Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Некрахмальные полисахариды: структура, свойства и фармакологи активность
Глава II. Материалы и методы
2.1 Общая характеристика экспериментальных животных
2.2. Общая характеристика изучаемых препаратов
2.3. Экспериментальные методы
2.4. Физиологические методы исследования 71
Глава III. Металлсвязывающая активность некрахмальпых полисахаридов 76
3.1. Отравления тяжелыми металлами: эпидемиология, лечение и профилактика 76
3.2. Оценка металл-связывающей активности некрахмальных полисахаридов 85
3.3. Взаимодействие некрахмальных полисахаридов с ионами меди 87
Глава IV. Взаимодействие полисахаридов с металлами в условиях in vivo 151
4.1. Влияние полисахаридов на абсорбцию свинца в кишечнике 151
4.2. Влияние некрахмальных полисахаридов на выведение свинца из внутренних органов крыс 157
Глава V. Эффективность некрахмальных полисахаридов при экспериментальной почечной недостаточности 175
5.1. Связывание уремических токсинов некрахмальными полисахаридами 176
5.2. Эффективность некрахмальных полисахаридов при экспериментальной
почечной недостаточности у крыс 185
Глава VI. Оценка гепатопротекторного действия некрахмальных полисахаридов 199
6.1. Сорбционная активность некрахмальных полисахаридов в отношении билирубина и желчных кислот 200
6.2. Связывание холевой кислоты некрахмальными полисахаридами энтеросорбентами
Глава VII. Гиполипидемические свойства некрахмальных полисахаридов . 231
Глава VIII Гастропротекторные свойства некрахмальных полисахаридов. 241
Обсуждение 252
Выводы 286
Список использованных источников 288
- Некрахмальные полисахариды: структура, свойства и фармакологи активность
- Общая характеристика изучаемых препаратов
- Оценка металл-связывающей активности некрахмальных полисахаридов
- Влияние некрахмальных полисахаридов на выведение свинца из внутренних органов крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск соединений с высокой фармакологической активностью и разработка на их основе новых лекарственных препаратов являются важными задачами современной экспериментальной фармакологии и фармации. Актуальность поисковых исследований обусловлена необходимостью пополнения арсенала лекарственных средств более эффективными и менее токсичными препаратами, предназначенными для лечения и профилактики социально-значимых заболеваний. Наряду с медицинскими задачами, необходимость в создании новых фармацевтических субстанций и лекарственных средств диктуется социальными и экономическими причинами. По данным агентства «DSM Group», в 2008 г. на Российском фармацевтическом рынке 75,8% лекарственных препаратов в стоимостном объеме были представлены средствами импортного производства [Кузин А.В., 2008]. Большинство лекарственных средств отечественного производства является препаратами-дженериками, эффективность которых по сравнению с оригинальными препаратами, как правило, значительно ниже. В настоящее время примерно 80% отечественных лекарственных препаратов производится из фармацевтических субстанций импортного производства. В период с 1991 г. до 2005 г. объем производства фармацевтических субстанций в Российской Федерации сократился с 17,5 тыс. усл. тонн до 0,98 тыс. усл. тонн. Все это негативно отражается на состоянии здоровья населения и требует более интенсивного развития биомедицинских исследований, направленных на создание новых эффективных лекарственных средств.
По разным оценкам от 40 до 70% новых лекарственных препаратов создается на основе природных молекул или их синтетических аналогов и производных. На основе природных соединений могут быть разработаны фармацевтические средства, обладающие качественно новыми фармакологическими эффектами по сравнению с химически синтезированными лекарственными препаратами. Существенными преимуществами лекарственных веществ из природных источников являются доступность сырья, меньшая сложность технологических процессов выделения и очистки, выраженная фармакологическая активность и, как правило, низкая токсичность [Хотимченко Ю.С., 2010]. В этом отношении большой интерес вызывают представители морской флоры и фауны, которые можно рассматривать как источник новых лекарств и фармакологически активных субстанций [Bowling J.J. et al., 2007; Martinez A., 2007; Kinghorn A. et al., 2009]. Известно, что филогенетическое (макротаксономическое) разнообразие в море существенно выше, чем на суше. Так, из 33 типов многоклеточных животных 31 тип встречается в морских водах, 17 типов – в пресных водах и только 11 типов – на суше [Адрианов А.В., 2004]. Благодаря многочисленным адаптациям к разнообразным факторам внешней среды, многие морские животные и растения вырабатывают уникальные вторичные метаболиты, отсутствующие у наземных организмов. Зачастую эти соединения характеризуются чрезвычайно высокой фармакологической активностью [Haefner B., 2003; Muller W. et al., 2003; Newman D., Cragg G., 2006; Стоник В.А., Толстиков Г.А., 2008].
Перспективную группу веществ, преимущественно морского происхождения, составляют некрахмальные полисахариды [Хотимченко Ю.С. и др., 2005], к которым относятся альгинаты и фукоиданы морских бурых водорослей, каррагинаны красных водорослей, хитин и его производное хитозан морских ракообразных, а также пектины морских трав и наземных растений. Они широко применяются в пищевой промышленности в качестве стабилизаторов, загустителей и гелеобразователей и в меньших масштабах – в фармацевтической промышленности как формообразующие вещества [Redgwell R., Fischer M., 2005]. В последние годы эти полисахариды стали объектом нанотехнологических исследований в качестве структурных компонентов систем адресной доставки лекарственных молекул и микрокапсулирования [Liu Z. et al., 2008].
Все некрахмальные полисахариды объединены общим свойством: в желудочно-кишечном тракте они не гидролизуются амилазами слюнных и панкреатических желез и не абсорбируются из кишечника в кровь, однако, в толстой кишке подвергаются деградации под действием ферментов бактериальной микрофлоры [Wong J.M. et al., 2006]. Уникальным свойством этих полисахаридов является способность поглощать большое количество воды и в присутствии, как правило, двухвалентных ионов образовывать гели. Механизм гелеобразования лежит в основе способности некрахмальных полисахаридов связывать и прочно удерживать ионы металлов и другие ионизированные молекулы [Kohn R., 1987].
У большинства исследованных полисахаридов обнаружены те или иные фармакологические эффекты, заслуживающие внимания в плане создания новых фармацевтических субстанций. Так, пектины, альгинаты и хитозаны обладают достоверным гипохолестеринемическим и гипотриглицеридемическим эффектами [Panlasigui L.N. et al., 2003; Shields K.M. et al., 2003]. Гепатопротекторное и нефропротекотрное действие обнаружено у фукоиданов [Kawano N. et al., 2007; Veena C.K. et al., 2007]. В экспериментальных исследованиях и клинических наблюдениях была доказана терапевтическая эффективность пектинов при инфекционной патологии, проявляющаяся в снижении явлений интоксикации [Ященя О.В. и др., 2001], а также при отравлении ртутью [Соболев М.Б. и др., 1999]. У пектинов и хитозанов выявлены бактерицидные и фунгицидные эффекты, а у фукоиданов и каррагинанов – противовирусная активность [Neurath A.R. et al., 2002; Carlucci M.J. et al., 2004; Adhikari U. et al., 2006; Buck C.B. et al., 2006], которая сочетается с иммуностимулирующим эффектом [Yoshikawa Y. et al., 2008] и способностью к индукции синтеза интерферонов [Tsuji R.F. et al., 2003]. Помимо этого, у фукоиданов и каррагинанов установлена антикоагулянтная активность [Liang A. et al., 2006; Cicala C. et al., 2007], которая у высокосульфатированных фукоиданов сопоставима с таковой препаратов гепарина [Qui X.D. et al., 2006]. Фукоидан проявляет также антиагрегантные свойства [Mourao P.A.S., 2004], а альгиновая кислота, наоборот, обладает протромботической активностью, что на практике реализовалось в создании перевязочных материалов с гемостатическими свойствами [Pielesz A. et al., 2008].
Результаты многих исследований указывают на наличие противоопухолевой активности у некрахмальных полисахаридов. Пектины в эксперименте снижают частоту рака толстого кишечника, что было подтверждено результатами клинических наблюдений. На моделях перевиваемых опухолей у мышей показана противоопухолевая активность альгинатов. В ряде работ продемонстрирована способность фукоиданов ингибировать рост опухолей и уменьшать интенсивность процессов метастазирования [Алексеенко Т.В. и др., 2007; Cumashi A. et al., 2007; Li D.Y. et al., 2008]. Получены данные о противоопухолевой активности и каррагинанов [Zhou G. et al., 2006], хотя в литературе имеются факты, указывающие на их онкогенное действие [Tobacman J.K. et al., 2001; Hata K. et al., 2006]. Весьма перспективными препаратами для лечения и профилактики язвенной болезни представляются фукоиданы, которые, с одной стороны, обладают антипептическими и противовоспалительными свойствами [Shibata H. et al., 2000; Yamamoto Y. et al., 2000], а с другой, препятствуют адгезии Helycobacter pylori на мембраны эпителиальных клеток слизистой желудка [Shibata H.et al., 1999].
Следует подчеркнуть, что представители каждой группы некрахмальных полисахаридов представляют собой гетерогенные соединения, различающиеся не только источниками происхождения, но и параметрами физико-химических свойств, таких как молекулярная масса, вязкость, растворимость в воде, степень этерификации и сульфатирования, что, к сожалению, не учитывается в большинстве работ по оценке биологической активности углеводных биополимеров и, на наш взгляд, является причиной многочисленных противоречивых фактов, имеющихся в литературе, посвященной фармакологии этих полисахаридов. Отсутствие общепринятых количественных показателей для стандартизации препаратов некрахмальных полисахаридов затрудняет проведение сравнительной оценки фармакологической эффективности полисахаридов друг с другом, а также с лекарственными препаратами аналогичного действия. Сформулированные проблемы определили цели и задачи настоящей работы.
Цель работы: изучить сорбционные свойства, фармакологические эффекты и механизмы действия некрахмальных полисахаридов и обосновать возможности использования данных веществ для разработки новых фармацевтических субстанций и лекарственных средств.
Задачи работы:
-
Изучить металлсвязывающие свойства природных пектинов, альгинатов, хитозанов, каррагинанов и фукоидана при взаимодействии с ионами меди, ртути, кадмия, свинца, цинка и стронция и определить с помощью математических моделей сорбции основные константы связывания.
-
Провести сравнительный анализ количественных параметров связывания тяжелых металлов некрахмальными полисахаридами и лекарственными препаратами из группы энтеросорбентов и определить наиболее перспективные образцы для дальнейшей разработки на их основе новых лекарственных средств.
-
Исследовать металлсвязывающую активность образцов пектинов с различной степенью этерификации при взаимодействии с ионами меди, ртути, кадмия, свинца, цинка и стронция и установить зависимость сорбционной емкости полисахаридов от степени этерификации.
-
На модели свинцовой нагрузки у лабораторных животных оценить влияние пектинов, альгинатов, хитозана, каррагинанов и фукоидана на депонирование и экскрецию тяжелых металлов.
-
Оценить гипохолестеринемическую, гипотриглицеридемическую и антиоксидантную активность пектинов, альгинатов, каррагинанов и фукоидана на различных моделях экспериментальной гиперлипидемии.
-
Исследовать гепатопротекторное действие пектинов и альгинатов на животных с экспериментальным тетрахлорметановым поражением печени, а также оценить антиоксидантные свойства полисахаридов на данной модели.
-
На экспериментальных моделях повреждения слизистой желудка оценить гастропротективные эффекты пектинов, альгинатов, хитозана и каррагинанов.
-
Определить сорбционную емкость пектинов и альгинатов в отношении мочевины и креатинина и изучить лечебные и профилактические эффекты этих полисахаридов при экспериментальной почечной недостаточности.
-
Провести анализ зависимости сорбционных свойств и фармакологических эффектов некрахмальных полисахаридов от их физико-химических свойств на примере высокоэтерифицированных и низкоэтерифицированных пектинов с целью стандартизации полисахаридных препаратов.
Научная новизна и теоретическое значение работы. Работа является комплексным научным исследованием, посвященным фармакологии некрахмальных полисахаридов. Дана сравнительная оценка сорбционных свойств, антитоксической, липиднормализующей, гепатопротективной, гастропротективной и нефропротектиновной активности пектинов, альгинатов, хитозана, каррагинанов и фукоидана.
На основе математического аппарата моделей сорбции Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммета-Таллера определены параметры максимальной сорбционной емкости, аффинитета и прочности связывания металлов природными и модифицированными некрахмальными полисахаридами. Установлена зависимость количественных значений констант связывания от степени этерификации пектинов, содержания кальция в молекуле альгинатов и пектинов, от степени сульфатирования каррагинанов. Определены наиболее эффективные образцы некрахмальных полисахаридов, препятствующих накоплению металлов в организме и ускоряющих их выведение.
Установлены константы связывания желчных кислот, билирубина, мочевины и креатинина пектинами и альгинатами. Показана зависимость гипохолестеринемического и гипотриглицеридемического действия пектинов и альгинатов от молекулярной массы и характеристической вязкости полисахаридов. Определены образцы пектинов, альгинатов, хитозана и каррагинанов, обладающие лечебным и профилактическим действием при экспериментальном токсическом поражении печени и почек.
На различных моделях повреждения слизистой желудка крыс показано антиульцерогенное действие альгината натрия, пектата кальция и хитозана.
Проведен анализ зависимости фармакологических эффектов некрахмальных полисахаридов от их химической структуры, молекулярной массы, вязкости и других физико-химических параметров. Количественные характеристики физико-химических свойств предложены в качестве показателей стандартизации препаратов некрахмальных полисахаридов.
Теоретическое значение работы заключается в установлении новых, не известных ранее закономерных связей структуры и физико-химических свойств некрахмальных полисахаридов с их биологической активностью. Установлены новые механизмы фармакологического действия углеводных биополимеров.
Практическая значимость работы и реализация результатов исследования. Практическим итогом проведенного исследования стало базирующееся на полученных результатах обоснование дальнейшей разработки лекарственных средств на основе низкоэтерифицированных пектинов, солей пектовой и альгиновой кислот, предназначенных для применения в качестве энтеросорбентов. Высокая сорбционная емкость пектинов и альгинатов по тяжелым металлам, значительно превышающая таковую препаратов активированного угля и лигнина, сочетающаяся с возможностью их длительного безопасного приема, позволяют рассматривать эти вещества как перспективные препараты для профилактики и лечения хронических отравлений тяжелыми металлами. Пектат кальция может быть рекомендован для дальнейшей разработки в качестве гастропротективного средства.
Препараты некрахмальных полисахаридов с энтеросорбционными свойствами могут рассматриваться в качестве дополнительных средств в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся явлениями интоксикации.
На основании проведенных экспериментальных исследований, анализа физико-химических характеристик и технологических процессов выделения, очистки и химической модификации полисахаридов разработана и зарегистрирована в установленном порядке нормативная документация на производство и реализацию биологически активных добавок к пище, действующим компонентом которых является пектин со степенью этерификации менее 5%, комбинация пектинов с суммарной степенью этерификации 50% и альгинат кальция. Действующие компоненты рассматриваются в качестве основы для разработки лекарственных средств с энтеросорбционными свойствами.
Разработанные технологии получения модифицированных некрахмальных полисахаридов и способы их применения защищены четырьмя патентами Российской Федерации.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Некрахмальные полисахариды обладают выраженной металлсвязывающей способностью в отношении токсичных металлов, таких как свинец, кадмий, ртуть, стронций и могут стать основой для разработки новых лекарственных средств, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний, обусловленных действием тяжелых металлов. Наиболее перспективными для дальнейшего изучения в качестве средств профилактики и лечения хронических поражений тяжелыми металлами являются деэтерифицированный пектин, альгинат натрия, пектат кальция, альгинат кальция.
-
Механизмы связывания ионов меди, свинца, кадмия и цинка пектинами и альгинатами отличаются от процессов связывания ионов ртути и стронция. Сорбция ионов меди, свинца, кадмия и цинка происходит за счет образования координационных связей между карбоксильными и гидроксильными группами галактуроновых кислот в пектине и гулуроновых кислот в альгинате и ионом метала с формированием упорядоченной структуры гомогенных активных связывающих центров. Связывание ртути и стронция происходит за счет образования координационных связей между карбоксильными и гидроксильными группами галактуроновых кислот в пектине и гулуроновых кислот в альгинате, приводящего к хаотичному формированию гетерогенных активных связывающих центров. Дополнительное введение ионов кальция в сорбционную систему связывания ртути и стронция приводит к упорядочиванию структуры активных связывающих центров.
-
Пектины, альгинаты, хитозан и фукоидан при энтеральном введении оказывают липиднормализующее действие, позволяющее рассматривать их в качестве основы для разработки средств профилактики атеросклероза.
-
Пектины, альгинаты и хитозан оказывают гастропротективное действие на различных моделях поражения слизистой желудка и являются перспективной основой для создания новых противоязвенных средств.
-
Препараты пектинов, альгинатов и хитозана способствуют нормализации биохимических параметров печеночной интоксикации при экспериментальной поражении печени, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных гепатопротекторов. Одним из механизмов антитоксического действия некрахмальных полисахаридов является их антиоксидантная активность.
-
Препараты альгинатов и пектинов при энтеральном введении уменьшают явления уремической интоксикации и могут найти применение в комплексном лечении почечной недостаточности.
Апробация работы:
Основные результаты работы были доложены и обсуждены на IV Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (С.-Петербург, 2000), Русско-японском международном медицинском симпозиуме (Благовещенск, 2000), X-XVI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009), 2-ом Съезде российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), Международном симпозиуме «International Conference on Development Pharmacology» (Harbin, China, 2004), Международном симпозиуме «China-Russia International Conference on Pharmacology» (Harbin, China, 2005), XV мировом фармакологическом конгрессе «Pharmacology in the 21st Century: A Bridge between the Past and the New Molecular Frontiers» (Beijing, China, 2006), V Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2008), XVI мировом конгрессе базисной и клинической фармакологии «WorldPharma 2010» (Copenhagen, Denmark, 2010).
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседании Проблемной комиссии по фармакологии, клинической фармакологии и фармации Владивостокского государственного медицинского университета. По результатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.
Публикации:
По материалам диссертации опубликована 41 печатная работа, в том числе 1 монография, 36 статей, в том числе 16 в журналах, рекомендованных ВАК, 4 патента Российской Федерации.
Финансовая поддержка:
Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов РФФИ № 01-04-49413 «Сравнительная эффективность и механизмы сорбционной активности высокоэтерифицированных и низкоэтерифицированных пектинов», ДВО РАН – СО РАМН № 06-III-А-05-468 «Первичные фармакологические исследования, токсикологические испытания, стандартизация и разработка лекарственных препаратов на основе некрахмальных полисахаридов», РФФИ-ДВО № 09-03-98512 «Условия и механизмы образования комплексов наночастиц некрахмальных полисахаридов с ионами поливалентных металлов», Государственных контрактов в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: Государственный контракт № 02.512.11.2090 «Разработка фармакологических средств защиты человека от действия радионуклидов, токсических металлов и эндогенных метаболитов на основе биопрепаратов из морских животных и растений», Государственный контракт № 02.512.12.2043 «Разработка фармакологических средств на основе модифицированных некрахмальных полисахаридов для использования в терапии злокачественных новообразований».
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 327 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и метолов исследования, 8 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.
Работа содержит 53 рисунка и 41 таблицу. Библиография состоит из 468 отечественных и зарубежных источников.
Некрахмальные полисахариды: структура, свойства и фармакологи активность
Некрахмальные полисахариды (non-starch polysaccharides) представляют собой группу веществ, называемые в различных источниках как плохо перевариваемые углеводы (low-digestible carbohydrates) или как пищевые, или диетические, волокна (dietary fiber). Эти вещества являются предметом наук о питании, однако в последние годы появились многочисленные данные об их лечебных свойствах, что заставило фармакологов и фармацевтов обратить на них внимание как на возможные объекты для создания новых лекарственных средств и биологически активных добавок к пище.
Термин «пищевые волокна» (в англоязычной литературе - «dietary fiber») впервые использовал Хипсли в 1953 г. для обозначения растительных клеточных стенок, находящихся в пищевых продуктах, которые, как он считал, обеспечивают защитный эффект от токсемии при беременности [Hipsley Е.Н., 1953]. В 1971 г. Баркит высказал гипотезу о связи дивертикулеза, аппендицита и рака толстой кишки с низким потреблением грубых волокон в странах Запада [Burkitt D.P., 1971а, Ь], и уже в 1972 г. Троуэл вновь применил термин пищевые волокна при описании обнаруженной им закономерной зависимости частоты встречаемости ожирения, сахарного диабета и сердечно-сосудистых болезней от потребления волокон [Trowell Н., 1972а, Ь]. Он же определил пищевые волокна с точки зрения физиологии как часть пищи, которая произошла от клеточных стенок растений и которая очень плохо переваривается в организме человека, добавляя, что мясные и рыбные клеточные стенки перевариваются хорошо [Trowell Н, 1972а]. Он также давал другое определение - «это скелетные остатки растительных клеток, которые устойчивы к гидролизу ферментами человека» и считал, что пищевые волокна -это синоним неусваиваемым углеводам [Trowell Ы., 1972b]. Таким образом, в дефиниции одного термина отражаются по крайней мере три критерия -ботанический, физиологический и химический [Plaami S.P., 1997].
С химической точки зрения пищевые углеводы разделяют на «сахара» (моно- и дисахариды), олигосахариды и полисахариды. Главными компонентами пищевых волокон являются полисахариды. Международный союз чистой и прикладной химии (IUPAC) определяет полисахариды как углеводы с более чем 10-ю мономерными единицами, тогда как согласно British Nutrition Foundation [1990] олигосахариды включают до 20-ти мономерных остатков. Важную роль в определении физических свойств и способности полисахаридов образовывать ассоциации с другими полисахаридами и белками играют боковые углеводные цепи и конфигурация их гликозидных связей. Полисахариды с 1—»4 и 1—»6 а-гликозидными связями (крахмалы) гидролизуются амилазами слюнных и панкреатических желез млекопитающих, абсорбируются в тонкой кишке и таким образом весте с моно- и дисахаридами составляют так называемые доступные, или усваиваемые, углеводы в отличие от недоступных (неусваиваемых) углеводов, или некрахмальных, полисахаридов, которые могут подвергаться ферментной деградации микрофлорой толстой кишки до короткоцепочных жирных кислот (Asp N.-G., 1995].
Кроме некрахмальных полисахаридов, ряд олигосахаридов (рафиноза, стахиоза, вербаскоза), фрукто-олигосахариды, высокомолекулярные фруктаны (инулины), полиспирты (сорбит, ксилит, маннит и др.), полидекстроза, а также резистентный крахмал в большей или меньшей степени не расщепляются в тонкой кишке, ферментируются кишечной микрофлорой и физиологически имеют много общего с пищевыми волокнами. Более того, некоторые авторы к пищевым волокнам относят пентозаны, аминосахара грибов и членистоногих, неуглеводное соединение лигнин и неперевариваемые белки [Рыженков В.Е. и др., 1991]. Следовательно, термин пищевые волокна включает более широкий круг веществ, чем неусваиваемые углеводы и некрахмальные полисахариды. К наиболее изученным некрахмальным полисахаридам относятся пектины, альгинаты, каррагинаны, фукоиданы и хитозаны.
Пектины относятся к классу полисахаридов и входят в состав клеточной стенки высших растений, где они выполняют функции цементирующего материала для волокон целлюлозы. Многие растения содержат пектин в межклеточном слое между первичными клеточными стенками, участвуя в регуляции движения воды и клеточных соков [Muralikrishna G., Taranathan R.N., 1994]. Будучи частью клеточной стенки и основным компонентом срединной пластинки, пектины обеспечивают межклеточную адгезию в растительных тканях подобно коллагену в животных тканях. Содержание пектинов в растениях различается и составляет, например, в яблоках 0,5-1,6% (от сырой массы), в бананах - 0,1-1,2%, в плодах томатов — 0,2-0,6%, в ананасах - 0,04-0,13%, в мякоти лимонов - 2,5-4,0%, в свекле - около 1%, в корочках апельсинов - 3,5-5,5%) [Prasanna V. et al., 2007; Thakur B.R. et al., 1997]; зрелые головки подсолнуха содержат 3,3-5,0% водо-растворимого высокометоксилированного пектина и 11,9-14,3% нерастворимого низкометоксилированного пектина [Malathi V., Devegowda G., 2001]. Несмотря на то, что пектины встречаются практически во всех растениях, источники коммерческого пектина ограничены главным образом яблочными выжимками и кожурой цитрусовых плодов [Thakur B.R. et al., 1997].
Основная область использования пектинов - пищевая промышленность, и их применение разрешено во всех странах. Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам рекомендует пектин как безопасную добавку без ограничения приемлемого ежедневного потребления [FAO, 1969]. Во многих продуктах пектин используется как желеобразователь, загуститель, эмульгатор и стабилизатор [Булдаков А.С., 1996], а также как заменитель жира или сахара в низкокалорийных диетах. Одно из направлений применения пектинов связано с их использованием в фармацевтических технологиях [Macleod G.S. et al., 1999; SriamornsakP., 1999; SemdeR. et al., 2000].
Пектины как химические соединения относятся к классу полимерных углеводов (полисахаридов). Как и большинство полисахаридов, пектины являются гетерогенными в отношении и химической структуры и молекулярной массы. Их состав различается в зависимости от источника сырья, места произрастания растения, условий выделения и других внешних факторов [Chang К.С. et al., 1994]. Первичными блоками полимерной цепочки пектинов являются остатки D-галактуроновой кислоты, которые соединены друг с другом а(1- 4)-связью. Образованные таким образом цепочки насчитывают несколько сотен галактуроновых блоков. Коммерческие пектины имеют молекулярную массу около 80000, что соответствует приблизительно 400 остаткам галактуроновой кислоты [Mohnen D., 2008]. Между блоками галактуроновой кислоты на разных расстояниях друг от друга располагаются остатки L-рамнозы, соединенные с галактуроновой кислотой сс(1- 2)-связью, вследствие чего цепь пектина изгибается примерно на 90 и в целом имеет зигзагообразный вид. От основной линейной цепи рамногалактуронана берут начало боковые цепочки, состоящие из нейтральных Сахаров, чаще всего арабинозы и галактозы. Арабинановая, галактонановая и арабиногалактонановая боковые цепи соединены с рамнозой [1— 4] связью. Остатки арабинозы соединяются между собой [1— 5] связью, а галактозные - [1—» 4], хотя встречаются [1— 3] и [1— 6] связи. Встречаются также D-галактопираноза, L-арабинофураноза, D-ксилопираноза, D-глюкопираноза и L-фукопираноза и очень редко - D-апиоза, 2-0-метил-Б-ксилоза и 2-О-метилфукоза [Ridley B.L. et al., 2001; Mohnen, 2008]. Обычно боковые цепи из нейтральных Сахаров имеют длину от 8 до 20 молекул [Ridley B.L. et al., 2001], и на их долю приходится 10-15% массы пектина [O Neill М.А. et al., 2004].
Общая характеристика изучаемых препаратов
В работе были исследованы следующие вещества и препараты: 1. Альгинат натрия - полимер гулуроновой и маннуроновой кислот; содержание уроновых кислот - 77,3%, характеристическая вязкость - 1270 мл/г; молекулярная масса, вычисленная с помощью уравнения Марка-Куна-Хауинка, в среднем 403000 Да. 2. Альгинат кальция - полимер гулуроновой и маннуроновой кислот; содержание уроновых кислот - 77,3%, содержание кальция - 72,5%, 82,5% карбоксильных групп представлены в виде кальциевой соли, характеристическая вязкость - 1270 мл/г, молекулярная масса-403000 Да. Образцы солей альгиновой кислоты изготовлены из альгината натрия марки GRINDSTED Alginate РН, производства Danisco, Чехия. 3. Пектин, степень этерификации 60% - полимер галактуроновой кислоты; содержание чистого галактуронана в молекуле пектина - 78,0%, степень этерификации — около 61%, свободные и метилированные карбоксильные группы расположены в случайном порядке; характеристическая вязкость - 915 мл/г галактуронана, молекулярная масса, вычисленная с помощью уравнения Марка-Куна-Хауинка, в среднем 224000 Да. 4. Пектин, степень этерификации 40% - полимер галактуроновой кислоты; концентрация чистого галактуронана - 70,4%, степень этерификации - 40,1%. Свободные и метилированные карбоксильные группы расположены в случайном порядке, характеристическая вязкость - 533 мл/г галактуронана, молекулярная масса в среднем 70000 Да. Изготовлен в лаборатории фармакологии ИБМ ДВО РАН из пектина SC501, производства Herbstraight&Fох, Германия. 5. Пектин, степень этерификации 20% - полимер галактуроновой кислоты; концентрация чистого галактуронана - 66,6%, степень этерификации - 18,8%. Свободные и метилированные карбоксильные группы расположены в случайном порядке, характеристическая вязкость - 433 мл/г галактуронана, молекулярная масса в среднем 45000 Да. 6. Деэтерифицированный пектин — полимер галактуроновой кислоты; концентрация чистого галактуронана - 67,1%, степень этерификации — 1,2%. Свободные и метилированные карбоксильные группы расположены в случайном порядке, характеристическая вязкость 408 мл/г галактуронана, молекулярная масса в среднем 20500 Да. 7. Пектат кальция - кальциевая соль пектовой кислоты; содержание чистого галактуронана - 60,5%, степень этерификации -1,2%, характеристическая вязкость -160 мл/г галактуронана, 86% карбоксильных групп находятся в виде кальциевой соли, молекулярная масса в среднем 20500 Да. Очищенные образцы пектиновых веществ изготовлены в лаборатории фармакологии ИБМ ДВО РАН из пектина SC501, производства Herbstraight&Fox, Германия. 8. Зостерин - полимер галактуроновой кислоты, пектин из морской травы Zostera marina. Содержание чистого галактуронана в молекуле пектина - 74,8%, степень этерификации -5,7%, свободные и метилированные карбоксильные группы расположены в случайном порядке, характеристическая вязкость - 340 мл/г галактуронана, молекулярная масса в среднем 62000 Да. Образец изготовлен в лоаборатории фармакологии ИБМ ДВО РАН. 9. Хитозан - полисахарид (полимер Р-(1— 4)-2-ацетамидо-2-дезокси-0 глюкопиранозы), выделенный из панциря камчатского краба Paralithodes camtschatica. Образец хитозана предоставлен лабораторией неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН, г. Владивосткок. 10. Фукоидан - сложный сульфатированный полисахарид (полимер L фукозы), выделенный из бурой водоросли Laminaria japonica. Образец фукоидана предоставлен ТИНРО-Центр, г. Владивосток. 11. Каррагинан - сульфатированный полисахарид (полимер D- галактозы и ее производных), выделенный из морской красной водоросли Chondrus crispatus. Суммарный препарат Х- и к-каррагинанов предоставлен лабораторией неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. 12. к-каррагинан - сульфатированный полисахарид (полимер D- галактозы и ее производных), выделенный из морской красной водоросли Chondrus crispatus, предоставлен лабораторией неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. 13. -каррагинан - сульфатированный полисахарид (полимер D- галактозы и ее производных), выделенный из морской красной водоросли Chondrus crispatus, предоставлен лабораторией неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. 14. Активированный уголь. В экспериментах был использован активированный уголь в таблетках, произведенный ОАО «Ирбитский химфармзавод» (Ирбит) и ЗАО «Медисорб» (Пермь). 15. Полифепан. В экспериментах был использован препарат в гранулах производства АОЗТ «Сайптек» (Санкт-Петербург). 16. Микрокристаллическая целлюлоза. В экспериментах был использован препарат в таблетках «Анкир Б» производства ЗАО «Эвалар». 17. Антиструмин. В экспериментах был использован препарат в таблетках производства фармацевтической фабрики Дарница (Уркаина). 18. Медетопект. В экспериментах был использован препарат в таблетках производства Sanofi-Aventis (Франция).
Металлсвязывающую активность полисахаридов и препаратов сравнения изучали, используя оригинальное устройство, состоящее из стеклянной инкубационной емкости с фильтрующим элементом из капроновой сетки и стеклянной сборной емкости, снабженной поршнем. Сетка фильтра имела размер ячеи около 100 мкм, что обеспечивало быстрое прохождение рабочего раствора из одной емкости в другую. При этом частицы порошка или геля полисахаридов полностью удерживались в инкубационной емкости. В инкубационную емкость вносили 50 мг полисахарида с размерами частиц порошка 125-177 мкм. В сборную емкость добавляли от 0.5 до 3.0 мл 0,1 М раствора металла, 1 мл 1 М буфера с необходимым значением рН и дистиллированную воду до 5 мл. Для запуска процесса взаимодействия полисахарида с ионами металла инкубационную и сборную емкости соединяли друг с другом, и жидкую фазу перемещали поршнем в инкубационную емкость. Инкубационную емкость закрывали крышкой, и ее содержимое перемешивали в течение заданного промежутка времени. После этого жидкость оттягивали в сборную емкость обратным перемещением поршня и отбирали 2,5 мл супернатанта. Эксперименты проводили при комнатной температуре (23-25С) с постоянным перемешиванием инкубационной емкости (скорость встряхивания 50 rpm). Количество связавшегося металла вычисляли по формуле:
Оценка металл-связывающей активности некрахмальных полисахаридов
Сорбционная активность любых связывающих агентов не является постоянной величиной и зависит от многих факторов, определяющих кинетику сорбционного процесса [Jodra Y., Mijangos F., 2001; Schmuhl R. et al., 2001]. Количество связанных ионов металла зависит от времени взаимодействия сорбента и сорбата, которое необходимо для полного взаимодействия активных участков молекул [Jodra Y., Mijangos F., 2003], рН среды, в которой происходит взаимодействие [Kamiflski W., Modrzejewska Z.,1997], температуры и соотношения концентраций связывающего агента и металла [Voleski В., Holan Z.R., 1995; Voleski В. et al., 2001; Voleski В., 2003].
Целью проведенной серии экспериментов являлось определение сравнительной сорбционной емкости следующих некрахмальных полисахаридов: пектинов с различной степенью этерификации, пектата кальция, альгината натрия и альгината кальция, хитозана, каррагинана и фукоидана. С целью сравнения были проведены работы по оценке металлсвязывающей активности лекарственных препаратов-адсорбентов, таких как микрокристаллическая целлюлоза, активированный уголь и полифепан. Все исследования выполнены в условиях in vitro. Оценивалась кинетика сорбционной активности полисахаридов, зависимость сорбционной емкости от кислотности среды, величина сорбционной активности при различной концентрации металла в растворе. По окончании экспериментальных исследований проведен расчет основных сорбционных констант на основе математических моделей сорбции.
Оценка сорбционной емкости различных сорбентов представляет сложную задачу, в особенности, если эти вещества различной химической природы. Основным препятствием при оценке связывающей способности сорбента является зависимость сорбционной емкости от концентрации сорбата в растворе. В процессе связывания полисахариды связывают ионы сорбата. Этот процесс продолжается до тех пор, пока между концентрацией связанных ионов и концентрацией ионов, находящихся в растворе, не наступит определенное равновесие, характерное для каждого из видов сорбента [Volesky В., 2003]. Таким образом, при увеличении концентрации металла, взаимодействующего с полисахаридом, сорбционная емкость последнего, выраженная в количестве металла, связанного единицей массы сорбента, увеличивается.
Для сравнительной оценки сорбционной емкости различных сорбентов можно проводить эксперименты при строго одинаковой концентрации сорбата. Но это не дает представления о сорбционной активности при изменяющихся условиях. Поэтому для получения полной характеристики сорбционной активности любых сорбентов обычно используют методы математического моделирования сорбционных процессов с последующим расчетом констант сорбции [Jang L.K. et al., 1992; Schiewer S., Volesky В., 1997], которые являются наиболее важными характеристиками сорбционной активности любых веществ и характеризуют абсолютное и относительное количество активных центров в молекуле сорбента, выраженность аффинитета и прочность сорбционных связей.
Ценность использования математических моделей сорбции состоит не только в том, что они позволяют объективно сравнить эффективность разных сорбционных материалов, но и в том, что при их помощи можно получить сведения о механизме сорбционных процессов, поскольку каждая из перечисленных моделей сорбции лучше всего характеризует один из видов связывания. В практическом отношении важна информация о сорбционной эффективности различных сорбирующих материалов. Для корректного сравнения двух и более материалов необходимо проводить исследования в аналогичных условиях (при одних и тех же значениях рН, температуры ионной силы и т.д.).
Под эффективностью сорбента следует считать реальное поглощение (q) сорбентом исследуемого сорбата. Сорбенты можно сравнивать по значениям qmax, которые можно вычислить путем соотнесения модели изотермы Лэнгмюра к полученным экспериментальным данным. Этот подход осуществим, если кривая изотермы выходит на плато, которое соответствует максимальному насыщению сорбента. Графическое изображение процесса сорбции позволяет оценить эффективность сорбентов при различных концентрациях сорбата в среде. Один сорбент может быть более эффективным при низких концентрациях сорбата и менее эффективным при больших концентрациях, и наоборот. Кроме того, разные сорбенты могут различаться по эффективности при разных значениях рН. В любом случае при всех сравнениях важно удостовериться, что все внешние параметры сорбционной системы неизменны.
Важной характеристикой кривой изотермы сорбции является ее начальная крутизна. Кривая с крутым начальным наклоном указывает на тот факт, что сорбент обладает способностью к поглощению сорбата в диапазоне низких значений конечной (Cf) концентрации. Это означает, что сорбент обладает высоким сродством к связываемому материалу. На это сродство указывает коэффициент b в уравнении Лэнгмюра. Чем ниже значение Ь, тем выше сродство. Еще одним важным параметром, характеризующим связывающую активность, является прочность образующихся связей, которая косвенно отражается значением коэффициента Фрейндлиха (п).
В холе проведенных исследований по оценке металл-связывающей активности были использованы математические модели сорбции Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эмметт-Таллера. Ниже приведены коэффициенты связывания ионов металлов некрахмальными полисахаридами и препаратами адсорбентами с графическим изображением зависимости сорбционной емкости от концентрации металла в растворе (изотермы сорбции).
Влияние некрахмальных полисахаридов на выведение свинца из внутренних органов крыс
Выведение тяжелых металлов, уже находящихся в организме, представляет собой важную задачу фармакотерапии. В экологически неблагоприятных регионах или территориях, а также на загрязненных производствах, регистрируются массовые случаи хронического отравления тяжелыми металлами, что требует принятия тех или иных мер эфферентной терапии.
Эксперименты по оценке способности различных сорбентов выводить из организма крыс депонированный в органах и костях свинец проводили следующим образом. Животных в начале опыта разделяли на две группы. Первая группа -контрольная. Второй группе подопытных животных вводили энтерально с помощью зонда ацетат свинца в дозе 100 мг/кг/сут в течение 21 дня, после чего по пять животных из каждой группы умерщвляли декапетированием, органы и бедренные кости извлекали, промывали, взвешивали и определяли в них содержание свинца.
Остальные животные в течение последующих 7 дней находились на обычном рационе. После этого животных, получавших ацетат свинца, разделили на группы, каждой из которых вводили исследуемые полисахариды и сорбенты в дозе 0,5 г/кг/сут в течение 21 дня. По завершению эксперимента животных декапетировали под эфирным наркозом. Навески органов массой около 500 мг высушивали в термостате при температуре 60-80С в течение суток и определяли в них содержание свинца.
В бедренной кости за первый период эксперимента концентрация свинца увеличилась в среднем в 7,6 раза (табл. 10). В течение последующих 21 днейдостоверного изменения концентрации свинца обнаружено не было. После введения в течение 21 сут деэтерифицированного пектина в указанной выше дозе концентрация свинца достоверно снизилась в 1,9 раза. Введение пектата кальция в течение 3 недель эксперимента привело к достоверному уменьшению количества свинца в бедренной кости в 1,6 раза. Остальные исследованные препараты достоверно не изменяли количество свинца, депонированного в бедренной кости лабораторных животных (табл. 4.4). Лишь в группе животных, получавших альгинат кальция, наблюдали тенденцию к снижению уровня металла.
В почках за первый период эксперимента содержание свинца увеличилась с более чем в 70 раз (табл. 10). За последующие недели произошло уменьшение содержания свинца в почках, но, тем не менее, оно более чем в 35 раз превышало контрольные значения. Введения деэтерифицированного пектина в течение 21 сут в указанной выше дозе привело к уменьшению концентрации свинца в 1,6 раз. После введения в течение того же периода времени пектата кальция в такой же дозе концентрация свинца достоверно снизилась в 1,5 раза. Применение высокоэтерифицированного пектина (степень этерификации 60%) в той же дозе способствовало снижению уровня свинца в почках в 1,5 раза, что достоверно отличалось от показателей группы животных, не получавших исследуемые препараты. Также было зарегистрировано достоверное уменьшение (в 2,7 раза) концентрации свинца в почках в результате применения альгината кальция. Остальные препараты достоверно не снижали уровень свинца в почках (табл. 4.4).
В печени крыс за первый период эксперимента концентрация свинца увеличилась в 4,3 раза (табл. 10). В течение второй части эксперимента концентрация свинца достоверно уменьшилась, и в абсолютных значениях даже стала меньше, чем в контрольной группе. После введения в течение 21 суток полифепана и активированного угля и концентрация свинца осталась на уровне контрольной группы. В то же время в группах животных, получавших деэтерифицированный пектин, пектат кальция, высокоэтерифицированный пектин и альгинат кальция, уровень свинца достоверно возрос, соответственно в 3,5 раза, 2,5 раза, 1,8 и 1,4 раза (табл. 10).
В сердце крыс за первый период эксперимента концентрация свинца увеличилась в 1,8 раза (табл. 10). В течение последующих трех недель значительных изменений концентрации свинца обнаружено не было. После введения в течение 21 суток полифепана и активированного угля концентрация свинца оставалась на уровне показателей подопытной группы, получавшей в первый период эксперимента ацетат свинца и не получавшей некрахмальные полисахариды и сорбенты во второй период эксперимента. В группах животных, получавших деэтерифицированный пектин, пектат кальция, пектин со степенью этерификации 60% и альгинат кальция, концентрация свинца достоверно увеличилась, соответственно в 3,1 раза, 2,1 раза, 1,7 и 2,0 раза (табл. 11).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в результате введения исследуемых некрахмальных полисахаридов происходит ускорение выведения депонированных в костях и почках ионов металлов. Несмотря на то, что эксперименты выполнены только со свинцом, мы полагаем, что обнаруженные закономерности проявятся и в экспериментах с другими металлами соответственно сорбционной емкости применяемых полисахаридов. Препараты активированного угля и полифепана и на этой модели не проявили достаточной эффективности, не смотря на то, что выбранная доза, 0,5 г/кг массы тела животного, соответствует 30-35 г на взрослого человека с массой 60-70 кг, что значительно превышает терапевтические дозы (например, для активированного угля) либо соответствует максимально рекомендуемым (для полифепана).
![Изучение фармакологической активности производных пирроло[1,2-[А]]бензимидазола, проявляющих антиоксидантные и антирадиккальные свойства](/i/i/4463/390174.png "Изучение фармакологической активности производных пирроло[1,2-[А]]бензимидазола, проявляющих антиоксидантные и антирадиккальные свойства Ельцова Лариса Витальевна")
