обработке подвергаются ватно-марлевые повязки, радиоизотопные препараты, раствор глюкозы для в/в введения, лекарственный препарат Витамедин-М [9, 10].
Однако, фактором, сдерживающим развитие радиационной технологии, считается недостаточная экспериментальная и теоретическая изученность процессов, протекающих при взаимодействии твёрдой облучённой продукции с растворителем, в частности, судьбы свободных радикалов (СР), образующихся в процессе радиолиза.
Многие из перечисленных выше объектов, стерилизуемых радиационным путем, в той или иной степени содержат моно-, ди- или полисахариды. Поэтому изучению механизмов радиолиза, как твердых углеводов, так и их водных растворов посвящено большое количество работ [11]. Однако процессы, приводящие к образованию МП, присутствующих в растворах облученных твердых углеводов, практически не изучены. Этот факт и все перечисленные выше соображения делают весьма актуальным как с теоретической, так и с практической точек зрения предпринятое исследование.
Первые исследования радиолиза углеводов были проведены еще в 60-х годах 20-го [12] века. А к 80-м годам результаты подобных исследований были обобщены в монографиях [11, 13]. Все эти материалы стали хорошей базой для дальнейших исследований, проведенных на кафедре Радиационной технологии Санкт-Петербургского государственного технологического института в конце предыдущего столетия.
В ходе проведения этих работ было показано, что для детального понимания всех процессов, приводящих к образованию молекулярных продуктов, присутствующих в конечном растворе облученного углевода, необходим комплексный методический подход, сформулированный в работе [9]. Он базируется на экспериментально установленных фактах, свидетельствующих о том, что указанные МП имеют различную предысторию. Одна группа этих соединений образуется в ходе пострадиационных твердофазных реакций, т.е. в самом кристалле, а другая — в процессе растворения облученного твердого тела в результате лиохимических реакций свободных радикалов. Схематично всю совокупность этих процессов можно представить в виде таблицы 1.
Было также установлено, что при растворении облученных кристаллов в воде, содержащей кислород, часть высвобождающихся СР, после окисления до перекисных (R02*), вступают в реакции, приводящие к высвечиванию квантов света (лиолюминесценции). Этот эффект было предложено использовать для дозиметрии ИИ [14]. Однако, квантовый выход этого свечения крайне мал (—10" - 10" квантов/радикал) [14, 15], что свидетельствует о том, что оно возникает в побочных каналах превращений СР. Пути же превращения основной доли СР, выходящих в раствор, оставались не выясненными.
В частности, не было установлено: какие соединения ответственны за спектры оптического поглощения растворов облученных УВ, поскольку высказывавшиеся по этому поводу предположения [11] не выдерживают критики при их количественной верификации. Кроме того, в литературе, посвященной обсуждаемой проблеме, имеются лишь отрывочные сведения о влиянии состава растворителя на выходы МП, присутствующих в конечных растворах облученных углеводов [9].
Таблица 1 — Схема протекания радиационно-инициированных процессов в облученных полигидроксильных соединениях [9]
Терминологическое обозначение процесса
Пострадиационные твердофазные реакции
Взаимодействующие реакционные частицы и молекулярные продукты CP(i...„) (1...П)
МП(1...п)
Условия протекания процесса iплавл. образца
Факторы, влияющие на процесс
Температура, продолжительность хранения, степень дефектности образца (1...П)
Лиохимичес- кие реакции
Пост-процессы в растворе
С?\и.п) МП^...^ (1...П)
Контакт с растворителем
В процессе хранения конечного раствора
Скорость растворения, рН среды, наличие акцепторов СР
Температура, продолжительность хранения раствора, рН среды, присутствие кислорода
Цели и задачи
Поэтому основной целью предпринятого нами исследования стало выяснение структуры МП лиохимических реакций СР углеводов механизмов их образования и оценка вклада, который вносят продукты этих реакций в суммарный спектр оптического поглощения растворов облученных УВ.
Кроме того, оставался не выясненным вопрос о том, сколь существенна корреляция расстояний между реакционными центрами в кристаллах углеводов и вероятностью взаимодействия этих частиц. Ответ на этот вопрос мог способствовать уточнению механизмов цепных твердофазных реакций СР в облученных УВ.
Для достижения указанных целей было необходимо решить следующие задачи:
Критически проанализировать литературные данные о структурах и кинетике содержания СР в изучаемых углеводах и провести стереохимическую верификацию ранее предложенных механизмов твердофазных цепных процессов образования МП в облученных кристаллах лактозы, рамнозы и некоторых других углеводов.
Методами УФ-спектрофотометрии, ВЭЖХ и химического анализа изучить влияние на состав и спектральные характеристики МП лиохимических реакций таких факторов, как рН растворителя, присутствие в нем акцепторов СР (в том числе, кислорода), и предыстории облученных кристаллов УВ.
Используя метод сопоставления кинетики накопления и разрушения СР в облученных УВ с экспериментально полученными кинетическими зависимостями содержания МП в растворах исследуемых образцов сделать выводы о механизмах процессов, протекающих при растворении облученных кристаллов.
Обобщить полученные данные и сопоставить их с имеющимися в литературе сведениями о механизмах радиолиза УВ.
Объекты исследования
В качестве основных объектов исследования были выбраны такие УВ как сахароза, рамноза и лактоза, а при моделировании твердофазных процесссов дополнительно были рассмотрены ксилоза и арабиноза. Этот выбор обусловлен следующими фактами:
Для перечисленных облученных УВ методом ЭПР детально изучены структуры стабилизированных при комнатной температуре СР и их кинетики.
Относительной простотой методов очистки и выращивания монокристаллов данных УВ.
Кроме того, лактоза и сахароза являются самыми распространенными в природе УВ и часто используются в качестве наполнителей таблетированных лекарственных препаратов, для стерилизации которых предлагается использовать ИИ.
Лиохимические реакции свободных радикалов облученных углеводов
Основным фактором, сдерживающим развитие технологий стерилизации медицинской и фармацевтической продукции, консервирования и пастеризации продуктов питания является недостаточная экспериментальная и теоретическая изученность процессов, протекающих при взаимодействии твердой облученной продукции с растворителем, в частности, судьба свободных радикалов [50]. Интерес исследователей к проблеме реакций, протекающих при растворении облученных неорганических кристаллов, возник достаточно давно [51] и поддерживается по настоящее время [52, 53]. Для органических же соединений - подобные публикации были единичными [54, 55]. С точки зрения процессов образования молекулярных продуктов, неизбежная в большинстве случаев стадия контакта облученного материала с растворителем очень важна. Молекулы последнего, разрушая структуру твердого тела, увеличивают конформационную и диффузионную подвижность, а, следовательно, и реакционную способность стабилизированных в нем свободных радикалов. На основании современных представлений о процессах, протекающих на границе раздела фаз твердое тело - растворитель [56], и экспериментальных данных о таковых для углеводсодержащих веществ [57, 58] в работе [59] была предложена следующая систематизация лиохимических реакций по их механизмам и пространственным зонам локализации: - реакции мономолекулярных перегруппировок свободных радикалов; При растворении органических кристаллов возмущающее воздействие растворителя вряд ли может распространяться более чем на несколько постоянных решетки в глубь твердого тела, поскольку для ионных кристаллов эта величина лежит в пределах 30 — 100 А [56]. Тогда для средней скорости растворения 0,1 г-мин"1 время нахождения радикала в возмущенной приповерхностной зоне кристалла будет составлять 10"3 — 10 4 с. На этом временном отрезке возможны следующие реакции изомеризации оксиалкильных свободных радикалов углеводов: дегидратация (1.15), раскрытие пиранозного или фуранозного цикла (1.16), (1.17). В любом из этих случаев образуются радикалы, содержащие структурный фрагмент ( С"-Н), дальнейшие пути превращения которых могут существенно отличаться от таковых для исходных гидроксиалкильных радикалов. По некоторым оценкам, константа скорости реакции (1.15) К в растворе составляет порядка 106 с"1 [60], что свидетельствует о возможности реализации подобного процесса еще на границе раздела фаз, а результаты экспериментов авторов работы [61] подтверждают реальность указанных процессов. 1.2.2 Реакции рекомбинации и окисления свободных радикалов Для изучения этих процессов особенно информативным оказался метод, основанный на регистрации свечения, возникающего при растворении облученных твердых тел - лиолюминесценции [56].
Поскольку к лиолюминесценции приводят главным образом реакции перекисных радикалов, то уменьшение выхода этого свечения по мере увеличения средней концентрации свободных радикалов в матрице является следствием реакции (1.18), конкурирующей с реакцией (1.19) в приповерхностном слое растворителя [62]. R + R R2 (1.18) R + ОУ+ R02 (1.19) Экспериментальные данные работы [24] позволяют утверждать, что при растворении кристаллических углеводов, облученных дозой менее 2 кГр, на один "вышедший" в раствор радикал расходуется одна молекула кислорода. Следовательно, конкуренция реакций (1.18) и (1.19) проявляется лишь тогда, когда концентрация свободных радикалов в 17 1 твердом теле превышает (2 — 3)»10 радикалові" . Значительное уменьшение концентрации присутствующего в растворителе кислорода после растворения в нем облученных кристаллов [63, 64] свидетельствует о том, что данный канал лиохимических реакций является основным. 1.2.3 Реакции перекисных свободных радикалов На лиохимические реакции образования перекисных соединений не оказывает существенного влияния структура исходного свободного радикала (реакции (1.20) и (1.21)): R02 + RH - ROOH + R (1.20) R(V +R ROOR (L21) Значительное уменьшение концентрации присутствующего в растворителе кислорода при растворении в нем облученных углеводов [40] в совокупности с величиной выхода перекисей в конечном растворе (порядка 1 молекулы из одного радикала [62, 65, 66]) указывают на то, что этот канал превращения радикалов в растворах в присутствии кислорода является основным. Аналогичная ситуация прослеживается и в случае с целлюлозосодержащими материалами [67] и с тем отличием, что образование перекисей начинается еще до их контактов с растворителем [67, 68] при проникновении кислорода в аморфную часть облученного образца.
Другим весьма распространенным каналом образования перекиси является реакция рекомбинации гидроперекисных радикалов (1.22), возникающих в лиосистеме в результате элиминирования из перекисных оксиалкильных радикалов (1.23): корреляция содержания в образце третичных алкильных радикалов с количеством органических кислот, образующихся при растворении образцов в аэрированной воде и со светосуммой лиолюминесценции в области 630 нм. Увеличение скорости растворения облученного кристалла приводит к уменьшению выхода кислоты, указывая на наличие конкуренции двух процессов: мономолекулярной реакции образования кислоты из перекисного трет.-алкильного радикала и бимолекулярного взаимодействия этих радикалов, не приводящего к ее образованию. При этом мономолекулярный путь превращения перекисных радикалов для пентаэритрита не является основным, и лишь 1 радикал из 100 приводит к образованию молекулы кислоты. Анализируя влияние скорости растворения облученных кристаллов сахарозы на выход карбонилсодержащих продуктов лиохимических реакций авторы работы [9] обнаружили, что увеличение этого параметра в 4 раза (с 1»10" до 4» 10" г»см" с" ) приводит к увеличению выхода почти в 10 раз. Эти данные позволили оценить порядок реакции образования карбонилсодержащих продуктов как 1,8 ± 0,2, что указывает на преобладание бимолекулярного механизма реакции их образования, по-видимому, реакции рекомбинации перекисных СР (1.24). Аналогичный результат получен и в случае с облученным ксилитом [9]. Принимая на основании литературных данных [45, 46] константы скоростей реакций K(u5) 106с"!, К(іЛ5) да К(і.і5) даЮ9 М/с и с учетом простых соотношений скоростей конкурирующих реакций в работе [9] сделан вывод, что, если реакции (1.15) — (1.17) протекают в возмущенной растворителем области кристалла, то в приграничную область должны "выходить" исключительно изомеризованные радикальные продукты этих реакций. В случае, если эти реакции выступают в качестве конкурирующих с реакциями (1.18), (1.19), (т.е. протекают в приграничной области раствора), то обсуждаемая конкуренция будет проявляться в том, что доля свободных радикалов, претерпевших изомеризацию, в диапазоне поглощенных доз 0 100 кГр будет составлять лишь доли процента, а при больших дозах - ещё меньше [61]. Автор работы [9] считает, что сопоставимость количества карбонилсодержащих МП лиохимических реакций с количеством содержащихся в облученных кристаллах СР позволяет считать первый вариант более вероятным, т.е. ЛХ реакции изомеризации "первичных" СР начинаются уже в "возмущенной" растворителем области кристалла. В объем же растворителя поступают либо СР не предрасположенные к подобным перегруппировкам, либо небольшая доля СР, избежавших изомеризации в соответствии со статистическими закономерностями, определяемыми скоростями конкурирующих реакций. Перекисные и карбонилсодержащие продукты радиационо-инициированных превращений полигидроксильных соединений относятся к биологически-активным веществам и способны, в зависимости от концентрации проявлять как токсическое, так и стимулирующее действие на живые организмы.
Методы исследования
Спектры оптического поглощения представляют собой зависимость оптической плотности (А) от длинны волны падающего света. Положение максимума оптического поглощения является важной оптической характеристикой вещества, а характер и вид спектра поглощения характеризуют его качественную индивидуальность. Спектры поглощения веществ регистрируют на спектрофотометрах, позволяющих определить зависимость оптической плотности от длины падающего света (в видимой и ультрафиолетовой областях спектра). Для регистрации спектров оптического поглощения в данной работе использовался однолучевой спектрофотометр СФ-46. Для проведения спектрофотометрического исследования молекулярного состава растворов облученного УВ навеску растворяли в 4, 5 и 8 мл растворителя для сахарозы, рамнозы и лактозы соответственно и после отбора 1 мл для хроматографического анализа доводили тем же растворителем до объема 12 мл. 2.2.2 Хроматография При выполнении данной работы был использован отечественный серийный микроколоночный хроматограф «Милихром». Он имеет шприцевой насос вместительностью 2500 мкл, выполненный из упрочненного стекла, причем жидкость контактирует только с высокоинертными материалами: фторопластом, стеклом, танталом, что позволяет использовать высокоагрессивные растворители и добавки. Насос рассчитан на давление 10 МПа и диапазон подачи растворителя от 1 до 600 мкл/мин. Детектором служит сканирующий спектрофотометр с диапазоном длин волн 190 — 360 нм и временем сканирования от 0,15 с, что позволяет осуществлять сканирование в выбранном диапазоне длин волн без остановки потока. Диапазон оптических плотностей детектора от 12,8 до 0,05 единиц адсорбции на всю шкалу в пересчете на длину оптического пути 10 мм. Микрокювета детектора имеет вместимость 1,5 мкл при длине оптического пути 1,5 мм. Набор пробы от 0,1 мкл и более осуществляется засасыванием пробы в иглу путем регулирования хода шагового двигателя, управляющего насосом. Все соединительные линии в хроматографе выполнены из полиэтиленовых капилляров. Шприцевой насос «Милихром» имеет привод от шагового двигателя, что позволяет обеспечить высокую воспроизводимость удерживания и количества вводимой пробы.
В заключении следует отметить два важных момента, касающихся работы спектрометрического детектора. Во-первых, он позволяет регистрировать хроматограммы, представляющие собой комбинацию из двух, трех и более хроматограмм, зафиксированных при различных длинах волн. Такие хроматограммы дают возможность получить качественную информацию о химических соединениях, замаскированных в одном пике, о природе и структуре вещества, длине волны, при которой поглощение данного вещества максимально. Во вторых, данный детектор оснащен дополнительными устройствами, позволяющими зарегистрировать ультрафиолетовый спектр оптического поглощения пика, соответствующего данному веществу, при остановке потока растворителя в момент прохождения пика через кювету. В ходе предварительной работы для регистрации исследуемых нами растворов углеводов в качестве привитого сорбента был выбран силасорб ДЕА, а в качестве элюента использовался водный раствор, содержащий 50 % этанола и 0,05 молярный трис гидроксиметил аминометана. 2.2.3 Методы химического анализа Определение содержания малонового диальдегида Из литературных данных известно, что в процессе радиолиза водных растворов УВ образуется малоновый диальдегид. Для определения концентрации МДА был использован метод, основанный на реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой [52, 53]. В нашей работе мы так же использовали данный метод анализа для определения содержания МДА в пробах. Реактив представлял собой прогретый и отфильтрованный после охлаждения 0,72 % раствор тиобарбитуровой кислоты в 15 % растворе трихлоруксусной кислоты.39 Пробу смешивали с равным количеством реактива и прогревали в течение 30 минут при температуре 60 С. Количество МДА определяли спектрофотометрически, обрабатывая пик с максимумом поглощения при 530 нм и известным десятичным молярным коэффициентом поглощения є = 1,56-105 дм оль см"1. Для хроматографической идентификации МДА получения калибровочного графика зависимости оптической плотности растворов ТБК с МДА при 530 нм от концентрации МДА мы провели химический синтез этого соединения, используя реакцию периодатного окисления 2дезокси-Д-рибозы (2ДДР). Для этого НС1 (13 М) разбавили в 100 раз и добавили 0,43 гр. КЮ4 и 0,34 гр. 2ДДР [70]. В последствии эти растворы были также использованы для хроматографических экспериментов. Титрование В качестве титранта использовали насыщенный водный раствор гидроксида кальция [11, 71]. Для того, что бы определить его истинную концентрацию раствор титровали щавелевой кислотой с известной концентрацией. Далее проводили рН-метрическое титрование водных растворов кристаллов облученного УВ до рН = 7. Исходя из расхода титранта определяли количество кислот в нашей пробе. Анализ содержания оксикислот в растворе Приготовление реактива выполняли по следующей схеме: навеску хлорида железа (3) в кристаллах растворяли в 100 мл воды с добавлением 0.1 мл соляной кислоты. Для анализа смешивали пробу и приготовленный реагент в равных количествах: 2 мл пробы к 2 мл реактива. Далее регистрировали и анализировали спектры оптического поглощения в области 320 - 380 нм [72]. Анализ содержания гидроперекисей в растворе Гидроперекисные соединения определяли иодметрическим методом без подкисления анализируемого раствора, чтобы исключить из суммы регистрируемых продуктов перекиси вида ROOR [73]. Метод акцепторов Этот метод позволяет изучить влияние присутствия в растворе акцепторов свободных радикалов на молекулярный состав конечных растворов [74]. Применение данного метода в работе представляло для нас значительный интерес, так как акцептирование СР в растворе является доказательством важной роли лиохимических процессов. Нами были использованы два вида акцепторов - это тетранитрометан и ДФПГ.
Математическая обработка экспериментальных данных и расчет межатомных расстояний в кристаллах УВ
В ходе проведения данной работы для каждой серии экспериментов набиралась статистика, после чего рассчитывались среднеарифметические значения измеряемых величин и их абсолютные погрешности с использованием коэффициента Стьюдента (доверительная вероятность 0.95). При построении кинетических кривых применялся МНК. Обработка экспериментальных данных проводилась на ПК с использованием следующих программ: Microsoft Word 2000 — текстовый редактор; Microsoft Exel 2000 - редакторе электронных таблиц; Mathcad 2001 Professional - математический пакет; Adobe Photoshop 7.0 - графический редактор; Xara X - векторный и растровый графический редактор. Исследование приоритетных направлений развития цепных процессов в облученных твердых УВ было проведено путем расчета математической модели, построенной для анализа внутрикристаллических процессов в углеводах и реализованной в виде программы "Ccalc". Эта программа позволяет, зная координаты центральной молекулы ячейки кристалла, трансляции для молекул окружения и параметры кристаллической ячейки рассчитывать координаты всех атомов любых молекул и межатомные расстояния внутри кристалла. Язык реализации "С". Листинг программы приведен в приложении 1. Компьютерное моделирование кристаллической решетки углеводов позволило нам анализировать все возможные пути переноса водородных атомов исходя, прежде всего, из критерия максимально допустимого расстояния между реакционными центрами. Тем самым существенно расширились возможности анализа реакционных путей не очевидных с позиций структурной химии, базирующейся на экспериментальном опыте изучения реакций в растворах. В результате изучения литературных данных (см. раздел 1.1.2) мы выяснили, что оксикислотные продукты в облученной лактозе наблюдаются лишь при температурах выше 270 К, что связано с началом гибели СР4. Механизм образования 5-дезоксилактобионовой кислоты (1.1 о) подтвержден как результатами изучения структуры свободных радикалов (СР) методом ЭПР [28], так и данными о структуре молекулярных продуктов (МП), полученными с использованием хромато-масс-спектрометрии, однако структура радикала, образующегося вместе с этим МП, оставалась не очевидной. Обсуждая данный процесс образования оксикислотного МП, мы рассмотрели следующие варианты его развития: 1) В случае реализации в кристалле моногидрата лактозы последовательности реакций (1.10), определяющим является расстояние между атомом углерода Cs нулевой молекулы и Н5 (атом водорода связанный с С5 ) молекул окружения.
Вычислив эти расстояния (см. приложение Б таблица Б.1) мы выяснили, что требование г 4 А действительно выполняется и лишь в одном из кристаллографических направлений это расстояние составляет 3.8 А (в остальных случаях 5.8 г 13.4), т.е. развитие цепного процесса образования 5-дезоксилактобионовой кислоты в направлении [х; у; 1.0+z] является наиболее вероятным. 2) Теоретически возможным мы считали переход СР4 в молекулярный продукт с образованием СР1. Поэтому мы рассчитали расстояние между атомом углерода Cs нулевой молекулы и Ні (атом водорода при Сі) молекул окружения: Однако, расстояния (см. приложение Б таблица Б.1) по всем направлениям превышают 4 А. 3) Так же мы не исключали возможность протекания процесса образования МП, в результате которого радикалом ведущим цепь будет СР5. Определяющим в этом случае является расстояние между атомом углерода С5 нулевой молекулы и Ні (атом водорода при Сі ) молекул" окружения. Но и в этом случае расчеты показали (см. приложение Б таблица Б.1), что ни одно расстояние не удовлетворяет поставленному условию. Следовательно, наиболее вероятным путем протекания реакции образования обсуждаемого молекулярного продукта в моногидрате лактозы является реакция перехода СР4 в СРЗ по направлению [х; у; 1.0+z], что подтверждает предложенный в работе [9] механизм образования 5-дезоксилактобионовой кислоты (1.10): конкретному кристаллографическому направлению с расстоянием между реакционными центрами. Таким образом, в наших руках оказался дополнительный метод верификации гипотетических механизмов радикал-молекулярных реакций. Мы применили этот метод для анализа экспериментально зафиксированного ранее факта перехода СР4 в СР5. Рассмотрев все возможные варианты переноса атома водорода Hj к атому углерода С5 от соседних молекул, мы выяснили, что осуществление данного процесса возможно только путем внутрирадикальной перегруппировки, так как лишь в этом случае выполняется условие г 4 А и расстояние между реакционными центрами составляет 3.3 А. Результаты расчетов приведены в приложении 2 таблица Б.2. Исходя из известного по литературным данным радиационно- химического выхода, спектральных характеристик 5- дезоксилактобионовой кислоты и результатов собственных экспериментов мы оценили вклад этого продукта в суммарное оптическое поглощение конечных растворов облученной лактозы (рисунок 3.2). Являясь а-оксикислотой, 5-дезоксилактобионовая кислота обладает характерным максимумом в спектре поглощения при 225 нм (молярный коэффициент поглощения - Е22о 100 дм -моль" -см" ).
Величина оптической плотности раствора, полученного при растворении облученных кристаллов лактозы в дезаэрированной кислой среде при этой длине волны, позволяет оценить РХВ оксикислот как G 50 молекула/100 эВ, что согласуется с результатами [31, 39]. В ходе экспериментов по изучению влияния рН среды на спектры уже растворенных облученных кристаллов (кристаллы растворены в щелочной среде, и затем раствор подкислен, или - в кислой среде, в которую потом добавили щелочь) (рисунки 3.3, 3.4), обратили внимание на следующие закономерности. 1. Форма и полуширина коротковолновой полосы (200 - 250 нм) в спектре как кислых, так и щелочных растворов позволяет предположить, что она представляет собой суперпозицию как минимум 2-х кривых с imax 215 нм и max 230 нм. При этом интенсивность и положение максимума первой из них практически не зависит от рН среды, а характеристики второй несколько меняются при изменении этого параметра. 2. Растворение облученных кристаллов в кислом растворителе с последующим подщелачиванием приводит к образованию дополнительного количества МП, по сравнению с присутствующими в растворах, полученных при растворении облученной лактозы в щелочной среде при А, тах 270, 300 и 370 нм, в то время как растворение в щелочи сопровождается образованием дополнительного поглощения при 215, 230 и 350 нм в сравнении с кислой средой. Добавление бромной воды (рисунок 3.5) к растворам облученной лактозы приводит к резкому уменьшению интенсивности ряда полос. В коротковолновой области спектра оптического поглощения остается практически единственный максимум при A.max = 225 нм. Можно предположить, что именно он определяется присутствием в растворе 5-дезолактобионовой кислоты, поскольку она должна быть инертной по отношению к этому реагенту. Количественный анализ спектров поглощения растворов облученной лактозы (рисунки 3.6, 3.7) и оценка теоретически возможных концентраций МП в этих растворах указывают на то, что константы є обсуждаемых соединений должны лежать в диапазоне є = 103 - 105 дм3 Моль",,см 1. Сопоставляя положения максимумов регистрируемых в спектрах поглощения с литературными данными [77 — 81] о спектральных характеристиках потенциальных продуктов реакций СР лактозы мы пришли к выводу, что соединениями, ответственными за образование полосы поглощения могут быть молекулы а,Р-непредельных карбонильных или Р-дикарбонильных (МДА-подобных) соединений в их енольной форме. Малоновый диальдегид является одним из конкретных МП радиол иза растворов УВ. Этот факт позволил предположить, что данный продукт может образовываться и в случае растворения твердых облученных УВ, и, обладая высоким значением десятичного молярного коэффициента поглощения, способен вносить существенный вклад в спектры изучаемых растворов. На рисунке 3.8 приведены спектры раствора МДА в кислой и щелочной среде.
Сахароза
В процессе хранения облученных кристаллов при комнатной температуре содержание в них СР13 не изменяется, а СРП количественно превращается в течение первых суток после окончания облучения в СР12 (см. рисунок). Сопоставление этих данных с экспериментально полученными кинетическими зависимостями содержания МП в растворе является основным методическим приемом, позволяющим судить о механизмах процессов, протекающих при растворении облученных кристаллов, т.е. о механизмах лиохимических реакций СР. Приведенные на рисунке 3.28 спектры оптического поглощения растворов облученной сахарозы в кислой среде свидетельствуют о присутствии в образцах карбонилсодержащих соединений (КСС) ( макс = 270 нм) и, как можно было предположить, карбоновых кислот (КК) ( W = 200-220HM)[9]. Учитывая тот факт, что суммарный радиационно-химический выход (G) СР в кристаллах сахарозы составляет около 4 радикал/100 эВ [9], а типичное значение молярного десятичного коэффициента поглощения (є) КСС, содержащих изолированную карбонильную группу, в спектральном диапазоне 260 - 300 нм составляет є 20 дм3моль" см"1 [92, 95], можно провести количественную оценку результатов, представленных на рисунке 3.28. Оказалось, что даже если каждый содержащийся в твердом теле СР, в ходе растворения образца образует молекулу КСС с изолированной карбонильной группой, то оптическая плотность конечного раствора в обсуждаемой спектральной области не может превышать 0.01. С другой стороны по результатам химического анализа [9] суммарный РХВ КСС в растворах облученной сахарозы в пределах 100 часов после окончания облучения составляет 4- -6 молекул/100 эВ. Следовательно, молярный десятичный коэффициент поглощения с учетом наблюдаемых в эксперименте оптических плотностей должен составить 103 -105 ДАЛЮЛЬ СМ"1 ДЛЯ а-гидроксикарбоновых кислот характерны значения коэффициента є22о 5! 100 дм3моль",см"1 [78, 80, 83]. Следовательно, и для коротковолновой полосы в спектрах поглощения анализируемых растворов наблюдается примерно десятикратное различие расчетной и наблюдаемой оптическими плотностями. Применив рН-метрическое титрование, мы определили суммарный выход кислотных продуктов, образовавшихся как в ходе твердофазных реакций СР облученной сахарозы, так и в ходе лиохимических процессов около 8 ± 0,5 мол-л/100 эВ.
Количественная оценка кинетических зависимостей, полученных в результате химического анализа на содержание оксикислот в исследуемых растворах, подтвердила, что вклад поглощения оксикислот в общее поглощение МП, регистрируемых в области 220 нм не превышает 15 % и не может объяснить основную долю поглощения света в этой области спектра. Устранить эти противоречия можно только допустив, что коротковолновая полоса с Х акс = 200 - 220 нм обусловлена присутствием в образцах непредельных карбонильных соединений вида Ri-CO-CH=CH-R.2 (є22о = 0.5 -І- 1-Ю4 дм3моль"1см"1) [77 - 81], а длинноволновая - МДА и МДА-подобных молекул (включающих в себя р-дикарбонильный фрагмент в енольной форме - -СО-СН=СОН-). Для последних характерны значения є 1 -г- 3« 104 дм3моль"1см"1 в области 260 - 300 нм [77 - 81], поэтому присутствие данных МП в конечных растворах способно и качественно и количественно объяснить представленные результаты. Сравнение спектров оптического поглощения растворов облученной сахарозы со спектрами таких модельных соединений как ацетилацетон и ацетоуксусный эфир, а также влияния на них рН растворителя (рисунки 3.29, 3.30) подтверждает высказанное предположение. Действие боргидрида натрия (рисунок 3.31 и хроматограммы 3.33, 3.34), избирательно восстанавливающего КСС и добавление бромной воды (рисунок 3.32), разрушающей двойные углерод-углеродные связи, приводит к уменьшению поглощения в спектрах объекта исследования и подтверждает присутствие в МП, ответственных за поглощение света в анализируемых областях спектра, карбонильных и непредельных структурных фрагментов. Суммарная концентрация МП в растворах облученной сахарозы, рассчитанная исходя из РХВ СР в предположении образования одной молекулы МП из одного СР, в условиях эксперимента составляет примерно 1,0 10" М. Следовательно, чтобы объяснить наблюдаемые спектры поглощения в кислой среде достаточно, чтобы около 10 % этих молекул содержали непредельный карбонильный фрагмент, а еще 2 % — были кето-енолами.
Очевидно, что образование обсуждаемых МП происходит в лиохимических реакциях СР. Об этом, в первую очередь, свидетельствуют результаты экспериментов по изучению влияния на эффективность образования обсуждаемых МП присутствия в растворителе таких акцепторов СР как ТНМ и ДФПГ. Представленные на рисунках 3.35 - 3.37 результаты, свидетельствуют о том, что указанные акцепторы активно вступают в лиохимические реакции с радикалами сахарозы. Этот процесс приводит к разрушению ДФПГ, а в случае с ТНМ - к образованию нитроформа, что позволяет оценить количество СР, высвобождающихся из растворяющихся кристаллов. При этом в хроматограммах (рисунок 3.38) наблюдается резкое уменьшение количества МП в присутствии акцепторов СР. Так анализ представленных на рисунке 3.35 зависимостей позволил установить, что процент расхода радикалов на реакцию акцептирования ТНМ с образованием нитроформа составил 45 % от общего числа СР в навеске, рассчитанного исходя из суммарного выхода СР (по литературным данным [1]). Проведя серию экспериментов с растворами ДФПГ с = 2-Ю 4 моль/л мы получили зависимости представленные на рисунке 3.36. Проведя количественную оценку полученных результатов, мы установили, что с ДФПГ прореагировало 32,5 % СР, причем ДФПГ израсходовался полностью. Тогда было принято решение увеличить концентрацию ДФПГ в 10 раз. Выполнив аналогичные исследования с растворами ДФПГ с = 2 10 моль/л, мы получили спектры оптического пропускания, приведенные на рисунке 3.37. Расчеты показали, что в реакцию акцептирования вступило 54 % СР. При этом, вид представленных кривых свидетельствует о том, что акцептор присутствовал в растворе в избытке. Дополнительные доказательства важной роли лиохимических реакций в процессе образования МП, регистрируемых в растворах облученных кристаллов сахарозы, мы получили, проанализировав хроматограммы растворов облученных образцов в насыщенной ТНМ воде (рисунок 3.38). Причем хроматографический анализ растворов облученной сахарозы в насыщенной ТНМ воде показал, что зафиксированные на 270 нм при анализе водных растворов облученных кристаллов соединения, характеризующиеся объемами удержания в диапазоне 300 - 500 мкл, отсутствуют, что является неопровержимым доказательством лиохимической природы их образования. Кроме того, о лиохимической природе происхождения обсуждаемых МП свидетельствует вид кривых на рисунке 3.39. Сопоставление этих зависимостей с результатами, представленными на рисунке 1.7 позволяет считать, что в кислой среде ответственные за поглощение при 220 нм МП образуются из радикалов СР11 и СРІЗ. По аналогии с реакциями взаимодействия алкильных СР между собой [60], образование обсуждаемых МП можно представить в виде реакций дегидратации и последующего диспропорционирования (3.8):
