Введение к работе
Актуальность проблемы. Вакцинопрофилактика рассматривается в современных условиях как одно из ведущих массовых эффективных средств борьбы с инфекциями [Бектимиров Т.А., 2001, Селезнева Т.С., 2010, Фельдблюм И.В., 2010]. Стремление создать вакцины из высокоочищенных антигенов, которые в большинстве случаев обладают слабой иммуногенностью, привело к необходимости применения адъювантов, усиливающих иммунный ответ [Медуницын Н.В., 2010, Дыкман Л.А. с соавт., 2010, Manmohan S., 2007].
Разработка эффективных адъювантов – носителей антигенов, обеспечивающих формирование выраженного и длительно сохраняющегося иммунитета, является одной из сложнейших задач в производстве вакцинных препаратов. На стадиях экспериментальных исследований и клинических испытаний находятся вакцины, направленные на профилактику более 60-ти видов заболеваний. Поэтому разработка новых адъювантов приобретает особую актуальность в связи с постоянной необходимостью усиливать иммунный ответ на обширное количество новых антигенов, для большинства которых характерна слабая иммуногенность [Медуницын Н.В., 2010, Дыкман Л.А. с соавт., 2010]. Следует указать, что использование адъювантов имеет и экономическую целесообразность, так как вакцины с адъювантами требуют минимального расхода антигена [S.L. Plotkin, 2004].
В настоящее время как самые перспективные адъюванты в мировой и отечественной практике рассматриваются наночастицы: липосомы, виросомы, иммуностимулирующие комплексы, эмульсии (MF59, SAF, Montanide), полимерные наносферы, вирусоподобные частицы и др. [Краснопольский Ю.М. с соавт., 2008, D. Drane et al., 2006, J. Aucouturier et al., 2002].
Липосомы считаются нетоксичными, сами липиды не обладают иммуногенностью, включенные в липосомы вещества не вызывают пирогенные, токсические или аллергические реакции организма. Все эти особенности липосом могут быть весьма эффективно реализованы в вакцинных препаратах [Андреева И.Н., 2004, Швец В.И. с соавт., 2008, Борщевский Г.И. с соавт., 2009].
В МИТХТ им. М.В. Ломоносова профессором А.П. Каплуном с соавт. [2008] разработаны сферические аморфные наночастицы (САНЧ) из смеси тритерпеноидов бересты (СТБ). В модельных экспериментах, выполненных на базе филиала ФГУП "НПО "Микроген" МЗ РФ "Пермское НПО "Биомед" с использованием экспериментальных образцов САНЧ, нами была выявлена их адъювантирующая способность в отношении вакцины против гепатита В.
Учитывая перспективность применения САНЧ в качестве носителя антигенных препаратов, представлялось целесообразным для использования в вакцинных композициях разработать технологию, обеспечивающую получение адъюванта на основе САНЧ, соответствующего требованиям, предъявляемых к препаратам для парентерального введения.
Цель исследования – разработка и использование адъювантов на основе липосомальных структур и сферических аморфных наночастиц в технологии вакцинных препаратов.
Основные задачи исследования:
1. Разработать технологию получения липосомальных композиций с эффективным включением рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В, дифтерийного и столбнячного анатоксинов. Разработать методы контроля технологического процесса и стандартизации липосомальных композиций.
2. Оценить полученные липосомальные вакцинные композиции по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам. Изучить адъювантные свойства липосом в отношении дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В.
3. Отработать параметры технологического процесса получения адъюванта САНЧ. Разработать методы контроля технологического процесса и стандартизации готового адъюванта. Оценить физико-химические и биологические свойства САНЧ.
4. Получить вакцинные композиции на основе САНЧ и оценить их иммунобиологические свойства.
Личный вклад автора. Все приведенные в диссертации данные были получены лично автором на базе ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России и в филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России "Пермское НПО "Биомед".
Научная новизна. Впервые по разработанной технологии получены липосомальные формы вакцинных препаратов: лиофилизированный дифтерийно-столбнячный анатоксин и жидкая вакцина против гепатита В, отвечающие требованиям к препаратам, вводимым парентерально, по показателям безопасности и эффективности. Установлены критерии и параметры контроля технологического процесса и качества липосомальных форм вакцин: гомогенность липосомальной дисперсии, средний размер, дзета-потенциал, фотометрический показатель дисперсности (ФПД), эффективность включения антигенов в липосомы, стерильность, токсичность, иммуногенность. Получены гомогенные липосомальные дисперсии с эффективностью включения антигенов не менее 75%, со средними размерами частиц 120-170 нм, дзета-потенциал которых составлял минус 12-15 мВ.
Разработана технология получения САНЧ из СТБ, отвечающих требованиям к адъювантам, используемых при производстве вакцин для парентерального введения. Впервые создан стерильный апирогенный препарат САНЧ. При испытании его в опытах на лабораторных животных показано отсутствие токсических свойств и установлена высокая адъювантирующая способность на примере вакцинных препаратов против гриппа и гепатита В.
Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическая значимость результатов исследований состоит в расширении знаний об адъювантных свойствах липосомальных структур и САНЧ. Показана возможность получения вакцинных препаратов для парентерального введения с указанными адъювантами. Созданные вакцинные композиции обосновывают перспективность дальнейших исследований по углубленному изучению адъювантных свойств липосомальных структур и САНЧ в отношении различных групп антигенов.
В ходе выполнения данных исследований разработаны:
- технология получения липосомальной вакцины против гепатита В (ЛВГВ) и лиофилизированной комбинированной липосомальной дифтерийно-столбнячной вакцины (ЛДС-М) для парентерального введения;
- технология получения стерильного, апирогенного, нетоксичного лиофилизированного адъюванта на основе нанодисперсии из смеси тритерпеноидов бересты. Составлен проект ФСП «Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная». Установлен адъювантирующий эффект САНЧ на примере вакцин против гриппа и гепатита В. В Пермском и Иркутском филиалах НПО «Микроген» проведены испытания адъюванта САНЧ (акты испытания от 09.11.2012, 23.11.2012). Технология получения липосомальной формы анатоксинных композиций может быть перспективна в плане изучения возможностей ее использования в производстве гетерогенных антитоксических сывороток при подготовке антигенного материала для иммунизации животных.
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе ГБОУ ВПО ПГФА на факультете дополнительного профессионального образования (ФДПО) (сертификационный цикл «Фармацевтическая технология»). Подготовлен материал к лекционным и практическим занятиям для слушателей интернатуры и ФДПО (акт внедрения от 17.01.2012). Опубликовано учебно-методическое пособие для слушателей ФДПО «Биотехнологические аспекты производства лекарственных средств», Пермь, 2010 г.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были доложены на XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2010; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия», Курск, 2010; Научно-практической конференции Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, 2011; Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации», Пермь, 2011; Х Съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации», Москва, 2012; Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности», Казань, 2012.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, включая 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 148 стр. машинописного текста, содержит 43 таблицы и 22 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, двух глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 170 источников, из них 79 отечественных и 91 иностранных авторов.
