Введение к работе
Актуальность темы
Тромбозы развиваются в результате дисбаланса прокоагулянтных, антикоагулянтных и фибринолитических процессов в системе свертывания крови, отражающего сложное взаимодействие между генетическими или приобретенными факторами риска [Segal G.V. и др. 2009; Shakoor H. и др., 2009; Colman R.W. и др., 2006]. Тромбоэмболические осложнения – распространенная медицинская проблема, связанная со значительной заболеваемостью и смертностью [Thakor A.S. и др., 2009; Cohen A.T., 2007; Frutos P.G. и др. 2007].
Для профилактики и лечения тромбозов наряду с антиагрегантами, прямыми фибринолитиками и антагонистами витамина К используют прямые антикоагулянты (АК) [De Caterina R., 2009]. К непосредственно ингибирующим активность тромбина (Т) относят такие полипептиды для парентерального введения как лепирудин, аргатробан, бивалирудин; для перорального введения – дабигатран [Roberts LN 2009; Steffel J, Lscher TF. 2009; Alban S/ 2008]. Ингибиторы активности активированного фактора десять (Ха) - ривароксабан, апиксабан и эдоксабан - используют per os [. и др. 2008; . 2008]. Препараты для парентерального введения на основе гликозаминогликанов ингибируют активность тромбина и фактора Ха активируя антитромбин (АТ) или другие серпины [Castaon M.M. и др, 2007; Hernndez-Espinosa D. И др., 2007; Qiu X и др., 2006; Richard B. И др., 2006; Gomez K. И др., 2005; Raman R. И др., 2005; . И др., 2004]. К ним относят нативные нефракционированные гепарины (НФГ) со средней молекулярной массой (ММ) 15 кДа (получают из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней), сулодексид (выделяют из слизистой оболочки кишечника свиней; содержит 80% НФГ и 20% сульфата дерматана), полусинтетические низкомолекулярные гепарины (НМГ) с ММ 4-7 кДа и отношением активностей против фактора Ха и тромбина (aХa/аIIа) от 1,5 до 4,5 [Atkinson HM и др, 2009; Raju NC и др., 2009; Heerspink HL и др, 2008; . и др. 2008; Eikelboom J.W. и др. 2002], а также синтетические пентасахариды ингибирующие активность только фактора Ха с помощью АТ - фондапаринукс (арикстра) и идрапаринукс - [De Caterina R. 2009; Steffel J и др., 2009].
Актуальность выбранной темы связанна с тем, что:
1. Используемые в настоящее время АК прямого действия не удовлетворяют полностью потребности практической медицины; при несомненной эффективности у НФГ, НМГ, синтетических олигосахаридов есть недостатки (зависимость от АТ , невозможность ингибировать активность Т связанного со сгустком и пр.) [Segal G.V. и др. 2009; Shakoor H. и др., 2009; . и др., 2008]; прямые ингибиторы тромбина и фактора Ха действуют непродолжительно и не имеют антидотов [De Caterina R., 2009; McCullough P.A. и др., 2004].
2. В Российской Федерации отсутствует собственное производство для наработки субстанций нефракционированных гепаринов.
3. В Российской Федерации есть существенная сырьвая база полисахаридов растительного и животного присхождения для получения новых соединений с антикоагулянтной активностью.
Цель и задачи работы
Цель исследования. Анализ структуры и антикоагулянтной (АК) активности натуральных и химически модифицированных полисахаридов растительного/животного происхождения и синтетических фукозилированных олигосахаридов, выявление потенциальных антикоагулянтов прямого действия.
Для достижения этой цели последовательно решали следующие задачи:
Выявление связи между антикоагулянтной активностью и молекулярной массой, степенью сульфатирования, степенью замещения, моносахаридного состава 290 нативных и полусинтетических сульфатов полисахаридов и 5 синтетических фукозилированных олигосахаридов.
Определение механизма антикоагулянтного действия сульфатированных хитозанов с молекулярной массой 65 – 123 кДа и количеством серы 11,1-15,4 %.
Сравнение способов определений антитромбиновой активности сульфатированных хитозанов с молекулярной массой 20 – 123 кДа (количество серы 8,8 – 16,9%) в системах in vitro и ex vivo.
Выбор в результате анализа связи между АК активностью и молекулярной массой оптимальных способов деполимеризации НФГ или сульфатов хитозана для получения образцов с отношением активностей аХа /aIIa в диапазоне 1,5 – 3,0.
Сравнение специфических антикоагулянтных активностей (aIIa и аХа) натуральных и химически модифицированных сульфатированных полисахаридов (СП) растительного происхождения (фукоиданы, сульфаты галактоманнана, целлюлозы, пектина, крахмала).
Определение фармакодинамических параметров наиболее перспективных образцов НМГ, сульфатов хитозана, фукоиданов, сульфата галактоманнана при введениях экспериментальным животным.
Сравнение антитромботической и геморрагической активностей наиболее перспективных образцов НМГ, фукоиданов, сульфатов хитозана и галактоманнана, с используемыми в клинической практике нефракционированными и низкомолекулярными гепаринами.
Разработка метода выбора поликатионов для нейтрализации антикоагулянтной активности и количественного определения сульфатированных полисахаридов в биологических жидкостях.
Выявление наиболее активного прямого ингибитора тромбина среди синтетических производных пептидов (Z-Аla-Ala-Arg-Рip* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip* TFA).
Оценка возможности применения комбинации экспериментального концентрата антитромбина человека с нефракционированным гепарином и пара-аминобензойной кислоты в качестве антитромботических средств на модели венозного стаза у крыс.
Основные положения, выносимые на защиту
Исследованные СП растительного, животного и синтетического происхождения ингибируют фибриногенсвертывающую и амидолитическую активности тромбина и фактора Ха при участии плазменного ингибитора сериновых протеаз – антитромбина.
АК активность исследованных СП растительного, животного и синтетического происхождения зависит от молекулярной массы, степени сульфатирования, введения монофосфатных, ацетатных, карбоксиметильных, амидоэтильных групп.
Сульфат протамина нейтрализует амидолитическую и фибриногенсвертывающую антитромбиновую (aIIa) и анти-фактор Ха (аХа) активности НМГ с молекулярной массой (ММ) 4,7 и 7,0 кДа, СХ с ММ 9,0 кДа, фукоиданов из F. evanescens и L. cichorioides в гравиметрических отношениях антидот/антикоагулянт от 0,5 до 1,5. Хитозаны с ММ 16 кДа (степень дезацетилирования - СД 91%) и 21 кДа (СД 61%) нейтрализуют антитромбиновую активность НФГ 15 кДа, НМГ с ММ 4,7 кДа и сульфата хитозана (СХ) с ММ 9,0 кДа.
Фармакодинамические (ФД) параметры НМГ с ММ 4,7; 5,4 и 6,8 кДа при подкожном введении кроликам сопоставимы с ФД параметрами фраксипарина. Внутривенное введение крысам и кроликам смеси СХ (ММ 75 кДа, степень сульфатирования - СС 1,25) и НФГ в весовом соотношении 1:1, фукоиданов из водорослей F. evanescens и L. cichorioides, сульфатированного галактоманнана (СГМ, ММ 127 кДа, СС – 1,46) приводит к возрастанию АК активности плазмы и длительности действия с увеличением дозы.
НМГ с ММ 4,7; 5,4 и 6,8 кДа в одинаковой степени и также эффективно, как и фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс; геморрагическая активность НМГ с ММ 4,7; 5,4 кДа и фраксипарина одинакова. Антитромботическое действие СХ с ММ 75 кДа (СС 1,25) и фукоидана из F. evanescens сопоставимо с действием НФГ при в/в введении крысам, но геморрагический эффект ниже. 100% противотромботический эффект сульфатированного галактоманнана (ММ 127 кДа) достигается в 2 раза меньшей дозой, чем фукоиданом из водоросли F. evanescens.
Экспериментальный концентрат АТ человека (56 – 100 ЕД/кг) в сочетании с НФГ (30-50 ЕД/кг) и пара-аминобензойная кислота (0,5; 1,5 и 3,0 мг/кг) предотваращает развитие тромбоза на модели венозного стаза у крыс при внутривенном введении.
Синтетические пептиды Z-Аla-Ala-Arg-Рip* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip* TFA ингибируют активность тромбина; при внутривенном введении Fta-Gly-Arg-Pip* TFA крысам антикоагулянтная активность плазмы возрастает с увеличением дозы.
С помощью биоспецифичного электрофореза в геле агарозы можно фиксировать комплексы между СП растительного, животного, синтетического происхождения и поликатионами (сульфат протамина и хитозаны с ММ 6-21 кДа и СД – 61-93%).); размеры пиков преципитации зависят от ММ, степени сульфатирования и АК активности сульфатов полисахаридов.
Научная новизна и теоретическое значение
Проведены широкомасштабные сравнительные исследования специфической антикоагуляной активности 290 нативных и модифицированных сульфатов полисахаридов, выделенных из растительного материала или тканей млекопитающих и членистоногих. Получены новые сведения о зависимости структура – антикоагулянтное действие для низкомолекулярных гепаринов, фукоиданов из бурых водорослей, сульфатов хитозана, целлюлозы, галактоманнанов, крахмала и пектинов.
Осуществлен комплексный анализ по выявлению низкомолекулярных гепаринов с антитромботической активностью, полученных посредством целенаправленных изменений макромолекул нефракционированных гепаринов хитинолитическим, целлюлолитическим, протеолитическим ферментными комплексами, а также лизоцимом, папаином и химотрипсином, никогда ранее для этой цели не использовавшимися.
Установлены особенности как механизма реализации ингибирования активности тромбина и фактора Ха, так и образования комплексов между поликатионами и сульфатированными полисахаридами, с последующим выбором антидота для нейтрализации антикоагулянтной активности.
Разработаны и апробированы методологические аспекты детализации молекулярных механизмов антикоагулянтного действия фукоиданов из бурых водорослей, сульфатов целлюлозы и галактоманнанов из травянистых и древовидных растений, сульфатов картофельного крахмала, сульфатов пектинов из травянистых растений, синтетических олигосахаридов фукоиданового типа и синтетических производных пептидов, с выявлением наиболее активных соединений и анализом фармакодинамических параметров, антитромботической и геморрагической активностей, в сравнении с используемыми в клинической практике антикоагулянтами прямого действия. Экспериментально обоснована возможность конструирования новых лекарственных препаратов для профилактики и лечения тромбозов на основе исследованных соединений.
Разработан алгоритм адекватной оценки специфической антитромбиновой активности сульфатированных хитозанов. В результате анализа связи между молекулярной массой и антикоагулянтной активностью, с помощью направленных модификаций получены низкомолекулярные сульфаты хитозана с высокой ингибиторной активностью по отношению к активированному фактору десять (Х).
Создана композиция, состоящая из нефракционированного гепарина и экспериментального концентрата антитромбина человека. Эта композиция и пара-аминобензойная кислота демонстрируют антитромботическую активность на модели венозного стаза у крыс.
Практическое значение работы
Разработаны методические указания по изучению антикоагулянтной активности фармакологических веществ и включены в Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Москва, 2000).
Разработан метод выбора антидота для нейтрализации антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов на основе фиксирования комплексов между антикоагулянтами и поликатионами (патент на изобретение РФ “Способ обнаружения комплексов между гепаринами и поликатионами" № 2370271).
Ресурсная обеспеченность и патентная защищенность (6 патентов, 4 положительных решения по заявкам) являются предпосылками для получения антитромботических лекарственных средств на основе нативных и полусинтетических сульфатированных полисахаридов растительного и животного происхождения, синтетических фукозилированных олигосахаридов и производных пептидов, а также композиции экспериментального концентрата антитромбина человека и нефракционированного гепарина и пара-аминобензойной кислоты.
Рекомендованы для дальнейшей разработки активные соединения – для парентерального введения: низкомолекулярный гепарин с ММ 6,8 кДа ; низкомолекулярный гепарин с ММ 5,4 кДа ; механическая смесь сульфата хитозана (ММ 75 кДа;СС 1,26) и нефракционированного гепарина (в весовом соотношении 1:1); фукоидан (ММ 20-40 кДа) из водоросли Fucus evanescens; сульфатированный галактоманнан (ММ 127 кДа;СС 1.46); для введения per os: пара-аминобензойная кислота.
Практическое внедрение результатов исследований
На основе патента на изобретение “Способ определения активности антитромбина” № 2195673 фирмой “Технология-Стандарт” производится набор для определения активности антитромбина в плазме.
На основе патента на изобретение “Способ получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови” № 2221578 в лаборатории стандартизации методов контроля препаратов плазмы ГНЦ РАМН созданы (производятся НПО “Ренам”) наборы для определения способности гепаринов ингибировать фибриногенсвертывающую и амидолитическую активности фактора Ха.
Публикации результатов исследования. Основные положения и результаты отражены в 48 публикациях; из 40 статей 2 опубликованы в зарубежных журналах, 4 представлены главами в книгах, 16 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов докторских диссертаций. По теме диссертации получено 6 патентов.
Связь работы с научной тематикой организации. Работа выполнена в рамках НИР ГНЦ РАМН (номера государственной регистрации НИР: 01200501366, 2005-2009 г.г. “Разработка новых средств для профилактики тромбозов и остановки кровотечений” и 01200001744, 2004-2005 г.г. “Разработка новых средств диагностики и лечения тромбозов и ДВС-синдрома”).
Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно определяла направление исследований, осуществляла поиск перспективных, с точки зрения антикоагулянтной активности, органических соединений разной структуры и осуществляла контакты с предполагаемыми соавторами – химиками. А также, планировала ход экспериментов, самостоятельно получала результаты ко всем главам диссертации, анализировала результаты и формулировала выводы.
Апробация работы Основные результаты и положения предлагаемой работы за период с 1995 по 2004 г.г. были представлены на 20 Всесоюзных/Всероссийских и 12 Международных съездах, конгрессах, симпозиумах, конференциях; за последние 5 лет : 30, 33 Конгрессы Федерации Европейских биохимических обществ: Будапешт (2005), Афины (2008); Вторая Европейская школа по биореологии, Варна (Болгария), 2006; 14 Конференция Европейского общества по клинической гемореологии и микроциркуляции, Дрезден, 2007; II Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, 2005, Москва; Первая международная научно-практическая конференция «Биологические и медицинские технологии: от научных результатов - к инновационным разработкам» 2005, Москва; Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины, 2005, Киров; Международная конференция "Гемореология в макро- и микроциркуляции", Ярославль, 2005; II Всероссийская конференция Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова, Ярославль 2005; Вторая Международная научно – практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России», Пущино (Московская область), 2005; Третья Международная Научно-практическая Конференция МЕДБИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине», Москва 2006; III съезд фармакологов России Фармакология –практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; 3 Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", 2007, Москва; III съезд фармакологов России Фармакология –практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; V Всероссийская конференция-школа «Химия и технология растительных веществ», Уфа 2008; "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов" Новосибирск 2008; Всероссийская конференция с международным участием "Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению" Москва 2008; IV Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва 2009; XII научно-практическая конференция “Химия – XXI век: новые технологии, новые продукты”, Кемерово, 2009; VII Всероссийская научная конференция “Химия и медицина” Орхимед-2009, Уфа; Конференция “Химическая биология – фундаментальные проблемы бионанотехнологии”, Новосибирск, 2009.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, а также 7 глав собственных результатов, заключения, выводов, рекомендаций, списка литературы и приложения (450 страниц); число рисунков 123, таблиц 114. Список цитированной литературы включает 788 наименований, в том числе 62 работы на русском и 726 – на иностранных языках.
