Введение к работе
Актуальность проблемы. Препараты, воздействующие на иммунную систему (иммунотропные препараты), находят широкое применение в профилактике и лечении первичных и вторичных иммунодефицитных состояний, инфекционных, аллергических, аутоиммунных, онкологических заболеваний и многих других. Существует несколько классификаций иммунотропных препаратов, каждая из которых отражает определенный исторический этап в развитии иммунологии. Наиболее ранняя классификация была основана на понятии иммунологической реактивности, которую необходимо усиливать для повышения резистентности организма к инфекционным и онкологическим заболеваниям (иммуностимуляторы) или подавлять при аллергических патологиях (иммунодепрессанты). Позже была выделена еще одна группа, получившая название «иммуномодуляторы» [Лесков В.И.,1999; Пинегин Б.В., 2000; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000б]. К ним относятся природные и синтетические соединения, которые угнетают или стимулируют иммунный ответ, усиливая один из иммунологических механизмов и подавляя другие [Бакуридзе А.Д. и др., 1993; Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1996].
Существуют классификации иммуномодуляторов по их преимущественному влиянию на моноциты/макрофаги, В- и Т-лимфоциты, NK-клетки [Hadden J.W., 1993], а также препараты, воздействующие на неспецифические факторы защиты [Цигулёва О.А., 2005]; по генезу (экзогенные, эндогенные и химически чистые) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996]. В настоящее время выделяют 7 основных групп иммуномодулирующих препаратов: микробные, тимические, костномозговые, цитокины, нуклеиновые кислоты, растительные, синтетические [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2003].
В связи с представлением о дихотомии Т-хелперов в настоящее время термины «иммуностимулятор» и «иммуномодулятор» часто употребляют как синонимы. Препараты, регулирующие баланс Th1/Th2, позволили бы реализовать этиотропный подход в терапии дисфункций иммунной системы. Однако в настоящее время не существует иммуномодуляторов с доказанной селективной способностью изменять баланс Th1/Th2 клеток в желаемом направлении, разрешённых к медицинскому применению [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2000а].
В последние годы внимание многих исследователей привлекают работы по изучению иммунотропных свойств полисахаридов (ПС) растительного происхождения. Интерес к ним возник в связи с тем, что полисахариды, ранее считавшиеся инертными, оказались веществами с несомненной биологической активностью. Известно, что ПС растений обладают противовоспалительными [Moreno L. et al., 1998; Дроздова И.Л., Бубенчиков Р.А., 2005], антибактериальными [Johnston W.H. et al., 2001], антигипогликемическими [Sanchez de Medina F. et al., 1994] и противоопухолевыми свойствами [Ali A.M. et al., 1996], способностью изменять продукцию различных цитокинов, экспрессию молекул адгезии [Tzianabos A.O., 2000; Retini C. et al., 2001]. По сравнению с бактериальными и синтетическими ПС растений не имеют побочных эффектов и характеризуются низкой токсичностью, что даёт им значительные преимущества при разработке иммуномодулирующих, противоопухолевых и ранозаживляющих средств [Schepetkin I.A., Quinn M.T., 2006].
Известно, что ПС могут влиять на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток [Almeida G.M. et al., 2001; Saito K. et al., 2003; Li W. et al., 2004; Stephen T.L. et al., 2005]. Показано, что ПС, выделенные из Angelica gigas Nakai, стимулировали продукцию NO и провоспалительных цитокинов макрофагами через активацию NF-B/Rel, проявляли сильное ЛПС-миметическое действие [Jeon Y.J. et al., 1999]. ПС из Carthamus tinctorius L. стимулировали синтез различных цитокинов макрофагами, вызывали быструю деградацию IB, стимулируя NF-B, повышали экспрессию TLR4 [Ando I. et al., 2002]. Водорастворимые ПС фиалки душистой (Viola odorata L.) и мальвы низкой (Malva pusilla Smith.) проявляли противовоспалительное действие, угнетая стадии экссудации и пролиферации, уменьшая проницаемость капилляров [Дроздова И.Л., Бубенчиков Р.А., 2005]. Водорастворимая фракция полисахаридов из Glycyrrhiza uralensis Fish с молекулярной массой 10 кДа in vitro активировала макрофаги, повышая их способность к пиноцитозу, продукции оксида азота, ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-12 [Cheng A. et al., 2008].
В связи с изложенным выше, представлялось актуальным изучить иммунофармакологические свойства водорастворимых полисахаридов, полученных из фармакопейного сырья полыни горькой (Artemisia absinthium L.), клевера лугового (Trifolium pratense L.) и берёзы повислой (Betula verrucosa Ehrh.), сфокусировав внимание на их действии на приобретенный (адаптивный) иммунитет.
Цель исследования: изучить действие водорастворимых полисахаридов, выделенных из полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой, на Th1 и Th2 типы иммунного ответа, а также оценить их способность влиять на функциональное состояние макрофагов.
Задачи исследования:
-
Оценить действие водорастворимых полисахаридов полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой на Th1-зависимый иммунный ответ (на реакцию гиперчувствительности замедленного типа, на антителообразующую функцию лимфоцитов).
-
Оценить влияние водорастворимых полисахаридов полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой на Th2-зависимый иммунный ответ (на системную анафилаксию, на продукцию иммуноглобулинов классов E и G1).
-
Исследовать регуляторное действие ПС полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой на макрофагальные клетки (на продукцию оксида азота, ИЛ-12, ИЛ-10 и TNF-, на активность аргиназы макрофагов).
-
Изучить роль NF-B, p38, PI3K, MEK 1/2, cAMP в механизме действия комплекса водорастворимых полисахаридов клевера лугового, фракций полисахаридов клевера лугового и берёзы повислой на макрофаги.
Научная новизна. Впервые изучены иммунофармакологические свойства водорастворимых полисахаридов, выделенных из фармакопейного сырья полыни, клевера и берёзы. Экспериментально установлено, что эти вещества стимулируют Th1 тип иммунного ответа, действуя как на его клеточное звено, так и на гуморальное. Полисахариды полыни и клевера при курсовом введении животным подавляли Th2 тип иммунного ответа, ослабляя системную анафилаксию за счет ингибирования выработки иммуноглобулинов классов Е и G1. В основе иммуномодулирующего действия исследуемых полисахаридов полыни и клевера лежит их способность классически активировать макрофаги, что проявляется в усилении продукции оксида азота, TNF-, ингибировании активности аргиназы. Наибольшей активностью обладают полисахариды клевера, так как они многократно усиливали продукцию ИЛ-12 перитонеальными макрофагами мыши. Впервые исследовано участие молекул сигнальной трансдукции (NF-kB, р38, PI3К, MEK1/2 и cAMP) в NO-стимулирующем действии полисахаридов. Выявлено, что полисахариды активируют транскрипционный фактор NF-kB, в позитивной регуляции продукции оксида азота участвуют киназы р38 и PI3, в негативной – cAMP.
Практическое значение работы. Итогом данной работы является получение сведений об иммунофармакологических свойствах новых веществ – водорастворимых полисахаридов полыни, клевера и берёзы: влияние на иммунную систему in vivo, действие на лимфоциты и макрофаги in vitro, механизмы активационного воздействия на пострецепторном уровне. Полученные результаты позволяют обосновать использование растительных полисахаридов для коррекции нарушений иммунной системы, связанных с дисбалансом Th1/Th2. Значительным с точки зрения дальнейшей разработки лекарственного средства с иммуномодулирующей активностью является выявление вещества, способного многократно усиливать продукцию ИЛ-12 (полисахариды клевера).
Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, сентябрь 2008 г.), на «IV Съезде физиологов Урала» (Екатеринбург, сентябрь 2009 г.), на XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, май-июнь 2010 г.).
Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 9 научных статей, из них 7 – в журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК; по результатам проведённых исследований получен патент на изобретение.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 2 рисунками и 30 таблицами. Библиографический указатель включает 374 источника, в том числе 135 отечественных и 239 иностранных.
Животные. Эксперименты проведены на 527 животных: мышах линий BALB/c, С57ВL/6J и аутбредных крысах. Использованы животные обоего пола в возрасте 8-12 недель, полученные из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (1 категории согласно сертификату). Животные содержались в неполной барьерной системе при световом режиме 12:12 ч на стандартной диете (стерилизованный гранулированный корм), получали кипяченую питьевую воду, подкисленную соляной кислотой до рН 4-4,5.
Получение полисахаридов. Комплексы водорастворимых полисахаридов были выделены на кафедре химии СибГМУ по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975] из фармакопейного растительного сырья: из надземной части полыни горькой (Artemisia absinthium L.), из надземной части клевера лугового (Trifolium pratense L.), из листьев берёзы повислой (Betula verrucosa Ehrh.).
Стандартизация и характеристика образцов полисахаридов. Полученные комплексы водорастворимых полисахаридов были стандартизованы по содержанию углеводов спектрофотометрическим методом [Dubois M et al., 1956], содержанию белка методом Брэдфорда [Bradford M.M., 1976] и нуклеиновых кислот [Спирин А.С., 1958]. Выход ПС (% от массы воздушно-сухого сырья) составил: 2,77±1,39 (ПС из клевера лугового), 1,07±0,19 (ПС полыни горькой), 2,52±0,66 (ПС из берёзы повислой). Содержание углеводов (%) в исследуемых образцах было равным: 98,4±1,05 (ПС из клевера лугового), 99,0±1,06 (ПС из полыни горькой), 98,6±4,09 (ПС из берёзы повислой). Примеси белка и нуклеиновых кислот (%) в них были незначительными: 0,15±0,02 и 0,042±0,010 (ПС из клевера лугового), 0,61±0,11 и 0,059±0,002 (ПС из полыни горькой), 0,89±0,04 и 0,030±0,006 (ПС из берёзы повислой).
Компонентный состав и молекулярно-массовое распределение иссле-дуемых образцов определялись методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе Agilent 1100 со спек-трофотометрическим детектором (детекция при длине волны 190 нм), разделение проводилось на эксклюзионной колонке TSK-gel GMPXL 300x7.8mm («Supelco»), подвижная фаза – вода, 1,0 мл/мин. Молекулярная масса полисахаридов, входящих в состав исследуемых образцов, определялась по времени удерживания в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15-20 кДа, 40 кДа, 60-90 кДа, 110 кДа, 250 кДа и 500 кДа («Sigma-Aldrich», Великобритания). На спектре ВЭЖХ образцов, полученных из полыни горькой, присутствует 2 пика, соответствующих молекулярной массе 510 и 305 кДа, из клевера лугового – 2 пика, соответствующих 700 и 320 кДа, из берёзы повислой – 3 пика, соответствующих 680, 260 и 170 кДа.
Получение фракций полисахаридов. Комплексы водорастворимых ПС клевера лугового были разделены на кафедре химии СибГМУ методом фракционированного осаждения гидроксидом бария по уровню pH и молекулярно-массовому распределению на нейтральные ПС (PS-62-N300; молекулярная масса – более 300 кДа) и кислые ПС (PS-62-Ас100; молекулярная масса – от 100 до 300 кДа). Из комплексов водорастворимых ПС берёзы повислой в институте физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) методом ионообменной хроматографии были выделены фракции PS-B1-AG и PS-B2-RG. Обе фракции ПС берёзы представляют собой пектины, главная цепь которых построена из остатков галактуроновой кислоты, соединенных 1-4-гликозидной связью. Боковые цепи фракции PS-B1-AG построены из остатков арабинозы (3%) и галактозы (6%), а боковые цепи фракции PS-B2-RG – из рамнозы (32%) и галактозы (7%).
Выделение перитонеальных макрофагов. Выделение макрофагов осуществляли по модифицированной нами методике [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде, оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим, помещали по 1,5-2,0х106/мл в пластиковые чашки Петри, культивировали 2 ч (в атмосфере 5% СО2 и абсолютной влажности) в среде, содержащей 10% ЭТС, после чего собирали только прилипшие к пластику клетки и оценивали их жизнеспособность. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток.
Условия культивирования. Культуральная среда была следующего состава: RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС («Hyclone», Великобритания), 20 мМ HEPES («Sigma», США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), 50 мкг/мл гентамицина («Борисовский завод медицинских препаратов», Беларусь) и 2 мМ L-глютамина («Sigma», США). Культивирование проводили при 37С в атмосфере с 5% СО2 и абсолютной влажности.
Влияние полисахаридов на функциональную активность макрофагов. Макрофаги (2,5-3,0х106 клеток/мл), полученные, как описано выше, культивировали в присутствии 10 и 20 мкг/мл ПС, 1 мкг/мл ЛПС (серотип О111:В4, «Sigma», США), 5 и 10 мкг/мл мурамилдипептида – МДП (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem», Германия). Через 24 и 48 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нём количество нитритов и концентрацию цитокинов, а в клетках определяли активность аргиназы.
Исследование полисахаридов на наличие примесей эндотоксина. Для определения возможной примеси эндотоксина в исследуемых образцах полисахаридов в 96-луночный планшет помещали исследуемые образцы ПС и полимиксин В (10 мкг/мл, «InvivoGen», США), культивировали при 37С в атмосфере с 5% СО2 и абсолютной влажности в течение 1 часа. Затем в эти же лунки добавляли суспензию макрофагов (2,5-3,0х106 клеток/мл) и культивировали 48 ч, собирали из лунок надосадок и определяли концентрацию в нём нитритов. В качестве контроля использовали ЛПС.
Определение продукции оксида азота. Продукцию NO оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [Green L.C. et al., 1982]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли с использованием спектрофотометра при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.
Определение активности аргиназы. Активность аргиназы определяли по модифицированной нами методике [Munder M. et al., 1998]. Для этого макрофагипомещали в 96-луночные плоскододонные планшеты, через 24 и 48 ч от начала культивирования удаляли надосадок из лунок, клетки лизировали 0,1 мл 0,1% раствором тритона Х-100 («Sigma», США), инкубировали при постоянном встряхивании 10 мин при комнатной температуре. Затем для активации аргиназы в лунки вносили 0,1 мл 25 мМ раствора Трис-HCl («Sigma», США) и 0,05 мл 10 мМ раствора хлорида марганца («Реахим», Россия) и инкубировали при 56C 10 мин. После этого к 0,05 мл лизата добавляли 0,05 мл 0,5 M раствора L-аргинина («Sigma», США) с pH 9,7 и инкубировали при 37C 60 мин. Реакцию останавливали добавлением 0,4 мл смеси концентрированной серной и фосфорной кислоты с водой (в соотношении 1/3/7 по объему). Концентрацию мочевины в полученном растворе определяли с помощью тест-системы «Мочевина-450» («Био-ЛА-Тест», Чехия) согласно приложенному протоколу с использованием спектрофотометра (540 нм). За 1 единицу активности фермента принимали количество аргиназы, катализирующей образование 1 мкМ мочевины в минуту.
Получение супернатантов перитонеальных макрофагов для определения продукции цитокинов. Макрофаги помещали в 96-луночный планшет (2,5-3,0х106 клеток/мл), продукцию цитокинов стимулировали добавлением ЛПС (1 мкг/мл) и вносили изучаемые растительные ПС (20 мкг/мл). Через 24 ч собирали бесклеточный супернатант, разливали на аликвоты и хранили при -20С.
Определение количества ИЛ-12, ИЛ-10. Количественное определение цитокинов в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («R&D Systems», США) согласно прилагаемым протоколам.
Изучение роли p38 MAP киназы, PI3K, MEK 1/2, NF-B, cAMP в активации макрофагов. Были использованы следующие ингибиторы: SB203580 – ингибитор p38 MAP киназы («InvivoGen», США), LY294002 – ингибитор PI3 киназы («InvivoGen», США), ауротиомалат – ингибитор NF-B («Calbiochem», Германия), PD98059 – ингибитор MEK 1/2 («InvivoGen», США), 2',5'-дидеоксиаденозин – ингибитор cAMP («Calbiochem», Германия). Макрофаги культивировали с исследуемыми веществами в присутствии или отсутствии ингибиторов в указанных выше условиях 48 ч, после чего оценивали продукцию макрофагами оксида азота и активность их аргиназы.
Выделение мононуклеаров из периферической крови человека. Выделение мононуклеаров осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к жидкости для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich», Великобритания) с плотностью 1,077. Для этого реактив (4 мл) помещали в пробирки, затем осторожно наслаивали цельную кровь (4 мл), предварительно проинкубированную в термостате при 37С в течение 1 часа с добавлением гепарина (10 ЕД/мл). После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо в растворе. Полученные клетки трижды отмывали холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность.
Получение супернатантов мононуклеаров периферической крови человека для определения продукции цитокинов. Мононуклеары помещали в 96-луночный планшет (1х106 клеток/мл) и вносили изучаемые ПС (20 мкг/мл). В качестве контроля использовали ЛПС (1 мкг/мл). Через 24 ч собирали бесклеточный супернатант, разливали его на аликвоты и хранили при -20С.
Определение количества TNF-. Количественное определение цитокина в исследуемых супернатантах мононуклеаров осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-системы («Вектор-Бэст») согласно прилагаемому протоколу.
Оценка пролиферации лимфоцитов колориметрическим методом [Mosmann T., 1983]. Спленоциты интактных мышей культивировали 4 суток в круглодонных 96-луночных планшетах (2-5104 клеток/лунку) в указанных выше условиях в присутствии 20 мкг/мл ПС, 1 мкг/мл ЛПС (серотип О111:В4, «Sigma», США), 5 мкг/мл МДП. За 4 ч до окончания культивирования в лунки вносили 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, «Sigma», США), концентрация которого в лунках составляла 200 мкг/мл. Затем из лунок удаляли надосадок, а осадок растворяли диметилсульфоксидом (димексид, «Татхимфармпрепараты»). Абсорбцию полученных растворов замеряли при помощи многоканального спектрофотометра («Titertek», Финляндия) при длине волны 540 нм.
Иммунизация эритроцитами барана (ЭБ) [Бельская Н.В. и др., 2005]. Суспензию ЭБ («ЭКОлаб», Россия) предварительно трижды отмывали ФР, подсчитывали их количество и в объеме 0,2 мл внутрибрюшинно вводили по 5х106 – для определении числа АОК и титра антител, по 1108 – при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа. Контрольным животным таким же образом вводили 0,2 мл ФР.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [Belska N.V. et al., 2010]. На 5-е сутки после иммунизации ЭБ животным проводили разрешающую инъекцию ЭБ в подушечку задней лапы – «опытная лапа» (108 ЭБ в 0,02 мл ФР). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного ФР («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч. Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Величину реакции оценивали по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап и выражали в мг.
Определение антителообразующих клеток (АОК) в селезенке методом Ерне [Ierne N.K., Nordin A.A., 1963]. Для этого животных забивали на 5-е и 7-е сутки после иммунизации ЭБ, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным ФР, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар, «Difco», США), 0,2 мл 20%-ой взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента (ФГУП «НПО» «Микроген»», Россия). После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа.
Определение титра антител в сыворотке крови в реакции агглютинации [Хаитов Р.М. и др., 1999]. Для этого на 5-е и 7-е сутки после иммунизации животных забивали, вскрывали грудную полость и забирали кровь из сердца, после чего клеточные элементы осаждали центрифугированием. Полученную сыворотку раститровывали в 96-луночном планшете с шагом , добавляли ЭБ, инкубировали при 37С 2 ч и учитывали реакцию. За титр принимали то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдалась агглютинация.
Иммунизация овальбумином (OVA) [Oshiba A. et al., 1997]. Мышам вводили под кожу бедра OVA (100 мкг/мышь) с гидроокисью алюминия (5 мг/мышь, оба «Sigma») в качестве адъюванта в 0,1 мл ФР. При двукратных иммунизациях интервал между инъекциями составлял 14 суток. Мышам контрольной группы вводили по 0,1 мл ФР.
Реакция общей анафилаксии (гиперчувствительность немедленного типа) [Бельская Н.В. и др., 2010]. Данный тип реакции моделировали, используя иммунизированных OVA мышей линии BALB/c. В ответ на введение разрешающей дозы OVA (по 10 мкг в 0,1 мл ФР в ретроорбитальный синус) у животных развивалась анафилактическая реакция.
Определения содержания IgG1 и IgE иммуноферментным методом. Для определения иммуноглобулинов в сыворотке крови животных забивали цервикальной дислокацией через 7 суток после второго введения овальбумина и на 10 сутки после однократной иммунизации, забирали кровь из сердца, получали сыворотку, разливали на аликвоты и хранили при -20C. Содержание иммуноглобулинов в сыворотках измеряли иммуноферментным методом с использованием соответствующих тест систем («Immunology Consultants Lab.», США) согласно прилагаемому протоколу.
Непрямая реакция дегрануляции тучных клеток [Алексеева О.Г., Дуева Л.А., 1978; Радунская С.Ф., 1982]. Через 7 суток после второго введения овальбумина животных забивали, забирали кровь из сердца, получали сыворотку, разливали на аликвоты и хранили при -20C. Для получения тучных клеток крысам после забивки в брюшную полость вводили 5-8 мл подогретого до 37С ФР и собирали экссудат, стекающий с петель кишечника в смоченную гепарином пробирку через надрез брюшной стенки. На обезжиренные и предварительно окрашенные 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного предметные стёкла наносили по 0,03 мл взвеси тучных клеток, сыворотки подопытного животного и специфического аллергена (OVA). Препараты инкубировали в термостате при 37С в течение 15 мин, затем при помощи светового микроскопа подсчитывали количество клеток разной степени дегрануляции (всего 100 клеток в каждом препарате). Показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) подсчитывали по формуле:
,
где а, б, с, д – количество дегранулированных клеток с соответствующей степенью дегрануляции (слабо выраженная, умеренная, резкая и степень полной дегрануляции клеток).
Схемы введения водорастворимых полисахаридов. Оптимальная суточная доза ПС (10 мг/кг массы тела ) и схема введения ПС была подобрана в предварительных экспериментах. В качестве положительного контроля в экспериментах in vivo использовали ликопид в дозе 2 и 10 мг/кг. Препараты вводили внутрибрюшинно в 0,1 мл ФР.
Для изучения влияния ПС на иммунный ответ, индуцированный ЭБ, мышам вводили раствор ПС внутрибрюшинно 1 раз в сутки, начиная за 5 дней до иммунизации, всего 10 дней. Спустя 5 дней после иммунизации забирали материал для исследования. Мышам контрольной группы вводили то же количество ФР.
Введение ПС на фоне иммунизации OVA проводили по 2 схемам. При однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 10 раз, начиная за 5 дней до инъекции OVA, а при двукратной – животные получали ПС в течение 5 дней после каждого введения OVA и за 5 дней до первого. Через 5 дней после иммунизации забирали материал для исследования.
Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программного обеспечения Statistics 6.0. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса [Гмурман В.Е., 2001]. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака X и ошибку средней величины m. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.
