Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЫ: Обзор литературы 13
Глава 1. Современные аспекты этиопатогенеза ревматоидного артрита 13
Глава 2. Медико-биологическое значение пуринового метаболизма. роль ксантиноксидазы и антител к ней в патогенезе ревматических заболеваний 19
Глава 3. Возможности использования иммобилизи-рованных форм биологически активных веществ в диагностике ревматических , заболеваний 35
ЧАСТЬ II. Собственные исследования 40
Глава 4. Материалы и методы исследований 40
4.1. Получение образцов исследуемого материала 40.
4.2. Характеристика антигена 40
4.3. Иммобилизация фермента 40
4.4. Оригинальные иммунологические методы исследования 41
4.4.1. Определение антител к КО иммуноферментным методом с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента 42
4.5. Регенерация магнитосорбентов 43
4.6. Дополнительные иммунологические и общеклинические лабораторные методы исследования 44.
4.7. Биохимические методы исследования 44
4.7.1. Определение активности ксантиноксидазы в сыворотке крови...45
4.7.2. Определение активности ксантиндегидрогеназы в сыворотке крови 47
4.8. Статистический анализ полученных результатов 48.
Глава 5. Клиническая характеристика больных 49
5.1. Больные остеоартрозом 49
5.2. Больные с подагрическим артритом 53
5.3. Больные ревматоидным артритом 57
5.4. Здоровые лица 63
Глава 6. Изучение иммунобиохимических свойств иммобилизированных магнитоуправляемых сорбентов на основе ксантиноксидазы 64
6.1. Изучение влияния специфических иммуноглобулинов на ферментативную активность ксантиноксидазы 64
6.2. Изучение влияния регенерации магнитоуправляемых сорбентов на свойства иммобилизированного фермента 66
Глава 7. Содержание антител к ксантиноксидазе в контрольных группах 67
7.1. Содержание антител к ксантиноксидазе у здоровых лиц 67
7.2. Содержание антител к ксантиноксидазе у больных остеоартрозом 67
7.3. Содержание антител к ксантиноксидазе у больных с подагрическим артритом 69
Глава 8. Содержание антител к ксантиноксидазе у больных ревматоидным артритом 72
8.1. Содержание антител к ксантиноксидазе у больных ревматоидным артритом (группа в целом) 72
8.2. Содержание антител к КО у больных ревматоидным артритом в зависимости от активности патологического процесса 75
8.3. Содержание антител к КО в зависимости от характера течения ревматоидного артрита 80.
8.4. Содержание антител к КО в различных клинических группах больных ревматоидным артритом 82
8.5. Влияние антител к КО на ферментативную активность ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы в сыворотке крови больных ревматоидным артритом 87
8.6. Влияние терапии на содержание антител к КО у больных ревматоидным артритом 90
Глава 9. Определение антител к ксантиноксидазе в дифференциальной диагностике ра, оа и па 93
Обсуждение полученных результатов 96
Выводы 112
Практические рекомендации 113
Литература
- Оригинальные иммунологические методы исследования
- Больные с подагрическим артритом
- Изучение влияния регенерации магнитоуправляемых сорбентов на свойства иммобилизированного фермента
- Содержание антител к ксантиноксидазе у больных остеоартрозом
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ
Ревматоидный артрит (РА) — аутоиммунное заболевание: неизвестной этиологищтипичным признакомзкоторого является персистирующишсиновит,. симметрично поражающий периферические суставы и приводящий-;к^деструкции суставного хряща с эрозированием подлежащей;костной ткани[47].
. Являясь одним из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний суставов,, РА отличается' склонностью к неуклонному прогрессированию,. что существенным? образом: ухудшает не только качество-жизни больного и членов его семьи; но? к> снижает трудовые возможности общества, приводя к значительным экономическим потерям.
В Российской Федерации1 ежегодно1 впервые регистрируется/ до 55-- тыс: случаев; воспалительных ревматических, болезней1 у взрослых и до 17 тыс. случаев:—-у детей до 17 лет..Среди регистрируемых нозологических формРЗ. в 2005 году в.России показатель заболеваемости ревматоидным артритом^ (РА)= у взрослых составил 240 на; 100 000 человек [64].
Медико-социальная^значимостьРА.обусловлена развитием заболевания* и наступлением инвалидизации часто в молодом, трудоспособном возрасте. Причем, более половины пациентов с РА стойко теряют трудоспособность, уже через 7-10 лет от начала заболевания; Весьма тревожным является ^обстоятельство; что инвалидизация,наступает быстро:(при ревматоидном;артрите 50% больных становятсяшнвалидами;11-й или L-ш группы в течение первых 3 лет от момента постановки диагноза):ипрактически;не оставляет шансовша возвращение, ктрудовой деятельности: [44,55,64;262].
Кроме того, необходимо иметь»в ^виду, что:ревматические заболевания в целом и РА в частности, обладают высокой стоимостью лечения; которая складывается из затрат, обусловленных длительным, в подавляющем большинстве случаев - пожизненным, медикаментозным лечением, а. также эндо-протезированием суставов, и многочисленных непрямых затрат.
Неизвестная этиология РА, отсутствие методов профилактики и недостаток фундаментальных исследований в изучении патогенеза заболевания определяют относительно низкую эффективность лечения больных данного профиля, а полное излечение больных РА считается весьма проблематичным. Тем не менее, активные научные исследования в данном направлении продолжаются. В последнее десятилетие разработаны, новые тест-системы для-ранней диагностики заболевания, выявлены отдельные маркёры прогноза, генно-инженерным путём синтезированы лекарственные препараты нового поколения.
Патогенез РА представляется весьма сложным, включающим в себя разнообразные звенья: воспалительные, дистрофические, аллергические, генетические, возможно, инфекционные, иммунологические, из которых наиболее изучены последние, и на их нормализацию направлено основное лечение больных. По современным представлениям поражение соединительной ткани при РА является следствием не только развивающихся иммунопатологических нарушений, но и различных нарушений, связанных с метаболическими процессами, происходящими на клеточном или субклеточном уровнях, медиаторами которых являются ферменты. Не ослабевает интерес к исследованию роли реакций свободнорадикального окисления в развитии РА. Образующиеся при этом заболевании активные формы кислорода могут оказывать патогенное воздействие на биомолекулы и структуры клетки непосредственно либо инициируя процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводя к деградации коллагена, гиалуроновой кислоты, повреждению соединительной ткани.
В этом аспекте представляются перспективными исследования, направленные на изучение эндогенных факторов, способствующих интенсификации свободнорадикального-окисления и ПОЛ. Одним из таких факторов * является ксантиноксидаза (КО, ЕС 1.1.3.2.) - фермент, действующий на заключительном этапе пуринового метаболизма, окисляющий ксантин и гипоксантин до мочевой кислоты. Своеобразие действия этого фермента заключается в том,
9 что он представляет собой как бы комплекс, функционирующий двояко: фермент может работать как оксидаза, и как дегидрогеназа. По соотношению активности ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы можно судить о напряженности оксидантных и антиоксидантных процессов.
Согласно данным ряда авторов [52, 78] у больных РА наблюдается существенные изменения, активности ряда ферментов пуринового метаболизма в сыворотке крови, которые коррелируют со степенью активности патологического процесса. Учитывая^характерные иммунологические нарушения-при аутоиммунных заболеваниях, можно предположить, что изменение энзиматиче-ской активности ряда ферментов пуринового метаболизма, в частности КО, может быть связано не только с влиянием окислительных процессов и метаболических нарушений, но также и с гиперпродукцией аутоантител к данным энзимам; Определение антител к КО и выяснение их влияния на активность этого фермента у больных РА как с позиций диагностики активности и формы, патологического процесса, изучения отдельных звеньев патогенеза заболевания, так и возможности коррекции нарушений антиоксидантного статуса, контроля эффективности проводимой терапии представляет собой актуальную задачу.
Настоящая работа является фрагментом отраслевой научно-технической-программы в области медицины.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью настоящего исследования является усовершенствование иммунологической диагностики, дифференциальной диагностики и объективизация контроля* эффективности проводимой терапии у больных ревматоидным артритом путем исследования* антителообразованияі к ксантиноксидазе с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи: 1. Получить иммобилизированную форму КО, изучить ее- физико-химические свойства.
Адаптировать иммуноферментный метод анализа с использованием КО в качестве антигенной матрицы к изучению образования Ат к этому ферменту.
Изучить содержание антител к КО в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности, формы и характера течения заболевания.
Изучить энзиматическую активность КО, КДГ и содержание Ат к КО в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности и формы заболевания; оценить возможность использования Ат к КО в качестве диагностического теста в дифференциальной диагностике РА, ОА и ПА.
На основе иммуноанализа изучить динамику антителообразования к КО у больных РА в процессе стационарного лечения; оценить возможность использования Ат к КО в качестве объективного критерия эффективно-сти проводимой терапии.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые для иммунодиагностики РА разработан и применен в предложенном варианте иммуноферментного анализа метод с использованием иммо-билизированной формы КО, подобраны оптимальные условия его постановки. В сыворотках крови больных РА обнаружены антитела к КО. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотке крови здоровых лиц, больных ОА и подагрическим артритом.
Выявлено, что концентрация антител к КО у больных РА коррелирует с активностью патологического процесса; а наличие висцеральных проявлений сопровождается максимальными значениями исследуемых аутоантител. Динамика уровня Ат к КО позволяет прогнозировать клиническое течение РА и судить об эффективности проводимой терапии.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ
Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к КО на основе им-.
мобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента. Выявление Ат к КО в предложенной модификации ИФА может быть использовано в качестве дополнительных тестов в комплексной диагностике РА для характеристики активности патологического процесса, особенно на ранних стадиях заболевания, и прогнозирования клинических форм РА. Определение антител к КО в динамике дает возможность судить об эффективности и адекватности проводимой терапии.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
На защиту выносится положение о возможности использования определения антител к ксантиноксидазе иммуноферментным методом с помощью иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента в качестве дополнительного теста для диагностики степени активности, характера течения, формы, РА, оценки эффективности проводимой терапии, дифференциальной диагностике с остеоартрозом и подагрическим артритом.
ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, из которых 9 — в центральной и 9 - в местной печати. Материалы диссертации были представлены на ежегодных научно-практических конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2006, 2007 гг.), научных конференциях ГУ НИИ КиЭР РАМН (2006, 2007, 2008 гг.), на конгрессе EULAR (Амстердам, Нидерланды, 2006 г.), 1-ом и П-ом Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2006, 2007), II Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2007), XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2008), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), на-
12 учно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2007» (Санкт-Петербург, 2007), V конференции с международным участием «Диагностика в клинической медицине» (Египет, Хургада, 2008), юбилейной XV Международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2008), IV Всероссийской конференции «Инновационные технологии в ревматологии» (Нижний Новгород, 2008).
Результаты диссертации были апробированы на совместном заседании ученого совета ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии; РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» 17 марта 2008 года (Протокол №2).
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ
Методы определения антител к КО у больных РА иммуноферментным методом с помощью иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента внедрены в практику работы Муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница № 25» г. Волгограда, Государственного учреждения здравоохранения «Волгоградский областной клинический госпиталь ветеранов войн», Муниципального учреждения здравоохранения «Городская больница №1 им. С.З.Фишера» г. Волжского, Муниципального учреждения здравоохранения «Городская больница №2» (г. Ставрополь).
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, 9 глав, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами, 14 рисунками, 2 выписками из истории болезни. Указатель литературы содержит» 287 источников, в том числе 96 отечественных и 191 иностранный.
ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Оригинальные иммунологические методы исследования
Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). На первом этапе в лунки планшета вносили по 150 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина в ЗФР для предотвращения неспецифического связывания белка с полистироловой поверхностью. После 1 часа инкубации при 37С планшеты промывали ЗФРТ и вносили по 100 мкл 10% взвеси гранулированного магнитосорбента с иммобилизированной КО, выполняющей роль специфического антигена, и по 100 мкл исследуемых сывороток (в дубликатах), разведенных 1% БСА до концентрации 1:100. Параллельно ставили контроль на субстрат и конъюгат. Через 1 час инкубации при 24С и отмывки 5 раз по 3 минуты в каждый планшет вносили афинно очищенные антитела против иммуноглобулинов G человека, меченые перокси-дазой, в рабочем разведении 1:1000, указанном фирмой-изготовителем (Sigma, США). После инкубации на магнитной мешалке (1 час при 24С) и отмывки (5 раз по 3 минуты) в лунки планшета вносили по 100 мкл субстрата (3,3 ,5,5 -тетраметилбензидин в цитратно-фосфатном буфере с перекисью водорода) и выдерживали 15-30 мин при комнатной температуре (18-25С). При правильной постановке в контрольных лунках реакция не развивалась. В опыте появлялось синее окрашивание, интенсивность которого возрастала с увеличением количества выявляемых антител. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 5% раствора Н2804, после чего гранулы магнитосорбента-удаляли из лунок.
Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм, полученные значения выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.), для получения которых от среднего значения измеренных оптических плотностей исследуемого образца вычитали среднее значение фона, измеренного в лунках, в которые вместо исследуемых образцов помещали аналогичный объем 0,01М фосфатного буферного раствора (рН 7,4), содержавшим 1% БСА.
Наличие антител считалось положительным при превышении значений оптической плотности на 2 стандартных отклонения от средних значений контрольной группы.
Регенерацию МС с иммобилизированными ферментами проводили путем промывки гранул 0,1М буфером глицин-HCl (рН 2,0) восемь раз по 20±3 минут. Впоследствии гранулы МС отмывались ЗФР до нейтральных значений рН и до исчезновения следов белка при спектрофотометрическом контроле (экстинкция меньше 0,05 на длине волны 280 нм). Регенерированные-препараты могут повторно использоваться для определения антител к КО по вышеописанной методике.
С диагностической целью, а также для оценки корреляции с изучаемыми показателями был проведен целый ряд иммунологических проб, позволяющих охарактеризовать иммунный статус больных РА. Методом радиальной иммунодиф фузии в геле по Манчини определяли различные классы иммуноглобулинов: A, G, М. Ревматоидный фактор выявляли с помощью теста латекс агглютинации. Циркулирующие иммунные1 комплексы определяли методом преципитации с полиэтиленгликолем 6000 по Haskova в модификации Б.А.Лемперта. Определение антинуклеарного фактора по Кунсу проводилось методом непрямой иммунофлюоресцен-ции с использованием в качестве субстрата криостатных срезов печени белой крысы в качественном варианте с выделением типа и интенсивности свечения [46].
Общеклинические лабораторные исследования выполнялись по методикам, описанным ранее [46]. У больных проводился общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, тромбоцитов (по показаниям - ретикулоцитов), общий анализ мочи с количественным определением протеинурии и микроскопическим исследованием. Биохимические анализы включали определение билирубина, аминотрансфераз (аланиновой и аспарагиновой), мочевины и креатинина сыворотки, общего белка крови. По показаниям проводилось исследование коагулограммы.
Активность изучаемых ферментов определялась в сыворотке крови, которая, забиралась у больных (и« здоровых) из локтевой вены утром до приема пищи. Кровь со следамш гемолиза не использовалась. Исследова- ние энзиматической- активности КО и КДГ проводилось в день забора крови.
В большинстве существующих методик по определению активности КО в качестве субстратов используются или ксантин, или гипоксантин. Но в связи с тем, что сродство этих субстратов по отношению к КО несколько различается, данные исследователей, использующих различные субстраты, при ряде заболеваний также часто не являются однозначными. В связи с этим, при определении активности КО в сыворотке крови здоровых и больных лиц нами использовались параллельно в качестве субстратов как ксантин, так и гипоксантин, а также определялось соотношение (коэффициент) активности энзима при этих двух субстратах:
Больные с подагрическим артритом
Диагностика подагры базировалась, на критериях,, рекомендованных международными симпозимумами по популяционным исследованиям в Риме (1961г.), Нью-Йорке (1966г.) и усовершенствованными работами сотрудни ков Института ревматологии АМН СССР (Бржезовский М.М. идр., 1985).
Под наблюдением находились 34 больных первичной подагрой. Все, больные - мужского пола. Социальный состав больных: служащие - 2\ (61,8%), рабочие - 7 (20,6%) пенсионеры - 6 (17,6%).- Средний возраст больных - 48,4+2,2 (SD 12,8) лет. Средняя продолжительность заболевания (по данным анамнеза) - 8,8+1,33 (SD 7,8) лет. У 21 (61,8%) больных определялась интермиттирующая (рецидивирующая) форма заболевания, у 13 (38,2%) — хроническая. Взаимосвязи между возрастом больных, длительностью и формой заболевания отражены в таблицах 4 и 5.
Как видно из приведенных таблиц, 4 и 5, интермиттирующая форма преобладает (81%) у лиц свыше 40 лет и с продолжительностью не более 1Ф лет (90,5%о). Хроническая форма заболевания также чаще отмечалась у больных в возрасте свыше 40 лет (84,6%), но с длительностью болезни больше 10 лет (69,3%).
Наличие подкожных тофусов выявлено у 14 (41,2%) больных, причем с-наибольшей частотой (84,6%) они встречаются при хронической форме ПА, а при интермиттирующей - лишь в 23,8% случаев. Легкое течение заболевания, характеризующееся редкими (1-2 раза в год) приступами артрита, отсутствием висцеропатий; отмечалось у 12 больных (35,3%), средней тяжести - с более частыми приступами (от 3 до 5 в год), наличием костно-суставных деструкции, множественных тофусов и висцеропатий (в 50%) - выявлено у 22 (64,7%). Подагрический артрит в виде моноартрита отмечался у 7 (20,6%), олигоартрита - у 11 (32,4%) и полиартрита - у 16 (47%) больных. Более подробная характеристика больных с клиническими и параклиническими данными представлена в таблице 6.
Как видно из таблицы 6, у всех больных или в анамнезе, или при обра-щении к врачу отмечались острые приступы болей в суставах конечностей с их припуханием и покраснением. Типичный приступ подагрического артрита с локализацией в плюснефаланговом суставе I пальца отмечался в 52,9% случаев. У 9 (26,5%) больных развились явления вторичного остеоартроза. Подагрическая нефропатия (почечно-каменная болезнь, нефросклероз, пиелит, интерстициальный нефрит) выявлена у 12 (35,3%) больных. У 21 (61,8%) больного выявлены различные рентгенологические изменения суставов и околосуставных тканей. По рентгенологическим данным, I стадия поражения суставов определена у 12 (35 3%) больных, II стадия - у 9 (26,5%).
Практически все больные (30 человек) в амбулаторных условиях до поступления в стационар принимали аллопуринол, антуран и различные нестероидные противовоспалительные препараты.
Под наблюдением находились 89 больных РА, из которых 63 (70,8%) женщин и 26 (29,2%о) мужчин. Средний возраст больных - 48,9 ± 13,2 года (M±SD). Инвалидность по основному заболеванию (РА) установлена у 34 (38,2%) больных. Социальный состав больных данной группы: рабочие - 32 (36%) человек, служащие - 38 (42,7%); учащиеся - 7 (7,9%), частные предприниматели - 7 (7,9%) и домохозяйки — 5 (5,6%) человек. По продолжительности заболевания больные распределились следующим образом: до 5 лет - 5 (5,62%), 6-Ю лет - 44 (49,43%), 11-15 лет - 32 (35,96%), 16-20 лет - 6 (6,74%), свыше 20 лет - 2 (2,25%) человека. Средняя продолжительность РА составила 11,14 ± 2,33 года.
Степень активности патологического процесса определялась в соответствии с диагностическими критериями и рабочей классификацией РА [57,74,259], на основании которых 1-ая (минимальная) степень выявлена у 17 (19,1%), И-ая (умеренная) - у 64 (71,9%) и Ш-я (максимальная) - у 8 (9%) I больных.
Взаимосвязь активности патологического процесса и возраста больных РА представлена в таблице 7 и свидетельствует, что наиболее многочисленной была категория больных в возрасте 31-50 лет (75,28%). Таблица 7 Соотношение возраста больных и активности патологического процесса при РА Возраст (в годах) Степень активности Г(п=17) II (п=64) III (п=8) Всего (п=89) До 20 3 (4,68%) 3 (3,37%) 21-30 1 (5,88%) 5(7,81%) 1 (12,5%) 7 (7,87%) 31-40 6 35,29% 17 (26,56%) 4 (50,00%) 27(30,33%) 41-50 7(41,18%) 30 (46,88%) 3(37,50%) (44,94%) Свыше 50 3(17,65% 9 (14,06%) 12(13,48%) Медленно прогрессирующий характер течения (Mill) патологического процесса отмечен у 56 (62,92%), быстро прогрессирующий (БПТ) — у 33 (37,08%) больных РА. Следует отметить, что БПТ заболевания чаще наблюда- лось при более высоких степенях активности ревматоидного процесса (см. таблицу 8).
Изучение влияния регенерации магнитоуправляемых сорбентов на свойства иммобилизированного фермента
Имеющиеся в настоящий момент литературные данные об изменении активности различных ферментов при взаимодействии со специфическими антителами противоречивы [13, 31, 79, 238]. Поэтому рассмотрение вопросов, связанных с изучением изменения ферментативной активности КО при взаимодействии со специфическими иммуноглобулинами представляет определенный интерес.
Источником специфических иммуноглобулинов служили сыворотки больных РА с заранее определенными высокими титрами антител к КО (экс-тинкция 0,15 е.о.п.). "Чистые" антитела к ферментам получали с помощью соответствующего антигенного иммуносорбента [16], с которым была проведена инкубация сывороток больных при 37С на магнитной мешалке в течение 1 часа, а затем диссоциация комплекса антиген-антитело с помощью ОДМ глицин-HCl буфера, рН=2,5. После соответствующего диализа против ЗФР и последующего концентрирования через полупроницаемую мембрану системы "Sartorius" до первоначального объема сыворотки, антитела к КО использовались в эксперименте по изучению их взаимодействия с соответствующим ферментом: была проведена инкубация антигенного иммуносорбента и растворимой формы фермента с полученными антителами в течение 1 часа при 37С на магнитной мешалке. Затем была определена активность КО. В качестве контроля применяли растворы КО в физиологическом растворе (п=30) и сыворотки практически здоровых людей (п=30).
После взаимодействия КО с соответствующими чистыми антителами было выявлено некоторое повышение активности КО (см. таблицу 11).
Следует отметить, что изменение ферментативной активности КО было различным» при использовании растворимой и иммобилизированной форм фермента. Так, например, активность растворимой формы КО после взаимодействия со специфическими («чистыми») Ат увеличилась.незначительно (р=0,151); различия с контрольной группой (физ. р-р) и донорами статистически не достоверны (р=0,067 и р=0,071, соответственно). Увеличение активности иммобилизированной формы КО по сравнению с исходными значениями произошло в среднем на 25-30% (р=0,047); выявлены статистически достоверные различия с физиологическим раствором (р=0,044) и донорами (р=0,024) (см. таблицу 11).
Включение фермента в пространственную решетку полиакриламидного геля (иммобилизированная форма) придает антигену (КО) новые свойства, благодаря которым он приобретает определенные преимущества перед растворимой формой. Такой метод приводит к возникновению незначительных конфор-мационных изменений, сохраняющих активность фермента, но, в то же время, способствующих, например, экспрессии гидрофобных участков молекулы» энзима, содержащих «скрытые эпитопы». Следует подчеркнуть что, антиферментные Ат, как правило, специфичны не по отношению к активному центру энзима, а по отношению к белку в целом. Если антигенные детерминанты фермента расположены вне его активного центра, то последний и в фермент-антиферментном комплексе может оставаться доступным для субстрата. В случае, когда участки фермента, от которых зависят его антигенные свойства, частично захватывают и область активного центра, антифермент может выступать в качестве ингибитора, конкурирующего с субстратом [21].
После проведения определения количества антител к КО в сыворотке крови больных РА (п=30) имму но ферментным методом гранулы МС подвергались процедуре регенерации по методике, описанной в главе 3. Впоследствии МС повторно использовались для определения специфических антител по вышеописанной методике. Исследование изменения сорбционной ёмкости МС после регенерации не выявило достоверного снижения иммунохимиче-ской активности магнитосорбента (до регенерации сорбционная ёмкость составила 3,44±0,55, после - 3,1+0,46, р 0,05).
Таким образом, МС с иммобилизированной в их структуру КО могут эффективно регенерироваться без потери ими иммунохимических свойств, что позволяет неоднократно использовать данные МС в методах иммуноанализа.
Содержание антител к ксантиноксидазе у больных ( остеоартрозом
Для иллюстрации полученных данных приводим материалы из истории болезни № 18936. Больная О-ва Н.И., 30 лет. Находилась на стационарном лечении в ревматологическом отделении МУЗ «Клиническая больница №25» с 12.09.2005 г. по 30:09.2005 г. Клинический диагноз: Ревматоидный артрит, I степень активности, суставная форма, серонега-тивный вариант, стадия I, ФК-1.
При поступлении в стационар больная предъявляла жалобы на боли в покое и при движениях во П-Ш пястно-фаланговых суставах левой руки, проксимальных межфаланговых, лучезапястных суставах и суставах стоп, скованность в них по утрам в течение 20-30 минут, слабость, снижение работоспособности. Больна с 2000 г., когда впервые появились боли, скованность в суставах кистей, стоп. Поставлен диагноз: ревматоидный артрит. Лечение НПВП (ортофен, напроксен) к значительному улучшению состояния не привело. Продолжали беспокоить боли, отечность суставов. Больной была предложена госпитализация, от которой она отказалась. В октябре 2002 г. лечилась в ревматологическом отделении МУЗ «Клиническая больница №25». Принимала НПВП, плаквенил, трентал, инъекции дипроспана (паравертебрально). Настоящая госпитализация связана с ухудшением состояния в течение последнего месяца.
При поступлении состояние больной относительно удовлетворительное, кожные покровы чистые. Отмечается дефигурация П-Ш правых пястно-фаланговых, проксимальных межфаланговых, лучезапястных суставов и мелких суставов стоп за счет экссудативных явлений. Суставы болезненные при пальпации, кожа над ними гиперемирована. Активные движения в суставах кистей ограничены. В легких перкуторно - легочный звук. Дыхание - везикулярное, хрипов нет. Частота дыхания - 16 в минуту. Границы относительной сердечной тупости: правая - на 1 см кнаружи от правого края грудины, левая - на 1 см кнутри от левой средне-ключичной линии, верхняя - во втором межреберье. Тоны сердца при глушены. Пульс - 72 в минуту, удовлетворительных качеств: АД- 120/70 мм рт.ст. Живот мягкий; безболезненный прш пальпации. Размеры печени. по Курлову в пределах нормы. Симптом Пастернацкого отрицательный с обеих сторон. 3KF от 13.09.05 г. Синусовый;ритм 68 в минуту. Полувертикальное5 положение , ЭОС! Диффузные: изменения в миокарде передне-перегородочнош области; Рентгенография кистей от 14;09Ю5 г.: опреде-ляютсяі явления околосуставного остеопороза;, незначительное; сужение суставных щелей.
Лабораторные показатели при поступлении: эритроциты? — 4,3 х 1012/л, гемоглобин — 127 г/л, лейкоциты — 5,0 х 109/л, эозинофилы - 3vna-лочкоядерные - 6,сегментоядерные — 49, лимфоциты,- 32, моноциты-10, СОЭ- 12 мм/ч; общий белок - 71,0 г/л; мочевина- 4,7 ммоль/л; билирубин общий - 15 4: мкмоль/л; СРБ - 8- мг/л; нейраминовые кислоты -2000 мкмоль/л; серомукоидьг- 0 09 ед; ЦИК - 4,8 ед.; РФ (латекс-тест) 1:8; иммуноглобулины: IgA,- 2,1 г/л, IgG- 12,0 г/л, IglVT- 1,3 г/л; АНФ (+, диффузный тип свечения). Уровень антител к КО 0;-Г14" е.о.п.
Анализ мочи: относительная плотность - 1008, эпителий плоский, лейкоциты - 2-3 в поле зрения.
Проводимое лечение: ортофен (50 мг/сут.), кеналог (40.0 внутрисуставно) № 3, трентал (5.0 внутривенно) № 10. В процессе лечения наблюдалась положительная; динамика клинического: состояния больной. Уменьшились боли- скованность в суставах, увеличился объем движений в них.
Лабораторные- показатели! перед выпиской: из стационара: эритроциты — 4!,5 х 1012/л, гемоглобин - 128 г/л, лейкоциты- 5;9 х 109/л СОЭ- 6 мм/ч; СРБ - 8шг/л;: серому коидьк- 0;08іед; ЦИК - 4;0 ед;;:РФ (латекс-тест)= 1:8; иммуноглобулины: IgA - 2,15 г/л, IgG - 12!,5т/л, IgM:-1,38 г/л; АНФ (+). Уровень антител к КО 0,085 е.о;п.
Таким образом, данный клинический пример демонстрирует соот- . ветствие динамики клинического состояния больной изменениям энзимных и иммунологических показателей (на примере Ат к КО), которые нат ряду с общепринятыми клинико-лабораторными признаками достаточно четко отражают активность.патологического процесса.
![Клинико-диагностическое значение определения антител к фибронектину у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента [Электронный ресурс]](/i/i/4424/196012.png "Клинико-диагностическое значение определения антител к фибронектину у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента [Электронный ресурс] Кочнева Любовь Ивановна")
