Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА1.Обзор литературы 11
1.1. Фотодинамическая терапия и препараты для ее проведения .11
1.1.1. Принципы фотодинамической терапии 11
1.1.2. Фотосенсибилизаторы 15
1.1.3. Фотодитазин .20
1.2. Лиофилизация .25
1.2.1. Основы процесса лиофилизации 26
1.2.2. Вспомогательные вещества, применяемые в процессе лиофилизации 31
1.2.3 Особенности лиофилизации липосомальных лекарственных препаратов34
Заключение 45
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 48
2.1. Материалы 48
2.2. Оборудование .52
2.3. Статистическая обработка полученных результатов 54
2.4. Методы исследований 54
2.4.1. Стерилизующая фильтрация раствора фотодитазина 54
2.4.2. Получение лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина 55
2.4.3. Определение растворимости лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина 55
2.4.4. Определение оптической плотности раствора фотодитазина 55
2.4.5. Определение средней массы содержимого флакона 55
2.4.6. Определение прозрачности раствора 55
2.4.7. Определение рН 56
2.4.8. Определение потери в массе при высушивании 56
2.4.9. Спектрофотометрическое определение содержания фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме 56
2.4.10. Метод тонкослойной хроматографии для качественного анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина58
2.5.Получение липосомальной дисперсии фотодитазина 60
2.6. Получение липосомального лиофилизата 62
2.7. Определение размеров липосом с фотодитазином 62
2.8. Количественное определение фотодитазина в лиофилизированной липосомальной лекарственной форме .63
2.9. Определение эффективности включения фотодитазина в липосомы .63
Заключение .64
ГЛАВА 3. Разработка технологии лиофилизации раствора и липосомальной дисперсии фотодитазина65
3.1. Разработка технологии лиофилизации раствора фотодитазина 65
3.1.1. Изучение влияния материала используемого для стерилизующей фильтрации на качество раствора фотодитазина.65
3.1.2. Выбор условий замораживания раствора фотодитазина .67
3.1.2.1.Определение температуры замораживания раствора фотодитазина...68
3.1.2.2. Выбор режима замораживания раствора фотодитазина .68
3.1.3. Разработка режима сублимационной сушки фотодитазина 71
3.1.4. Влияние толщины слоя раствора на качество лиофилизата фотодитазина .76
3.2. Оптимизация режима лиофилизации липосомальной дисперсии фотодитазина .78
Заключение 81
ГЛАВА 4. Разработка методик химико-фармацевтического анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина. стандартизация ллф и лллф фотодитазина83
4.1. Разработка методики спектрофотометрического определения содержания фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме .83
4.1.1. Изучение характера поглощения электромагнитного излучения раствором фотодитазина и лиофилизированным фотодитазином в видимой области спектра.83
4.1.2. Количественное определение действующего вещества в лиофилизированной лекарственной форме фотодитазина 85
4.1.3. Валидация методики количественного определения действующего вещества в лиофилизированной лекарственной форме фотодитазина .87
4.2. Метод тонкослойной хроматографии для качественного анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина .92
4.3. Выбор параметров для стандартизации лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина 94
4.4. Оценка уровня брака продукции при наработке серий лиофилизированного фотодитазина 99
4.5. Оценка качества раствора и лиофилизата фотодитазина в процессе хранения .100
4.6. Стандартизация лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина 104
Заключение .111
Общее заключение 113
Общие выводы .116
Список литературы 118
Приложения .135
- Особенности лиофилизации липосомальных лекарственных препаратов
- Метод тонкослойной хроматографии для качественного анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина
- Изучение влияния материала используемого для стерилизующей фильтрации на качество раствора фотодитазина
- Изучение характера поглощения электромагнитного излучения раствором фотодитазина и лиофилизированным фотодитазином в видимой области спектра
Особенности лиофилизации липосомальных лекарственных препаратов
Универсальность свойств липосомального носителя лекарственных препаратов предполагает широкие возможности его использования, особенно в химиотерапии онкологических заболеваний [101, 128], в частности при фотодинамической терапии опухолей [135]. Однако главным препятствием применения липосом в медицинской практике является неустойчивость в процессе хранения. Анализ литературы показывает, что перспективным направлением стабилизации липосомальной дисперсии, предназначенной для внутривенного введения, является метод сублимационной сушки [55, 69, 90]. Роль вспомогательных веществ-криопротекторов
Лиофилизация без специальных защитных веществ – криопротекторов приводит к слиянию и агрегации липосом, а также к вытеканию включенного в их внутреннее пространство водорастворимого ЛВ [37, 146].
Когда липидная мембрана достигает температуры фазового перехода (Тф.п.), инкапсулированное ЛВ легко высвобождается из липосом при переходе из гелевой фазы в жидкокристаллическую. Криопротектор, предотвращая фазовый переход, защищает липосомы от повреждения кристаллами льда при замораживании, а также ингибирует их слияние и агрегацию. Добавление криопротектора в водную фазу липосомальной дисперсии (внутри и снаружи) перед замораживанием с последующей сублимацией позволяет предупредить фазовое разделение липидной композиции и предохранить инкапсулированное ЛВ от вытекания, а также сохранить способность липосом к регидратации [63, 144].
К эффективным криопротекторам относятся соединения, принадлежащие различным классам химических веществ. Это спирты (этиленгликоль, -пропиленгликоль, глицерин), амиды (диметилацетамид), оксиды (диметилсульфоксид), синтетические полимеры (поливинилпирролидон, оксиэтилированный крахмал, полиэтиленгликоль), углеводы (сахароза, лактоза, трегалоза, мальтоза и др.) [68, 82, 83, 96, 133].
Криопротекторы обладают двумя механизмами действия, благодаря которым они обеспечивают протективный эффект: первый связан с замещением воды; второй – с образованием матрицы [63]. Впервые гипотеза замещения молекул воды молекулами криопротектора была предложена J. H. Crowe, в ней говорилось о взаимодействии между молекулами сахара и головными группами фосфолипида (ФЛ), что приводит к снижению температуры фазового перехода (Тф.п.) липидной мембраны за счет встраивания на место молекул воды молекул сахара, при этом снижаются Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия между криопротектором и ФЛ [68]. На поверхности бислоя липосомальной мембраны формируется множество водородных связей между сахаром и ФЛ. Образование матрицы обусловлено тем, что при замораживании раствор сахара концентрируется и тем самым защищает липидный слой от повреждения кристаллами льда, а во время сушки формируется структура, которая обладает большой вязкостью и низкой подвижностью и предохраняет везикулы от слияния и агрегации. Кроме того, присутствие матрицы ингибирует конформационные изменения, связанные с фазовым переходом липидов, а взаимодействие между поверхностью липосом и матрицей снижает поверхностное натяжение, стабилизируя высушенные липосомы.
Важно, что действие криопротекторов проявляется при содержании воды менее 20% на этапе первичной сушки. Содержание воды также влияет на включение лекарственного препарата, а остаточная вода является причиной снижения температуры образования матрицы (Тм). Известно, что Тм трегалозы составляла - 99,7 С и - 40,3 С при остаточном содержании воды менее 0,5 % и 6,5 %, соответственно [94].
Из всех изученных в настоящее время криопротекторов наиболее эффективными для лиофилизации липосом являются дисахариды глюкозы – сахароза и трегалоза, которые обеспечивают сохранение проницаемости мембраны, а также препятствуют вытеканию содержимого везикул при лиофилизации, благодаря оптимальной Тм, у трегалозы – около (- 110 С), у сахарозы – (- 65 С) [90]. Изучение влияния числа остатков глюкозы на включение веществ в липосомы показало, что наибольший процент включения сохранялся при использовании криопротектора с двумя остатками глюкозы [101].
Для эффективной защиты криопротектор должен находиться внутри и снаружи липосом, а концентрация его и включенного вещества должна быть подобрана таким образом, чтобы обеспечить осмолярность интра- и экстралипосомального пространств.
B. Stark at al. выбор криопротектора и его количества проводили, оценивая размер получаемых липосом, как в процессе замораживания 37 размораживания, так и до/после сублимационной сушки. Авторами получены моноламеллярные липосомы с размером около 100 нм на основе дистеароилфосфатидилэтаноламина-ПЭГ-2000, лизостеароилфосфатидил глицерина и дистеароилфосфатидилхолина. Данные составы первоначально лиофилизировали без добавления криопротектора, при этом размер липосом увеличивался более чем в два раза (около 260 нм). При лиофилизации липосом с различными криопротекторами (лактозой, трегалозой, глюкозой и маннитом) при молярном соотношении липид/криопротектор 1:5 во всех случаях происходило увеличение среднего диаметра везикул (глюкоза – 175 нм, лактоза – 160 нм, трегалоза – 150 нм, маннит – 160 нм), но не так заметно, как для липосом без криопротектора. Липосомы, лиофилизированные с глюкозой, трегалозой и лактозой, при молярном соотношении липид/криопротектор 1:10 сохраняли свой первоначальный размер ( 100 нм) [132]. В ряде исследований показано, что наиболее подходящими криопротекторами являются лактоза и сахароза. При этом сахароза из-за лучшей растворимости в воде не осложняет условия последующего фармацевтического анализа. Исследования влияния типа криопротектора на качество липосомального фотодитазина проводили, оценивая эффективность включения ЛВ. Показано, что введение в состав липосомальной дисперсии сахарозы позволяет проводить сублимационную сушку липосомальной дисперсии без изменения размера везикул и с сохранением высокой эффективности включения ЛВ [33, 34]. Изучение влияния криопротектора на размер и включение доксорубицина в свежеприготовленные, замороженные и лиофилизированные термочувствительные липосомы позволило остановиться на наиболее приемлемом криопротекторе для данной ЛФ – 4 % растворе сахарозы (диаметр везикул после лиофилизации 165 – 175 нм; включение доксорубицина в термолипосомы составило 74 %) [29]. В результате исследований по основным биофармацевтическим показателям, таким как средний диаметр липосом с фотосенсом, однородность липосомальной дисперсии, количество ЛВ, включенного в везикулы, структура лиофилизата и возможность его регидратации, селективность накопления препарата в опухоли и его противоопухолевая активность разработан препарат «Фотосенс лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 12 мг», показавший наилучшие результаты с использованием в качестве криопротектора сахарозы [11, 21]. При выборе криопротектора для ЛЛФ лизомустина установлено, что использование лактозы позволяет лиофилизировать водную дисперсию без нарушения целостности, однородности и изменения размера липосом [14]. В дальнейших исследованиях лактозу заменили на сахарозу, которая не мешает спектрофотометрическому определению включения препарата. Роль компонентов бислойной мембраны липосом Кроме криопротектора на качество ЛЛФ при лиофилизации влияют: тип ФЛ, наличие холестерина и поверхностно модифицирующих веществ в составе бислоя. Тип фосфолипида
Метод тонкослойной хроматографии для качественного анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина
Процесс, протекающий при движении подвижной фазы в тонком слое сорбента, нанесенного на инертную поверхность, называется тонкослойной хроматографией (ТСХ). Преимущества метода ТСХ: высокая скорость процесса хроматографирования, возможность использования в качестве неподвижных фаз (носителей) разнообразных сорбентов, а также сильнокислых, щелочных или иных подвижных фаз и жестких методов открытия пятен путем обработки хроматограмм агрессивными веществами при повышенных температурах.
Скорость перемещения оценивают величиной Rf, которая представляет собой отношение расстояния от стартовой линии хроматограммы до центра пятна вещества в любой момент времени к расстоянию, пройденному за то же время фронтом растворителя. Rf изменяется в пределах от 0 до 1. Подбор подвижной фазы проводится по следующим параметрам:
в выбранной системе разделяемые компоненты должны иметь небольшую растворимость;
состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым;
система должна полностью разделять вещества близкого строения;
система не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов;
в выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения (оптимальные значения Rf в пределах 0,3-0,6).
Методика:
На линию старта хроматографической пластинки Kieselgel 60 F254 наносят 5 мкл раствора содержимого флакона в 5 мл воды (25 мкг) и рядом в качестве свидетеля - 5 мкл 0,1 % раствора N-метилглюкамина (5 мкг). Пластинку с нанесенными пробами подсушивают на воздухе в течение 3 минут, помещают в хроматографическую камеру со смесью растворителей и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет расстояние 9 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе до удаления следов растворителей. Затем пластинку опрыскивают аммиачным раствором серебра нитрата, высушивают на воздухе и выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100 С в течение 20 минут.
Примечание: Приготовление 0,1 % раствора N-метилглюкамина. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,1 г субстанции N-метилглюкамина и доводят объем раствора водой до метки. Раствор используется свежеприготовленным.
Приготовление серебра нитрата аммиачного раствора 5 % .5 г серебра нитрата растворяют в 100 мл воды. К раствору приливают по каплям, при постоянном перемешивании, 10% раствор аммиака до тех пор, пока осадок не будет почти (но не полностью) растворен; фильтруют. Раствор используют свежеприготовленным.
Пригодность хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если на хроматограмме для проверки пригодности хроматографической системы обнаруживаются четко разделенные пятна: зеленого цвета (Rf=0,51) - хлорин е6 и темно-коричневое пятно (Rf=0,13) - N-метилглюкамин.
Разработка методики хроматографического определения фотодитазина в ЛЛФ изложена в главе 4 «Разработка методик химико-фармацевтического анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина. Стандартизация ЛЛФ и ЛЛЛФ фотодитазина». В колбу, вместимостью 200 мл, помещали 5,700 г лецитина, 0,975 г холестерина, 0,700 г пегилированного липида (PEG-2000-DSPE); отмеривали мерным цилиндром 110 мл хлороформа и перемешивали до полного растворения.
Стерилизующая фильтрация хлороформного раствора липидов
Перед началом фильтрования проводили проверку целостности фильтра по «пузырьковому» тесту. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр Миллипор с размером пор 0,22 мкм. Профильтрованный раствор собирали в стеклянный сборник. Профильтрованный раствор переносили в 2 круглодонные колбы вместимостью 5 л равными частями по 45 мл.
Получение липидной пленки Содержимое каждой колбы упаривали на роторном испарителе при температуре водяной бани +37 С до образования однородной полупрозрачной липидной пленки. Пленку подсушивали под вакуумом в течение 2,5 ч до удаления остатков хлороформа. Приготовление раствора фотодитазина с концентрацией 2,5 мг/мл В мерный цилиндр объемом 500 мл помещали 125 мл раствора фотодитазина с концентрацией 5 мг/мл и туда же добавляли 125 мл воды для инъекций, перемешивали. Стерилизующая фильтрация водного раствора фотодитазина с концентрацией 2,5 мг/мл Перед началом фильтрования проводили проверку целостности фильтра по «пузырьковому» тесту. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр Миллипор с размером пор 0,22 мкм. Профильтрованный раствор собирали в стеклянный сборник. Гидратация липидной пленки раствором фотодитазина c получением дисперсии многослойных липосом фотодитазина Пленку в каждой колбе смывали при интенсивном перемешивании полученным выше раствором фотодитазина (120 мл) до полного ее смывания со стенок каждой колбы. Полученную липосомальную дисперсию переливали в стакан химический вместимостью 500 мл.
Изучение влияния материала используемого для стерилизующей фильтрации на качество раствора фотодитазина
В качестве способа, повышающего стабильность раствора и липосомальной дисперсии фотодитазина при хранении, выбрана лиофилизация. Лиофилизация представляет собой сложный технологический процесс, и только правильный выбор концентрации, толщины слоя раствора, условий замораживания и режима сублимационного высушивания позволяет получить высококачественный готовый продукт.
Использование метода лиофилизации для стабилизации раствора и липосомальной дисперсии фотодитазина в процессе хранения было обусловлено крайней чувствительностью препарата к повышенным температурам (термолабильность), свету (фотолабильность), наличию кислорода в окружающей среде.
Разработка технологии лиофилизации раствора фотодитазина Раствор (субстанцию) фотодитазина 5 мг/мл для разработки лиофилизированной ЛФ получали от компании ООО «ВЕТА ГРАНД» (Россия).
Изучение влияния материала используемого для стерилизующей фильтрации на качество раствора фотодитазина
Как видно, из технологической схемы получения ЛЛФ фотодитазина (рис.12), этапом, предшествующим лиофилизации раствора фотодитазина, является его стерилизующая фильтрация. Ее проводили с использованием целлюлозных мембранных фильтров Millipore диаметром 90 мм с размером пор 0,22 мкм.
Для определения влияния технологического процесса фильтрации на качество лекарственного препарата изучали адсорбцию действующего вещества на материале фильтрационной мембраны.
С этой целью определяли динамику снижения концентрации фотодитазина при контакте его раствора с фильтром. Фильтровали параллельно 5 образцов раствора фотодитазина одной серии объемом 100 мл.
Данные проведенного эксперимента с использованием целлюлозных фильтровальных мембран представлены в табл. 2.
Анализируя полученные данные (табл. 2), можно сделать вывод, что в процессе фильтрации с использованием целлюлозных фильтров концентрация фотодитазина в растворе изменяется незначительно (потери составили в среднем 2-4 %). Выбор условий замораживания раствора фотодитазина Для разработки режима лиофилизации первоначально подбирали условия замораживания раствора фотодитазина. Последовательно проводили: определение температуры замораживания раствора фотодитазина; подбор способа замораживания раствора фотодитазина; изучение влияния продолжительности замораживания на качество конечного продукта. 3.1.2.1.Определение температуры замораживания раствора фотодитазина При разработке технологии лиофилизации фотодитазина необходимо для установления требуемой температуры замораживания раствора определить эвтектическую температуру, имеющую конкретное значение для каждого вещества в случае эвтектикообразующих растворов или эвтектическую зону для стеклообразующих веществ. Обычно температура замораживания для надежности принимается на 5-10 С ниже эвтектической.
Используемый нами термический способ определения эвтектической температуры наиболее простой. В его основе лежит фиксирование температуры образца, замороженного ниже эвтектической точки, в процессе медленного оттаивания. На кривой измерения температуры материала при достижении эвтектической точки, образуется плато, соответствующее времени, когда тепло, поступающее извне, не приводит к повышению температуры, а расходуется на плавление льда при данной эвтектической «концентрации» раствора. Получить такую площадку можно только при достаточно большом содержании вещества в растворе, поэтому этот метод применим не во всех случаях.
Для замораживания использовали раствор фотодитазина с концентрацией 5 мг/мл, который дозировали во флаконы вместимостью 30 мл по 5 мл, толщина слоя составляла 10 мм. Используя термический метод, установили зону эвтектики раствора фотодитазина, которая находится в области температур – 3 С до – 5 С.
В процессе изучения влияния скорости замораживания на структуру препарата раствор фотодитазина разливали по 5 мл во флаконы вместимостью 30 мл и замораживали на полке сублимационной установки до – 45 С, применяя следующие способы замораживания: 1. Медленное (постадийное) замораживание (рис. 13) – препарат загружали на полки камеры при температуре +20 C, охлаждали полки до – 20 С и выдерживали 1 ч (стадия 1). Далее полки охлаждали от - 20 до -30 C и выдерживали еще 1 ч (стадия 2), затем понижали температуру полок от - 30 до - 40 C и выдерживали еще 1 ч, дальше понижали температуру до достижения препаратом температуры -40…-45 C и выдерживали его в течение 3 ч при данной температуре (стадия 3);
2. Быстрое замораживание – препарат загружали на полки сублимационной камеры при температуре +20 C, охлаждали их за 1 час до – 20 C, за 2 час до – 30C, за 3 час до – 40 C, и за 4 час до -45 C, после чего температура препарата достигала -40…-45 C, выдерживали его при данной температуре в течение 3 ч (рис. 14).
Изучение характера поглощения электромагнитного излучения раствором фотодитазина и лиофилизированным фотодитазином в видимой области спектра
Целью исследования являлась разработка наиболее точной и чувствительной методики количественного определения содержания фотодитазина в ЛЛФ. Методика спектрофотометрического количественного определения фотодитазина была выбрана, т.к. она проста в исполнении, требует незначительного количества анализируемого вещества, отличается достаточно большой точностью и чувствительностью.
Процесс разработки спектрофотометрической методики
количественного определения действующего вещества в лекарственной форме включает следующие основные этапы:
1. Изучение спектра поглощения действующего вещества, определение
максимумов поглощения и выбор рабочей длины волны;
2. Изучение стабильности исследуемого вещества в растворах для спектрофотометрического анализа.
3. Валидация методики количественного определения фотодитазина в лиофилизате по параметрам: аналитическая область (диапазон применения), специфичность (селективность), правильность, прецизионность (повторяемость – сходимость; промежуточная прецизионность), линейность
Способность спиртового раствора фотодитазина поглощать электромагнитное излучение при длине волны 662 нм, благодаря наличию фрагмента порфирина, используется в ФСП на концентрат для инфузий в качестве доказательства подлинности препарата и для определения его количественного содержания в ЛФ. Растворителем при спектрофотометрическом анализе фотодитазина служил 95 % этиловый спирт. Электронный спектр снимали в диапазоне длин волн от 300 нм до 800 нм, и при этом наблюдались максимумы при длинах волн: 404 ± 2 нм, 504 ± 2 нм, 534 ± 2 нм, 608 ± 2 нм, 662 ± 2 нм (рис. 24). Для сравнения измеряли оптическую плотность спиртового раствора концентрата фотодитазина и спиртового раствора лиофилизированного фотодитазина в диапазоне длин волн от 300 до 800 нм в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм (относительно 95 % этилового спирта). Как видно из рис. 25, электронный спектр поглощения спиртового раствора лиофилизированного фотодитазина (при разведении как для количественного определения фотодитазина) по положению максимумов и форме идентичен спектру спиртового раствора концентрата данного ФС, а раствор сравнения (95 % этиловый спирт) не поглощает в данном диапазоне длин волн. Электронные спектры поглощения 0,5 % спиртовых растворов фотодитазина (1) и ЛЛФ фотодитазина (2), 95% этилового спирта (3) В качестве аналитического выбран максимум при длине волны 662 нм, который имеет наибольшее значение, так как обладает максимальным значением поглощения и расположен в части спектра, соответствующей большей проникающей способности излучения в ткани человека. При разработке методики количественного определения фотодитазина в лиофилизате снимали спектр спиртового раствора ЛЛФ (концентрация 0,5 %) и сравнивали его со спектром субстанции (Рис. 25). Анализ представленных спектров показал, что после лиофилизации аналитический максимум оптической плотности сохраняется при 662 нм.
Результаты количественного определения фотодитазина в ЛЛФ указывают на то, что предложенная спектрофотометрическая методика обладает достаточной точностью, так как средняя ошибка определения составила менее 1% (табл. 6).
В ходе исследования проводили определение области значений, при которых наблюдается линейная зависимость оптической плотности от концентрации вещества, т.е. соблюдается закон Бугера-Ламберта-Бера. Для этого определяли оптическую плотность растворов фотодитазина с концентрацией от 0,010 до 0,050 мг/мл при длине волны 662 ±2 нм (Рис. 26). Валидацию методики количественного определения содержания фотодитазина в ЛЛФ проводили по следующим параметрам: аналитическая область (диапазон применения), специфичность (селективность), правильность, прецизионность (повторяемость – сходимость; промежуточная прецизионность), линейность. При количественном определении действующего вещества в ЛФ диапазон применения должен составлять 80-120 % от концентрации действующего вещества в лекарственном препарате.
Специфичность аналитической методики считается доказанной, если ни используемый растворитель, ни вспомогательные вещества, ни примеси не искажают получаемый результат в пределах требуемой точности. Специфичность методики определяли сравнением спектров поглощения субстанции, растворителя (этиловый спирт) и ЛЛФ Фотодитазина.
Электронные спектры поглощения раствора фотодитазина и ЛЛФ фотодитазина совпадают (Рис.27), а 95 % этиловый спирт, используемый в качестве растворителя при количественном анализе раствора и ЛЛФ, в данном диапазоне длин волн, при данной длине волны свет не поглощает. Полученные данные свидетельствуют о специфичности разработанной методики количественного определения фотодитазина в ЛЛФ.
Линейность аналитической методики спектрофотометрического определения фотодитазина в ЛЛФ рассматривали в диапазоне концентраций от 4 до 6 мг/мл. Методика считается линейной, если в выбранном диапазоне концентраций (80-120 % от концентрации) доказано линейное соотношение между концентрацией действующего вещества в исследуемом растворе и величиной сигнала (в данном случае оптической плотностью). Оценка производилась с помощью соответствующего уравнения регрессии вида y=a+bx. Коэффициенты а и b и другие метрологические характеристики зависимости y=a+bx рассчитывают с помощью метода наименьших квадратов по экспериментально измеренным значениям переменной у для заданных значений аргумента х). Основными характеристиками линейности являются коэффициент корреляции, наклон прямой и отрезок, отсекаемый на оси ординат (табл. 7).
