Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Регуляция системы свертывания крови антикоагулянтами прямого действия 24
1.1. Влияние гликозаминогликанов на активность серпинов 26
1.2. Связь между структурой сульфатированных полисахаридов и антикоагулянтной активностью 36
1.3. Использование концентрата антитромбина для лечения тромботических состояний 79
1.4. Прямые ингибиторы тромбина 81
Глава II. Материалы и методы .87
Собственные исследования
Глава III. Исследование антикоагулянтной активности сульфатов хитозана 107
3.1. Влияние нефракционированных сульфатов хитозана с молекулярной массой (ММ) 20-123 кДа и количеством серы 8,8-16,9% на свертывающую систему крови in vitro и ex vivo 107
3.2. Связь между молекулярной массой, степенью сульфатирования, введением карбоксиметильных групп и антикоагулянтной активностью сульфатов хитозана 122
3.3. Комплексы сульфатов хитозана с ММ 9-56 кДа с поликатинами 150
3.4. Нейтрализация хитозанами с ММ 16 к Да и 21 кДа ингибирования антикоагулянтами амидолитическои активности тромбина и фактора Ха 156
ГЛАВА IV. Влияние гепаринов с молекулярной массой 1,6-9,0 кДа на свертывание крови in vitro и in vivo 160
4.1. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных гидролизом нефракционированного гепарина (НФГ) протеолитическим ферментным комплексом препарата Протеаза С 161
4.2. Фармакодинамические параметры низкомолекулярного гепарина с ММ 5,4 кДа (НМГ- 5,4), полученного с помощью гидролиза НФГ-4 ферментным комплексом Протеаза С 163
4.3. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов полученных деполимеризацией нефракционированных гепаринов хитинолитическим ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii иммобилизованным на силохроме 167
4.4. Сравнение эффективности определений активности НМГ против активированного фактора X с помощью наборов "РеаХром-гепарин" (НПО "Ренам") и Berichrom heparin (Dade Behring) 173
4.5. Фармакодинамические параметры НМГ с ММ 4,7 кДа (НМГ- 4,7), полученного с помощью гидролиза НФГ (Московский эндокринный завод) ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii 177
4.6. Влияние низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролиза НФГ ферментными комплексами Streptomycess kurssanovii (НМГ-4,7) и Протеаза С (НМГ-5,4) на развитие экспериментального тромбоза у крыс и геморрагическую активность
4.7. Антикоагулянтная активность образцов НМГ, полученных деполимеризацией НФГ гидролазами
4.8. Влияние НМГ, полученных деполимеризацией НФГ лизоцимом на свертывание крови in vitro и in vivo
4.9. Влияние НМГ с ММ 7,0 кДа [НМГ-7,0; получен гидролизом НФГ-4) лизоцимом] на свертывание плазмы кроликов при подкожном введении
4.10. Электрофорез комплексов НМГ - поликатион 193
4.11. Нейтрализация антикоагулянтной активности образцов НМГ 196
ГЛАВА V. Влияние натуральных и химически модифицированных сульфатированных полисахаридов из морских водорослей на свертывание крови in vitro и in vivo 199
5.1. Антикоагулянтная активность сульфата альгината и наноструктур на его основе 199
5.2. Связь между молекулярной массой фукоиданов из водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides и ингибированием активности тромбина/фактора Ха 201
5.3. Влияние фукоидана из Fucus evanescens на агрегацию тромбоцитов человека in vitro 206
5.4. Нейтрализация антитромбиновой активности фукоиданов in vitro 207
5.5. Влияние на величину антикоагулянтной активности плазмы при внутривенном введении фукоиданов из водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides экспериментальным животным 208
5.6 Влияние внутривенного введения фукоидана из водоросли Fucus evanescens на активность в плазме кроликов ротеина С и плазминогена 212
5.7. Противотромботическая и геморрагическая активности фукоидана из водоросли Fucus evanescens 213
5.8. Влияние моносахаридного состава фукоиданов из бурых морских водорослей на антикоагулянтную активность и подвижность комплексов с сульфатом протамина 216
5.9. Ингибирование активности тромбина и фактора Хагидролизованными и выделенными хроматографически фракциями фукоиданов из водоросли Laminaria saccharina 221
ГЛАВА VI. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов из травянистых и древовидных растений 227
6.1. Ингибирование низкомолекулярными фракциями сульфатированного галактоманнана из семян Cyamopsis Tetragonoloba активности тромбина и активированного фактора Ха 227
6.2. Сравнение антикоагулянтной активности галактоманнов из растений семейства бобовых 231
6.3. Влияние внутривенного введения сульфатированного галактоманнана на антикоагулянтную и антитромботическую активность плазмы крыс 233
6.4. Антикогулянтная активность химически модифицированных галактоманнанов 236
6.5. Ингибирование наноструктурами на основе галактоманнанов активности тромбина и фактора Ха 238
6.6. Антикоагулянтная активность in vitro сульфатированного арабиногалактана из древесины лиственницы 242
ГЛАВА VII. Влияние производных целлюлозы, крахмала, пектина и цианидинов на свертывание плазмы крови человека in vitro 244
7.1. Антикоагулянтная активность химически модифицированных образцов целлюлозы 244
7.2. Антикоагулянтная активность сульфатированной целлюлозы выделенной из древесины осины и соломы пшеницы 255
7.3. Влияние степени сульфатирования на антикоагулянтную активность крахмала 260
7.4. Антикоагулянтная активность сульфатов. пектина из травянистых растений 264
7.5. Антикоагулянтная активность цианидинов коры березы, ели, сосны, лиственницы, кедра 267
ГЛАВА VIII. Ингибирование активности тромбина и фактора Ха синтетическими гомофукозными олигосахаридами и производными пептидов 271
8.1. Связь между структурой и антикоагулянтной активностью синтетических гомофукозных олигосахаридов 271
8.2. Антикоагулянтная активность оригинальных синтетических производных пептидов 277
ГЛАВА IX. Антитромботическая активность экспериментального концентрата антитромбина человека и пара-аминобензойной кислоты 285
9.1. Антитромботическая активность смеси из раствора концентрата антитромбина человека и нефракционированного гепарина (Bauer) 285
9.2. Антитромботическая активность смеси лиофильно высушенного концентрата антитромбина человека и нефракционированного гепарина (Bauer или ОАО "Белмедпрепарат") 287
9.3. Антитромботическая активность пара-аминобензойной кислоты 293
Заключение 302
Выводы 346
Рекомендации для внедрения в практику и науку 349
Список литературы 350
Приложение 438
- Связь между структурой сульфатированных полисахаридов и антикоагулянтной активностью
- Связь между молекулярной массой, степенью сульфатирования, введением карбоксиметильных групп и антикоагулянтной активностью сульфатов хитозана
- Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов полученных деполимеризацией нефракционированных гепаринов хитинолитическим ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii иммобилизованным на силохроме
- Влияние на величину антикоагулянтной активности плазмы при внутривенном введении фукоиданов из водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides экспериментальным животным
Связь между структурой сульфатированных полисахаридов и антикоагулянтной активностью
Для предотвращения экспериментальных тромбозов у животных, для профилактики и лечения тромбофилических состояний у людей (инфаркты, венозные тромбозы, инсульты и др.), в настоящее время широко используют сульфатированные полисахариды (СП) растительного и животного происхождения, а также их полу синтетические и синтетические аналоги. Наличие полисахаридов в тканях животных, растений, микроорганизмов, грибов, их низкая токсичность позволяют рассматривать данный класс биополимеров как перспективный для разработки АК средств [36,50,162,166,195,198,242,283,325, 356,359,434,435,455,456,459,461,559,631,634,652,692,698,716,726,729,732,783]. Многообразие биологических активностей СП объясняет их способность неспецифически связываться с белками. Как отрицательно заряженные макромолекулы, СП могут взаимодействовать с любым положительно заряженным участком на поверхности белка. С другой стороны, известны высокоспецифические реакции СП: пентасахаридная последовательность НФГ обеспечивающая связь с AT; взаимодействие СДР морских беспозвоночных с ГК; участие фуканов оболочки яйца морского ежа в специфических реакциях при оплодотворении [195,205,304,336,402,554,556,650,709,786].
Внеклеточная среда в значительной степени составлена из полисахарид-ных комплексов, которые ранее считали инертными веществами [584]. Развитие инструментальной и методологической баз исследований позволило обнаружить значимость биологических ролей полисахаридных комплексов, которые связываются с разными белками и сигнальными молекулами в клетках и модулируют их активность. Полисахаридные комплексы присутствуют на поверхности и во внеклеточной среде клеток эукариот [149,584]. СП играют важные роли в многочисленных физиологических и патологических процессах роста и развития [138,343,430,500,552], ангиогенеза и рака [156,441,616,719], патогенетических процессах с участием микроорганизмов [76,255,256,442,694].
Гликозаминогликагны (ГАГ) - длинные молекулы полисахаридов без ветвей, содержащие повторяющиеся дисахаридные единицы [694]. Дисахаридные единицы содержат один из двух модифицированных Сахаров: N-ацетилгалак-тозамин или N-ацелитглюкозамин и уроновые кислоты такие, как глюкуронат или идуронат [546,778]. Конформация ГАГ придает высокую вязкость водным растворам [76,442], структурная жесткость - целостность клеткам и межклеточному пространству [617,696]. Многообразие последовательностей ГАГ -результат биосинтеза, который включает ткань-специфичные изоформы ферментов [434,617,662]. Различия в сульфатировании ГАГ отражаются на процессах оплодотворения, развития, дифференцирования, воспаления, коагуляции [69,216,248,339,340,350,441,500,718]. Химическая гетерогенность ГАГ приводит к связыванию с рядом белков [235,256,343,375,430,441, 442, 552, 663, 694, 696,697]. К физиологически значимым ГАГ относят гиалуроновую кислоту (ГК), НФГ, сульфаты гепарана (СГ), дерматана (СДР), хондроитина (СХД), кератана [663,723].
История гепарина началась в 1916 г., когда 26-летний студент медик Jay McLean и его наставник William Howell (профессор физиологии Университета Джона Хопкинса) объявили, что обнаружили "антитромбин" [490]. В 1928 г. Charles Best (Toronto, Canada) организовывал команду химиков, физиологов и хирургов для исследования свойств гепарина. Ученые группы определили, какие ткани животных являются лучшим источником гепарина, выполнили очистку, идентификацию и оценили фармакологические свойства in vitro. В 1941 г. провели первые испытания ГАГ, который назвали гепарином, на пациентах. С введением новых лабораторных тестов контроля за 1960 — 1970 г.г. отработали дозировки.
НФГ выделяют из слизистой оболочки кишечника свиней или легких крупного рогатого скота [195] и применяют для лечения и профилактики тромбозов. Молекулы НФГ полидисперсны, линейны, в среднем содержат 5 остатков серной кислоты на 4 моносахаридных звена, причем в отличие от других ГАГ наряду с гидроксильными группами при С6 аминосахара и С2 уроновых кислот в гепарине сульфированы аминогруппы [281,392,434]; состоит из повторений p-D-глкопиранозидуроновой или a-L-идопиранозидуроновой кислот (1 4) связанных с N-ацетилом или D-глкжозамином N-сульфо. Глюкозамин и остатки уроновой кислоты могут быть частично замещены отрицательно заряженными О-сульфо (сульфат) и N-сульфо (аминосульфат) группами [122]. Внутри полимерной цепи молекулы НФГ возможны структурные вариации, такие, как разная степень сульфатиро-вания, примерно 10 % аминогрупп гепарина находятся в свободной форме, N-ацетилирование и С-5 эпимеризация в остатке уроновой кислоты [392]. Содержание серы в НФГ составляет 9,5- 11,5 %, а молекулярная масса (ММ) изменяется в пределах от 3 до 40 кДа, АК активность зависит от степени суль-фатирования и ММ.
Механизм активации AT гепарином подробно описан в обзоре [213]. Существуют два разных механизма ингибирования фактора Ха и Т (Па) антитромбином, активированным НФГ. В результате взаимодействия специфической пентасахаридной последовательности Н5 в НФГ с пентасахарид связывающим участком в петле реактивного центра (RCL) образуется АТ-НФГ комплекс. Это приводит к значительным конформационным изменениям в реактивном центре антитромбина, происходит «выталкивание» петли реактивного центра (RCL), и образовавшаяся структура лучше распознается фактором Ха, что в свою очередь приводит к ускорению расщепления связи в реактивном центре и образованию ковалентного ингибирующего комплекса (Рис. 1.2.1.1.). Таким образом, для существенного ускорения ингибирования фактора Ха необходима конформационная активация AT, при этом ингибиро-вание Т, напротив, ускоряется лишь в 2 раза. Локальное связывание AT с участком Н5 цепи НФГ сопровождается связыванием Т с этой же цепью, но на неспецифическом участке за счет отрицательных зарядов, доступных на молекуле НФГ. В результате образуется тройной АТ-Г-Т комплекс. Т, перемещаясь вдоль полианионной цепи, наталкивается на ингибитор, что приводит к ускорению (- 2000 раз) процесса ингибирования в физиологических условиях. Для одновременного удерживания Т и AT, приводящего к ускорению ингибирования, необходимо, чтобы цепь НФГ состояла не менее чем из 18 остатков [681,743].
Связь между молекулярной массой, степенью сульфатирования, введением карбоксиметильных групп и антикоагулянтной активностью сульфатов хитозана
ГАГ - НФГ, НМГ, сульфаты гепарана, дерматана, хондроитина, хито-зан активируют серпины [13,223,310,349,561]. Способность СХ Г 16 (ММ 75 кДа, сера - 13,7 %, alia in vitro - 35 ЕД/мг, in vivo - 13 ЕД/мг) связываться в комплекс с AT демонстрировали с помощью гель-фильтрации. Молекулярная масса СХ Г-16, определенная этим методом, составила 52 кДа, a MM AT - 79 кДа. Молекулярная масса AT по литературным данным - 58 кДа [561]. Вес комплексов, определенный по калибровочной кривой - 126 кДа (Vc = 74, Vo = 67). Максимум оптической плотности при длине волны на белок 280 нм — 0,205, а при длине волны 504 нм на ГАГ - 0,052. Номера фракций при этом совпадали (73 - 83). Расчет показал, что комплексообразование происходит при эквимолярном соотношении составляющих: 4,89-10" М для AT и 5,10-10" 6М для СХ Г-16, что совпадает с литературными данными [683].
На образце сульфата хитозана СХ Г 16 (ММ 75 кДа, сера - 13,7 %, alia in vitro — 35 ЕД/мг, in vivo - 13 ЕД/мг) изучали механизм АК действия. С увеличением концентрации СХ Г 16 от 1,11 до 25,7 мкг/мл время свертывания плазмы в тесте АЧТВ удлинялось; тест позволяет оценить влияние исследуемого вещества на внутренний путь каскада сериновых протеаз свертывающей системы крови [661]. Влияние на внешний путь свертывающей системы крови оценивали в тесте ПВ. Ингибирующая активность СХ Г 16 в диапазоне концентраций 7,4 -19,3 мг/мл была в 40 раз меньше, чем у НФГ и составила 2 ЕД/мг. Показано, что СХ Г 16 в концентрации 0,2 ЕД/мг катализировал инактивацию свертывающей активности плазмы плазменными ингибиторами с константой ингибирования псевдо-первого порядка 0,24 мин-1 [13]. В присутствии НФГ в концентрации 0,08 ЕД/мл константа ингибирования свертывающей активности плазмы плазменными ингибиторами составила 0,22 мин-1.
Константы ингибирования псевдо-первого порядка свертывающей активности тромбина антитромбином в присутствии НФГ (0,03 ЕД/мл) или СХ Г 16 (0,032 ЕД/мл) были сопоставимы и равнялись 0,43 мин"1 и 0,46 мин"1, соответственно. Следовательно, СХ Г 16 обладал alia активностью 50-55 ЕД/мг. Далее, для исследования потребовалось выделить и очистить кофактор II гепарина [103] из плазмы человека. Чистоту и гомогенность выделенного белка контролировали с помощью вертикального электрофореза в поли-акриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия, его молекулярная масса составила 65 кДа. Константы ингибирования свертывающей активности тромбина ГКII в присутствии НФГ (2 ЕД/мл) или СХ Г 16 (2 ЕД/мл) составили 0,31 мин"1 и 0,28 мин"1, соответственно.
Влияние СХ Г 16 на кинетику взаимодействия между Т и синтетическим хромогенным субстратом в присутствии AT изучали по изменению скорости реакции при высвобождении р-нитроанилида. В зависимости от концентрации субстрата менялась скорость реакции, которую рассчитывали
Для определения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции строили график Лайнуивера-Берка в обратных координатах концентрации субстрата и скорости реакции. Анализ полученных данных демонстрировал торможение скорости реакции между Т и синтетическим субстратом в присутствии AT, при добавлении НФГ (0,001 ЕД/мл) или СХ Г 16 (0,3 ЕД/мл). Для достижения равного с НФГ эффекта СХ требовалось в три раза больше, при любой концентрации субстрата [12].
Исследовали способность образцов СХ ( №3, №9, №12) с разной степенью полимеризации №3-156, №9-275, №12-245 и разной СС №3-1,23, №9-1,25, №12-1,66 влиять на кинетику взаимодействия между AT и Т. Для анализа отобрали СХ с практически одинаковыми alia активностями полученными в системе in vitro (для №3-27 ЕД/мг, №9-35 ЕД/мг, №12-37 ЕД/мг) и разными по ФД кривым in vivo (для №3-13 ЕД/мг, №9-12 ЕД/мг, №12-52 ЕД/мг).
Влияние концентрации СХ на скорость взаимодействия между AT и Т показано на двойном логарифмическом графике к2 против концентрации (рис. З.1.4.2.1.). Максимумы констант второго порядка реакции между Т и AT для образцов с меньшей alia активностью (№3 и №9) составили 1,1-109М мин 1 и достигались при концентрации 1,3 цМ. Более активный образец №12 имел максимум кривой констант реакции второго порядка выше (2,2Т09 М" мин 1), при меньшей концентрации (0,200 иМ). Гепарин проявлял максимальную каталитическую активность (2,3-109 М мин"1) при концентрации 0,024 иМ. Анализ данных взаимодействия AT - Т (рис. 3.1.4.2.2. и 3.1.4.2.3.) позволил вычислить Ка, Кр и к. Полученные к взаимодействия АТ-Т в присутствии №3 и №9 составили 320 М и 309 М" , для №12 - 295 М"1 и 305 М, соответственно, и в присутствии гепарина 275 М" и 300 М"1, соответственно.
Константы диссоциации с Т для образцов СХ (№3 и №9 - 175 нМ, №12-71 нМ) были выше, чем для гепарина (16 нМ). Константы диссоциации с AT для образцов СХ №3 и №9 составили 100 нМ, для №12 и гепарина - 93 нМ и 87 нМ, соответственно Низкая активность образцов №3 и №9 в потенциирова-нии взаимодействия Т-АТ обусловлена в 2,5 раза меньшим сродством к Т, чем для более активного образца №12.
Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов полученных деполимеризацией нефракционированных гепаринов хитинолитическим ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii иммобилизованным на силохроме
Комплекс с компонентом Б2 - индивидуальный СГМ с СЗ = 0.60 (табл. 3.2.4.4.1.) имел наименьшую эффективную концентрацию (9,7±0,8 мкг/мл, в коагулологическом тесте с плазмой человека, рис. 3.2.4.4.2.) и соответственно наибольшую антитромбиновую активность. При добавлении других компонентов комплекса alia активность снижалась в 2 раза. Активность против активированного фактора X у исходного сульфата галактоманнана и у всех комплексов не достигала 2 ЕД/мг. Таким образом, использование в ионных комплексах сульфата галактоманнана с большей степенью сульфатирования приводит к увеличению АК активности. Этот результат подтверждается литературными данными о том, что АК активность полисахаридов возрастает с увеличением степени сульфатирования [444].
Некоторые различия в АК активности ПИК, измеренной в плазме кроликов и человека, можно объяснить видовой специфичностью, в частности, константы связывания между плазменным ингибитором сериновых протеи-наз - AT, выделенным из плазмы кроликов/человека и гепарином различаются [154,213,560].
Таким образом, ПИК, содержащие ГМ - HS03" (СЗ 1.46 и 0.60), галак-тозилированный хитозан (С3= 0.10; СД =0.79) - NH3 + и хитозан-сукцинила - СОО (С3=0.80) в разных весовых пропорциях демонстрируют АК активность in vitro. В комплексах ГМ - HS03" (СЗ 1,46) с галактозилированным хитозаном (СЗ = 0.10; СД =0.79) - NH3 + и хитозан-сукцинилом - СОО" (С3=0.80) с увеличением доли первого до 67% alia активность возрастает в 1.6 раза в сравнении с чистым СГМ. Добавление к ГМ - HS03" (СЗ 1,46) га-лактозилированного хитозана (С3= 0.10; СД =0.79)-NH3+ и хитозан-сукцинил - СОО - (СЗ = 0.80) не приводит к изменению эффективной концентрации 2РеаКлот с плазмой кроликов и аХа активности. Отсутствие в сочетании хитозан-сукцинила - СОО" (С3=0.80) приводит к увеличению эффективных концентраций 2АЧТВ/2РеаКлот и снижению alia и аХа активностей. Последнее подтверждается литературными данными по АК активности хитозан-аргинила [494]. Снижение степени сульфатирования ГМ - HS03" с 1.46 до 0.60 приводит к снижению АК активности СГМ и ПИК. Способность ГАГ образовывать преципитаты в гелевой среде, содержащей соответствующие преципитирующие агенты, послужила основой для разработки нового направления изучения полисахаридов — биоспецифичного электрофореза (ЭФ) [21]. При использовании ракетного биоспецифичного ЭФ гиалуроновая кислота и сульфат хондроитина образовывали преципитаты определенной формы и различной интенсивности окрашивания. В качестве преципитирующих агентов авторы использовали хлорид цетилпиридиня (ЦПХ) и цетилтриметилааммония бромид (ЦТАБ). Сульфат протамина (ПСТ) в клинической практике используют, как антидот для быстрой нейтрализации АК активности гепарина при угрозе геморрагических осложнений [167,188,219,665,690,756]. Вследствие электростатического взаимодействия между отрицательно заряженным СП и положительно заряженным ПСТ возникает комплекс. В силу трудоемкости и длительности исследований нейтрализации АК активности ПСТ, имеет смысл предварительно изучить возможность образования комплексов между СХ и ПСТ, а затем, оценить нейтрализацию АК активности для полученных производных СХ. Исследованные образцы СХ с ММ 9-40 кДа, полученные с помощью кислотного гидролиза или экструзи-онного десульфатирования, создавали комплексы с ПСТ. При анализе подвижности в электрическом поле подобных комплексов между СХ и ПСТ отмечали достоверное увеличение размеров пиков преципитации с увеличением аХа активности образцов СХ (табл. З.З.1.1.1.). Коэффициент корреляции между высотой пиков преципитации аХа активностью составил 0,89 (р 0,05). Отрицательную умеренную связь наблюдали между высотой пиков преципитации и антитромбиновой активностью (г = -0,5, р 0, 05). С увеличением ММ и количества серы в образцах, размеры пиков преципитации снижались (гмм = -0,65, р 0, 05; rs = -0,7; р 0, 05). С увеличением АК активности карбоксиметилированного хитозана увеличивалась интенсивность окрашивания, четкость границ и размеры пиков преципитации (табл. 3.3.1.1.2.). С увеличением суммарного отрицательного заряда молекулы полисахарида возрастает способность создавать комплексы с поликатионом ПСТ. Известно, что образование полиэлектролитных комплексов напрямую зависит от степени ионизации катион- и анион-полимеров, плотности зарядов и распределения их вдоль полимерной цепи, от концентрации, соотношения, продолжительности взаимодействия и температуры [23,219,756]. На основании данных о том, что хитозан обладая низкой токсичностью способен образовывать с гепарином комплексы [23], в настоящей работе проанализировали способность хитозанов с разной ММ и разной степенью дезацетилирования (табл. 2.1.2.1.) создавать комплексы с СХ. С XI пиков преципитации не наблюдали. Высота пиков преципитации с другими хитозанами с ММ больше 4 кДа составила 2,5 - 8,3 мм (табл. 3.3.1.2.1.). Отмечали умеренную положительную корреляцию между ММ хитозанов и высотой пиков преципитации (табл. 3.3.1.2.2).
Влияние на величину антикоагулянтной активности плазмы при внутривенном введении фукоиданов из водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides экспериментальным животным
Полученные фракции с ММ 1,7 — 5,4 кДа ингибировали скорость гидролиза фактором Ха хромогенного субстрата. Наибольшая аХа активность была у фракции с ММ 5,4 кДа (189±28 Ед/мг, отношение активностей аХа/аПа= 1,8; рис. 4.3.6.).
После гель-хроматографии гидролизованного НФГ-2 ферментным комплексом получали фракции с ММ 2,7 - 5,1 к Да. Деполимеризацию осуществляли при рН 7,3; к раствору НФГ добавляли разное количество иммобилизованного ФК: для ММ 5,1 кДа -1000:1; 4,7 кДа - 900:1; 4,0 кДа - 700:1; 2,7 кДа- 500:1. Фракции с ММ 2,7 - 5,1 кДа ингибировали амидолитическую активность Т. Наименьшая антитромбиновая активность была у образа с ММ 2,7 кДа (47,4±5,0 ЕД/мг; рис. 4.3.7.). Достоверных различий между аХа активностями НФГ-2 и наиболее активного НМГ с ММ 5,1 кДа нами не обнаружено (рис. 4.3.8.). Между эффективными двойными концентрациями исследованных веществ и АК активностями, определенными по стандарту НМГ, наблюдали тесную отрицательную связь. Гидролизованные образцы продемонстрировали увеличение отношения активностей аХа / alia до 2,0 -2,6. Для исходного НФГ-2 это отношение составило 1. По данным результатам получен патент на изобретение РФ № 2248801 "Способ получения низкомолекулярных гепаринов".
В эквивалентных единицах alia активности НМГ и НФГ одинаково ингибируют генерацию Т [434,455,654, 783]. Однако в эквивалентных единицах аХа активности тинзапарин значительно активнее, чем эноксапарин, надро-парин и дельтапарин при ингибировании генерации Т. Используемые в клинической практике низкомолекулярные гепарины, НФГ и некоторые фукои-даны ингибируют генерацию Т (при активации по внешнему и внутреннему путям) [730,746]. НМГ с ММ 4,7 кДа (получен гидролизом НФГ-2 хитиноли-тическим ФК Streptomycess kurssanovii) в концентрациях 0,001 - 0,030 мкг/мл ингибировал генерацию Т в плазме человека. С увеличением концентрации НМГ-4,7 площадь под кривой генерации тромбина снижалась с 1623 мкг/л-мин 1 до 783 мкг/л-мин"1, что свидетельствует о влиянии этого гепарина на активность фактора Ха.
Сравнение эффективности определений активности НМГ против активированного фактора X с помощью наборов "РеаХром-гепарин" (НПО "Ренам") и Berichrom heparin (Dade Behring).
Для определения эффективности НМГ создан ряд наборов (Sigma, Dade Behring и т.д. ) с хромогенными или флюорогеными субстратами и низкими внутри- и межлабораторными коэффициентами вариации определений аХа активности [292,293]. Эти наборы можно использовать и для определения удельной аХа активности разрабатываемых НМГ.
При оценке аХа активности плазмы кроликов после в/в введения фраксипарина в дозе 120 ЕД/кг отмечали положительную связь между результатами, полученными с помощью разных наборов (табл.4.4.1.). В обоих случаях наблюдали падение активности с 1,10-1,23 ЕД/мл через 5 мин после введения до 0,31-0,32 ЕД/мл к третьему часу после введения. Достоверность определений аХа активности с помощью набора "РеаХром-гепарин" (Ренам), в сравнении с определениями набором "Berichrom heparin" (Dade Behring), для указанного числа точек (п=65) выражается через коэффициент корреляции (г=0,99; р 0,05) и корреляционное уравнение (у=0,9296х+0,0678) (рисАЛЛ.). Что свидетельствует о значительном совпадении измерений проведенных разными При п/к введении кроликам ФН аХа активность плазмы достигала максимума через 2-3 часа в зависимости от дозы (табл.4.4.2.). Введение наибольшей дозы приводило к выходу на "плато" продолжительностью 5 часов.
При сравнении аХа активностей плазмы кроликов после подкожного введения фраксипарина в дозах 300, 350 и 700 ЕД/кг , измеренных разными наборами, во всех случаях отмечены тесные положительные корреляции, Так, коэффициент корреляции при дозе 350 ЕД/кг составил 0,98 (р 0,05), при дозе 700 ЕД/кг - г=1,00 (р 0,05) и при дозе 850 ЕД/кг - г=0,99 (р 0,05).
Добавление разных концентраций НМГ с ММ 3,4-7,5 кДа (гидролиз НФГ Streptomycess kwss.) в инкубационную смесь, содержащую AT, фактор Ха и хромогенный субстрат из набора "РеаХром-гепарин" (Ренам) демонстрировало ингибирование активности сериновой протеазы по снижению изменения оптической плотности за минуту с увеличением концентрации исследуемых образцов АК (рис.4.4.2.). При определении удельной аХа активности образцов НМГ отмечали значительное совпадение измерений, проведенных разными наборами (табл.4.4.3.). Коэффициент корреляции составил 0,98 (р 0,05). Коэффициент вариации для измерений с помощью набора "РеаХром-гепарин" (Ренам) составил 12%, для набора "Berichrom heparin" (Dade Behring ) - 14%. Умеренная положительная связь прослеживается между ММ образцов НМГ в указанном диапазоне и их активностью по отношению к фактору Ха, коэффициенты корреляции при этом достигали 0,71 (р 0,05) и 0,59 (р 0,05) для измерений с помощью наборов "РеаХром-гепарин" (Ренам) и "Berichrom heparin" (Dade Behring), соответственно.
Изложенное выше свидетельствует о том, что, как для определения аХа активности плазмы кроликов (при в/в или п/к введениях фраксипарина), так и для определения удельной аХа активности новых НМГ с успехом можно применять набор "РеаХром-гепарин" фирмы Ренам, что демонстрируют достоверные статистические параметры, используемые для сравнения с данными полученными с помощью набора Berichrom heparin (Dade Behring). Кроме этого, суммарная инкубация в 10 мин, применяемая в наборе "РеаХром-гепарин" фирмы Ренам, позволяет оценить большее количество проб плазмы за один раз, в сравнении с суммарной инкубацией в 2 мин набора Berichrom heparin (Dade Behring).
