Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Ожоговая токсемия и методы её обнаружения . 7
ГЛАВА 2. Регуляция клеточного деления в норме и при ожоговой болезни 24
ГЛАВА 3. Материал и методы исследования 37
ГЛАВА 4. Клеточное деление а эпителии роговицы после ожога кожи 47
ГЛАВА 5. Влияние экстрактов из нормальной и обожженной кожи на клеточное деление в эпителии роговицы :
а/ При введении экстрактов in loco 63
б/ При местном нанесении экстрактов in loco
в/ В переживающей культуре in vitro 78
ГЛАВА 6. Статистический анализ надежности критериев проверки гипотез при выражении пролиферативной способности ткани через митотический индекс 83
IV. Обсуждение результатов 100
V.Выводы.
VI. Литература .
- Регуляция клеточного деления в норме и при ожоговой болезни
- Клеточное деление а эпителии роговицы после ожога кожи
- При введении экстрактов in loco
- В переживающей культуре in vitro
Введение к работе
Травмы в результате несчастных случаев в технически развитых странах заняли в последние годы по данным ВОЗ первое место среди других причин смерти. По данным мировой статистики от 5 до 10% возникающих травм приходится на ожоговые травмы, от которых ежегодно погибает от 60 до 80 тысяч человек.
Особое значение приобретает ожоговая травма в военное время. Если во время второй мировой войны ожоговые поражения составили около 1% всех поражений, то в войнах с применением ядерного оружия пострадает около 60% населения. Все это позволяет считать ожоги и их лечение важной проблемой современной медицины.
Несмотря на большие успехи, достигнутые в лечении отдельных стадий ожоговой болезни, смертность от ожогов снизилась незначительно. Если раньше ожоговые больные погибали в период шока, то в настоящее время основной причиной смерти при ожоговой болезни стали сепсис и пневмония (М.И. Шрайбер и соавт., 1972).
Смерть в период септикотоксемии происходит главным образом не от проникновения патогенной микробной флоры через обожженную поверхность, а от резкого угнетения общей иммунологической реактивности организма при ожоговой травме. При этом состоянии, в обожженном организме приобретает патогенные свойства аутофлора, что имеет большое значение в патогенезе ожоговой болезни.
Причиной угнетения иммунологической реактивности организма является ожоговая токсемия, которая вызывает прямую и косвенную блокаду ретикулоэндотелиальной системы организма.
Успех в изучении ожоговой токсемии, как показывает анализ литературы, в подавляющей степени зависит от целенаправленного применения современных методов исследования. Особенно плодотворным для этой цели оказалось применение методов, основанных на принципах биотестирования. Так, совсем недавно была выявлена биохимическая природа ряда ожоговых токсинов (Stadtler et al.,1971; 1972; Ro-senthal еt al, 1970, 1972;Н.А. Федоров, 1972; Н.А. Федоров и соавт., 1974).
Теоретические изыскания в области общей патологии сегодня могут оказаться плодотворными при обязательном анализе процессов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях организации. х/
Поскольку основным "участником" патологических процессов является клетка, постольку изучение процессов реактивности на клеточном уровне организации позволяет охарактеризовать степень адаптации организма при различных патологических состояниях, в том числе и при ожоговой травме.
Изучение клеточной реактивности важно и для понимания механизмов ожоговой токсемии, Вместе с тем этот вопрос по имеющимся литературным данным крайне слабо исследован, а полученные отдельные результаты дают лишь косвенное представление о состоянии клеточного гомеостаза при ожоговой токсемии. х/Архив патологии (ред.) 1972, № II.
Одной из важнейших характеристик клеточного гомео-стаза является способность клеток к размножению. Размножение клеток путем митоза связано со многими нормальными и патологическими процессами. Изучение митотической активности на основе количественных данных широко используется в биологических и медицинских исследованиях. Этот метод, несмотря на его трудоемкость, позволяет на основе статистической обработки данных дать объективный и точный анализ явления.
В связи с этим мы, по предложению действительного члена АМН СССР профессора Н.А. Федорова, поставили своей целью изучить состояние клеточной реактивности при ожоговой токсемии, в качестве биологического теста была избрана митотическая активность. Кроме того, нами изучалось изменение биологических свойств экстракта кожи после термического ожога её, по показателю клеточного деления.
В последние годы в лаборатории патологической физиологии ЦОЛИПК, под руководством академика АМН СССР Н.А. Федорова, проводится целенаправленное изучение патогенеза термической травмы (И.К. Корякина, 1965; Р.В. Недошивина, 1965; З.Г. Позднякова, 1968; А.А. Белопольский, 1972). Для обнаружения ожоговых токсинов были применены метод гемокультуры с лейкоцитарной пленкой (И.К. Корякина, 1965) и метод биотестирования на мышах с блокадой PЭС (Р.В. Недошивина, 1972). Для выделения ожоговых токсинов были разработаны методы Фракционирования кожи (Б.Е. Мов-шев, 1971), что позволило установить эффективные дозы изучаемых препаратов (Н.А. Федоров, Р.В. Недошивина, Б.Е. Мовшев, 1972; Б.Е. Мовшев, Р.В. Недошивина, 1973).
Помимо выделения и анализа токсинов изучался антигенный состав обожженной кожи и сыворотки (Б.Е. Мовшев, 1970; B.Е. Мовшев, В.И. Аверченко, 1973).
Наша работа является фрагментом проводимых исследований по биологической активности клеток после ожоговой травмы.
Регуляция клеточного деления в норме и при ожоговой болезни
Митотическое деление клеток лежит, как известно, в основе репродукции клеточных элементов, а также физиологической и травматической регенерации.
Митоз, как определенный этап в жизни и развитии клетки, включает и такое важное биологическое явление как деятельность хромосом - носителей генетической информации. Анализ пролиферативных процессов, протекающих в организме, выявление функции механизмов митотической активности, распознавание нарушенных коррелятивных соотношений, все это позволяет глубже проследить степень адаптации организма при различных патологических процессах, в том числе при термической травме.
Морфология и биологическая химия клеточного деления изложена в ряде сводок (Mazia, 1961; Р.Г. Цанев, Г.Г. Марков, 1964; И.А. Алов, 1972). Поскольку эти вопросы лишь косвенно связаны с задачами нашего исследования; мы ограничимся кратким изложением современного состояния проблемы регуляции жизненного цикла клеток, связанной с нашей работой.
В цитологии изучение морфологии и биохимии процессов митоза развивалось весьма успешно. Физиология митоза, напротив, "всегда была заброшенным разделом изучения клеточного деления" (С.Я. Залкинд, И.А. Уткин, 1951).Лишь к 50-тым годам нашего века, в связи с успешным развитием молекулярной биологии, выявлением роли, ДНК и РНК в наследственности и, особенно, благодаря разработке метода радиоавтографии применительно к клеточному делению, началось бурное развитие этой области цитологии (Н.Д. Грачева, 1969; О.И. Епифанова, В.В. Терских, 1969).
Под регуляцией размножения клеток еще сравнительно недавно понималось воздействие непосредственно на митоз. Все процессы, отделявшие одно делению от другого, обозначались собирательным термином интерфаза. В минувшее десятилетие было установлено, что митоз представляет собой конечный этап цикла процессов, объединяемых в настоящее время под названием митотический цикл (МЦ). Последний является, в свою очередь, лишь частью полного жизненного или клеточного цикла, который охватывает также выполнение специфических функций и так называемый период покоя. Таким образом, жизненным циклом клетки называют весь этап существования клетки от ее образования и до собственного деления или до смерти.
Большее значение имело выяснение роли, ДНК и РНК в передаче наследственной информации. Начиная с 1951 года Альма Говард и Стефан Пелк (Howard,Pelc, 1951а, 1951б) показали в серии paбoт, что ДНК синтезируется только в ядрах клеток в интерфазе и этот процесс заканчивается до начала митоза. Они же на основе полученных данных предложили разбивать митотический цикл на четыре периода: М -митоз, G1 - предсинтетический период, S-период синтеза ДНК, G2 -предмитотический период (от английского слова "gар" - интервал).
В основу схемы положены циклы репродукции и функционирования хромосом, как события, наиболее важные в биологическом отношении события. Причины вступления клеток в S -период до настоящего времени не вскрыты, хотя условия для синтеза ДНК имеются на протяжении всего МЦ, о чем свидетельствует так называемый репаративный синтез
ДНК, протекающий не только в S - период, но также и в периодах g1 и g2 (Л.Я. Ломакина, 1973),
В настоящее время большинством исследователей разделяется гипотеза о генной регуляции событий МЦ путем последовательных транскрипций генома и трансляций генетической информации из ядра (Mueller,1965; Вaserga, 1965,1968; О.И. Епифанова, 1967;Prescott, 1968; Paul, 1971 и др.)
При изучении продолжительности МЦ удалась установить, что МЦ клеток ряда тканей может продолжаться месяцы. После тщательного анализа оказались, что не все клетки проходят МЦ, а только часть их. Выяснилось также, что МЦ и жизненный цикл различны, но могут и совпадать. Стаккерс и Тили (Stanners, Tili,1960) для определения доли пролиферирующих клеток предложили применять длительное непрерывное введение в организм Н3- тимидина, а получающейся максимальный индекс меченых клеток был обозначен термином пролиферативный пул (Kisileski et al. 1961).
Введение понятия о пролиферативном пуле логически привело к предположению о существовании фазы, в которой клетки не проходят МЦ, но могут в него вступать. Эта фаза получила название периода покоя (resting) или g0-период (Lajtha,1963,1966; Quastler,1963 и др.). Помимо способности задерживаться в периоде g0 было также замечено, что некоторые клетки могут длительно находиться в периоде g2, не вступая в митоз (Gelfand , 1963, 1966, 1972; Gelfand, Candelas, 1972).
В настоящее время допускается существование в клеточном цикле, по крайней мере, двух периодов покоя. В один из них (период R1) клетки могут переходить после окончания митоза, в другой - после окончания синтеза ДНК (период R2). Как правило, в периоде покоя R1 задерживается примерно в 10 раз больше клеток, чем в периоде покоя R2 (В.В.Терских,1973). Трактовка "пролиферативный пул" в свете вышеизложенный данных, требует серьезного уточнения, поскольку оценки различных авторов, получаемые на одном и том же материале, весьма противоречивы (Г.Д. Туманишвили, 1972). Можно принять таким образом, что периодическое чередование в клеточном цикле периодов активной пролиферации и покоя, поддерживает постоянство состава клеточной популяции и обеспечивает реакцию клеток на изменение окружающих условий.
Существуют две точки зрения на регуляцию клеточного деления. Одни исследователи склонны считать нормальней формой жизнедеятельности клетки состояние покоя, полагая, что лишь стимулирующее воздействие приводит клетку к пролиферации. Другие, напротив, рассматривают жизнедеятельность клетки как "стремление" к неограниченному делению, сдерживаемому наличием ингибиторов. В последнее время роли ингибиторов в регуляции клеточной пролиферации придается все большее значение в связи с увеличением числа фактов, свидетельствующих о существовании тканеспецифиче-ских ингибиторов пролиферации - кейлонов.
Клеточное деление а эпителии роговицы после ожога кожи
Изучение гистофизиологии клеточного деления in vitro в переживающей ткани роговицы было предметом ряда исследований (Buschke et al., 1943; В.И. Григорьева, 1951, 1952; Х.Я. Пужака, 1960; И.А. Уткин, 1961; И.А. Уткин и соавт., 1961, 1962; О.И. Епифанова, 1965). Метод инкубации глаз вне организма (in vitro) проводили по описанию И.А. Уткина и соавторов (1961), наиболее подробно исследовавших данную модель.
Энуклеированные глаза промывали в 0,85% растворе NаСl, забуференном растворам ТРИС - HCl до рН-7,34 от крови и обрывков ткани. Затем глаза переносились в раствор среды 199, сыворотку не добавляли, инкубацию проводили в сосудиках Варбурга при 370С в атмосфере воздуха. Количество среды бралось из такого расчета, чтобы над глазными яблоками был небольшой слой жидкости, с целью лучшего газообмена. Это составляло для сосудика Варбурга 3 мл среды. ЭОК добавляли в дозе, аналогичной той, что использовалась в предыдущих сериях опытов (0,1мг), то есть 0,033 мг/мл. Колхицин вводили в конечной концентрации 1:100000. МИ выражали числом митозов в 100 полях зрения, При постановке опытов у животного энуклеировали оба глаза: левые служили контрольной группой, правые - опытной.
Кроме того, в нашей работе были использованы ещё некоторые не основные статистические методы и критерии.
При изучении влияния экстрактов кожи на клеточное деление в одной из серии опытов для вычисления достоверности были использованы непараметрические критерии для связанных совокупностей: критерии знаков "Z" и "максимум-критерий", методика применения и таблицы пограничных значений использованы из работы К.В. Лашкова и Л.Е. Полякова (1971).
В главе 6, посвященной специальному статистическому исследованию были использованы еще ряд статистических методов и критериев. Описание этих не основных методов приведено в материалах соответствующих серий опытов.
В разделе исследований, посвященных исследованиям процессов пролиферации в эпителии роговицы после термического ожога кожи было поставлено 4 серии опытов на беспородных крысах обоего пола. Вес животных в различных сериях опытов колебался от 80 до 120 г. Всего в опытах просчитано 394 роговицы. Забой животных производился через 2 -7 суток после нанесения травмы. Для этого были следующие причины: по данным сотрудников И.Р.Петрова (1956), А.Д. Тройниковой и Е.Н. Пчелкиной в течение первых суток после ожоговой травмы всасывание с обожженной поверхности замедленно. Аналогичные результаты получены В.Д. Золотаревским и Р.А. Переверзевым (1959), И.Р. Петровым и Н.И. Кочетыговым (1968), Б.Е. Мовшев (1972) установил, что через 48 часов после ожога из кожи обожженных крыс можно выделить максимальное количество белка, что связано с генерализованным нарушением проницаемости. Таким образом, накопление ощутимого количества продуктов ожоговой травмы в крови происходит ко вторым суткам после ожога, это и послужило нам основанием начать исследование процессов пролиферации после воздействия экстремального фактора со вторых суток, поскольку к концу первой недели ожоговой болезни количество микробной флоры становится значительным и она начинает играть немаловажную роль в патогенезе заболевания, мы решили ограничить наше исследование максимально седьмыми сутками после ожога.
Во всех опытах, кроме тех, которые будут указаны специально, нанесение ожогов и забой животных производили в утренние часы (10-12). Контрольных животных фиксировали и выстригали шерсть с поверхности спины. В первой серии опытов забой животных производили на 2,3, 5 и 7 дни опытов. С целью исследования влияния различных раздражителей на, процессы пролиферации у контрольных животных, группа интактных крыс была забита перед началом опытов.
Как видно на рис. 1, у контрольных животных МИ на 2-е сутки опыта резко снижен по сравнению с исходным уровнем митотической активности. В последующие сроки забоев на 3 и 5 дни уровень пролиферации в эпителии роговицы повышается, а затем вновь снижается на 7-ой день.
Этот факт можно объяснись тем, что фиксирование крыс, стрижка шерсти и т.д., все эти манипуляции вызывают угнетение митотической активности вследствие развития "реакции на новизну обстановки". При исчезновении факторов, вызывающих данную реакцию МИ увеличивается и достигает к 5-ому дню своих обычных значений. Новое угнетение МИ на 7-ой день опыта у контрольных животных, по-видимому, связано с уменьшением числа особей в клетке, что приводит к " реактивному" уменьшению числа митозов (И.А. Уткин, Л.П. Косиченко, 1956).Для более полного анализа вопроса по данным опытов был вычислен коэффициент фаз, представляющий собой отношение суммы ранних фаз митоза к сумме поздних фаз:
При введении экстрактов in loco
Целью настоящего исследования было сравнительное изучение действия экстрактов из нормальной и обожженной кожи на клеточное деление в эпителии роговицы in vivo, in loco,in vitro, Всего было поставлено 6 серий опытов, в которых просчитано 595 роговиц.
Так как мыши являются животными с ярко выраженной "реакцией на новизну обстановки", то есть при различных изменениях внешней среды у них быстро развивается "реактивное торможение митозов, то представляло интерес выяснить степень влияния внутривенных инъекции физиологического раствора, в котором растворялись экстракты на МИ. С этой целью был поставлен опыт на 18 мышах.
В качестве контроля служили интактные мыши. Опытным мышам через вену хвоста вводили физиологический раствор (0,85% NаСl) по 0,1 мл. Оказалось, что такого рода манипуляции вызвала через 45 минут снижение МИ до 5,3 ± 0,6,0/00,n=9 при норме 10,3 ± 0,80/00, n = 9 (Р 0,01), Следовательно внутривенное введение физиологического раствора вызывает достоверное угнетение клеточного деления, что согласуется с литературными данными (И.А. Уткин, 1953; И.А. Уткин, Л.П. Косиченко, 1956а, 1956б, 1960). Поэтому в экспериментах с экстрактами в качестве контрольной группы использовались животные, которым аналогичным способом вводили физиологический раствор ПЕРВАЯ СЕРИЯ ОПЫТОВ Влияние экстрактов кожи in vivo на МИ в роговице В первой серии опытов in vivo на беспородных мышах изучалось действие экстрактов ЭНК и ЭОК на отдельные периоды жизненного цикла клеток роговицы. С этой целью в кровь вводились экстракты из нормальной кожи (ЭНК) и из обожженной кожи (ЭОК). Сроки забоев животных соответствовали времени продолжительности отдельных периодов жизненного цикла клеток эпителия роговицы.
Длительность отдельных периодов интерфазы нами не определялись самостоятельно, а были использованы данные литературы (обзор, Л.Д. Лиознер, 1966). Было условно принято, что время продолжительности предсинтетического периода - G1 - 72 часа, периода синтеза ДНК - 12 часов, предмитотического периода G2 - 6 часов. Мы исходили из того, что если экстракт оказывает действие на соответствующий период, то через определенное время соответствующая продолжительность этого периода, количество делящихся клеток изменится. Там как клеточное деление в организме идет асинхронно, то речь идет только о той части клеток, которые в это время проходят соответствующий период жизненного цикла.
Все опыты были поставлены в утренние часы (10-12) с учетом неспецифических факторов, приводящих к реактивному торможению митозов. Контрольным животным вводили физиологический раствор (0,14 М NaCl) по 0,2 мл подкожно. Экстракты ЭНК и ЭОК вводили подкожно по 0,1 мг в объеме 0,2 мл физиологического раствора. Доза белка была выбрана на основании данных Н.А. Федорова, Р.В. Недошивиной и Б.Е. Мовшева (1972),установивших, что введение мышам с блокадой РЭС 0,1 мг ЭОК смертельно, тогда как ЭНК в той же дозе не является токсичным. Мы выражала числом митозов в 100 полях зрения раздельно для каждой зоны роговицы (периферической, промежуточной и центральной). Результаты первой серии опытов В опыте № I забой производили через 72 часа, то есть изучалось влияние экстрактов на вступление клеток в предсинтетический период g1. Оказалось, что введение ЭНК вызвало стимуляцию клеточного деления (табл. 8). МИ увеличился с 29,2 до 41,8 (Р 0,01). Особенно сильное увеличение пролиферации произошло в центральной зоне роговицы с 39,0 до 60,0 (Р 0,01). ЭОК за то же время достоверного изменения клеточного деления не вызвал, следовательно, через 72 часа после инъекции мышам экстрактов из нормальной и обожженной кожи действие их на клеточное деление оказалось различным. ЭНК обладает ростостимулирующим, а ЭОК ростугнетающим действием. В опыте № 2 забой производили через 12 часов после введения экстрактов, в вечернее время, т.е. изучалось действие ЭНК и ЭОК на процесс синтеза ДНК. Оказалось (табл. В), что ЭНК не влияет на данный процесс, а ЭОК вызвал уменьшение числа делящихся клеток с 8,1 до 5,8 (Р 0,05).В центральной зоне роговицы результат близок к достоверному (контродь-5,9 , опыт 2,9; 0,01 Р 0,05). Таким образом, и в этом опыте биологические свойства ЭНК и ЭОК различны: ЭОК оказывает митозингибирующее действие, а ЗНК не влияет на процесс пролиферации. В опыте № 3 изучалось действие ЭНК и ЭОК на период g2. Животных забирали через 6 часов после подкожного введения препаратов. В опыте было установлено, что экстракты ЭНК и ЭОК в испытанной дозе на течение периода g2 не влияют. Подвода итог первой серии опытов можно отметить, что биологическое действие ЭНК и ЭОК оказывать влияние на клеточное деление прямо противоположное. Известно, что период g1 наиболее чувствителен к изменениям внешней среды (В.Г. Цанев, Г.Г. Марков, 1964). Поэтому отсутствие каких-либо существенных изменений МИ при действии на периоды S и g2 можно объяснить малой дозой использованных экстрактов. Причины наибольших изменений процесса пролиферации клеток именно в центральной зоне роговицы не ясны. Не удается связать этот факт с суточным ритмом митозов в отдельных зонах роговицы: в опыте № I митозов во время забоя в центре роговицы, в опыте № 2 - на её периферии. В то время как в обоих опытах наибольшие изменения в клеточном делении отмечены в центре роговицы.
В переживающей культуре in vitro
В данном разделе исследования нами было продолжено изучение "антимитотических" свойств ЭОК в переживающей культуре клеток ткани роговицы in vitro. Метод изучения клеточной кинетики in vitro позволяет проводить оценку собственно клеточной реакции в ответ на действие агента, без влияния других систем организма. Это дает основание, надеется, что сопоставление результатов, полученных после идентичных воздействий на культуре клеток, в целостном организме позволит дифференцированно оценить роль собственно клеточных реакций и регулирующих систем явлений (Дж. Пол, 1963; В.И. Гаврилов, 1965; А.Д. Тимофеевский, 1971). Вместе с тем культура клеток ткани не является частью изучаемой ткани, а есть лишь её модель (аналог), которая имеет иное окружение и иную морфологию (Э. Уилмер, 1963). Кроме того, на модели in vitro можно строго регулировать время воздействия экстракта на пролиферацию клеток, что выгодно отличает данную модель от модели in loco, использованной в II и IY сериях опытов.
Для изучения клеточного деления in vitro нами была использована переживающая ткань, то есть при создании определенных условий, удаленная из организма ткань сохраняла некоторое время способность к клеточному делению.
Нами был использовал метод изучения клеточного деления в эпителии роговицы in vitro, описанный И.А. Уткиным с соавт. (1961). По данным авторов, в течение первого часа инкубации, количество делящихся клеток уменьшается до нуля, а затем начинается новая волна митозов, то есть процесс удаления ткани и перенос её в среду in vitro вызывает задержку клеток в периоде g2.Вместе с тем, уменьшение количества делящихся клеток показывает, что процесс митоза, начатый in vivo, не останавливается, а завершается in vitro. Таким образом, метод пригоден для исследования премитотического периода(g2) и самого процесса митоза.
Данные, полученные во втором разделе экспериментов (Ш и 1У серии опытов), указывают на то, что экстракт из обожженной кожи при местном нанесении на ткань роговицы (in loco) вызывает изменение клеточной пролиферации. Следовательно, действие ЭОК прямое и использование переживающей культуры пригодно для исследования "антимитотического" действия ЭОК.
В пятой серии опытов изучалось влияние ЭОК на изменение скорости процесса митозов. Как уже отмечалось, И.А. Уткиным и соавт. (1961) показано, что в течении первого часа инкубации in vitro происходит только завершение тех митозов, которые были начаты in vivo .Поэтому, перенесение ткани роговицы от организма в среду in vitro, содержащую ЭОК может дать сведения только о действии экстракта на скорость митоза. В опытах было использовано 47 роговиц беспородных мышей. В опыте №I ткань инкубировали 1,5 часа. Установлено, что в роговицах инкубируемых в среде, содержащей ЭОК, количество митозов намного больше (1,90±0,87 0/00), число роговиц - 6), чем в контрольной группе (0,23±0,070/00) число роговиц II, 0,01 Р 0,05. Полученные результаты можно объяснить двояко: либо ЭОК воздействовал на период g2 и вызвал ускорение вступления клеток в митоз либо данный экстракт вызвал торможение скорости митоза. Одновременно с опытом №I был доставлен аналогичный опыт №2, в котором подсчитывалось общее количество митозов, прошедших за время инкубации в контрольном и опытной группах. Для этого в среду был добавлен колхицин. Остановка колхицином митозов на стадии метафазы позволяет определить общее количество митозов за время инкубации, независимо от их скорости. Оказалось, что количество к-митозов в контрольной (МИ кх 11,25±1,74; число роговиц - 9) и опытной Микх 12,20 ±1,28; число роговиц - 10, Р 0,05) группах примерно равное. Следовательно, ЭОК на количество делящихся клеток действия не оказывает, а влияет на скорость митоза. Для подтверждения полученных данных был поставлен опыт № 3 (продолжительность инкубации - 1 час, доза ЭОК прежняя). В данном опыте число митозов в контрольной группе (4,43 ,14; число роговиц - 5) выше, чем в опыте №1. Это связано с более коротким на 1,3 сроком инкубации, то есть число не завершившихся митозов выше. При инкубировании ткани с ЭОК митотический индекс достоверно повышается (7,18 3,92, число роговиц - 5, 0,01 Р 0,05). Следовательно, было получено подтверждение результатов опыта №I. Таким образом, инкубация ткани роговицы с ЭОК вызывает изменение скорости митоза, а именно замедление её. Поэтому в контрольной группе митозы завершаются быстрее, чем в опыте. Этим и объясняется повышение МИ в опытных группах. Как уже отмечалось выше, в переживающей ткани роговицы in vitro через 1-1,5 часа инкубации появляются митозы. Поэтому, если через 1 час от начала инкубации и далее, клетки становятся чувствительными к действию ЭОК, же можно считать, что экстракт оказал влияние на пусковые механизмы митоза. Поскольку in vivo и in loco экстракт из обожженной кожи вызывал подобный эффект, в шестой серии опытов была поставлена цель выявить: действует ли ЭОК на вступление клеток в митоз in vitro. В экспериментах было использовано 60 роговиц мышей. Опыты ставились следующим образом. Через 1-3 часа после начала инкубации в среду добавляли ЭОК и затем инкубировали еще 1 час (примерное время продолжительности митоза). Доза ЭОК прежняя - 0,033 мг/мд. Результаты представлены в таблице № 13.
