Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные методы терапии интоксикаций тяжелыми металлами .
1.1. Проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами и способы ее решения .
1.2. Влияние тяжелых металлов на здоровье человека: острые и хронические отравления .
1.3. Терапия и профилактика хронических и острых интоксикаций тяжелыми металлами .
1.4. Получение низкомолекулярных пектинов и альгинатов
Заключение .
Глава 2. Материалы и методы исследования .
2.1. Характеристика экспериментальных образцов .
2.2. Получение низкомолекулярных некрахмальных полисахаридов .
2.2.1. Гидролиз пектинов и альгинатов
2.2.2. Получение кальциевых солей пектинов и альгинатов
2.3. Стандартизация образцов пектинов и альгинатов .
2.4. Определение констант связывания кадмия, свинца и ртути некрахмальными полисахаридами и препаратами сравнения in vitro
2.5. Определение свинца в биологических образцах .
2.6. Характеристика экспериментальных животных .
2.7. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Разработка метода получения низкомолекулярных некрахмальных полисахаридов .
3.1. Получение пектинов .
3.2. Получение альгинатов
Глава 4. Изучение зависимости металлсвязывающей активности пектинов и альгинатов от молекулярной массы ...
4.1. Свинецсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro .
4.1.1. Кинетика связывания свинца пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой и препаратами сравнения .
4.1.2. Свинецсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой и препаратов сравнения при рН 2,0-6,0
4.2. Кадмийсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro
4.2.1. Кинетика связывания кадмия пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой
4.2.2. Кадмийсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой при рН 2,0-6,0...
4.3. Ртутьсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro .
4.3.1. Кинетика связывания ртути пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой и активированным углем
4.3.2. Ртутьсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой и активированного угля при рН 2,0-6,0 .
Глава 5. Влияние низкомолекулярных пектинов и альгинатов на экскрецию свинца у экспериментальных животных
Обсуждение
Выводы
Список литературы
- Влияние тяжелых металлов на здоровье человека: острые и хронические отравления
- Получение низкомолекулярных некрахмальных полисахаридов
- Кинетика связывания свинца пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой и препаратами сравнения
- Ртутьсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка новых лекарственных средств и поиск сырьевых источников фармацевтических субстанций представляют первостепенную задачу экспериментальной и клинической фармакологии. Актуальность этой задачи подчеркивается тем фактом, что в структуре фармацевтического рынка нашей страны отечественные производители лекарственных препаратов составляют менее 25%, и в ассортименте производимых препаратов крайне незначительна доля современных высокоэффективных лекарств [Хотимченко Ю.С., 2010]. Важным источником новых фармацевтических субстанций и лекарств являются природные соединения, их производные и синтетические аналоги, на основе которых, по разным оценкам, создается от 40 до 70% фармакологически активных веществ [Стоник В.А., Толстиков Г.А., 2008; Satheeshkumar N. et al., 2012; Bilecovа-Rabajdovа M. et al., 2013; Kaur K. et al. 2014]. Среди этих соединений обращают на себя внимание углеводные биополимеры, составляющие группу некрахмальных полисахаридов, к которым относят альгинаты, фукоиданы, каррагинаны и хитозаны, содержащиеся в основном в морских гидробионтах, и пектиновые вещества наземных растений и морских трав [Хотимченко Ю.С. и др., 2005; Caffall K.H., Mohnen D., 2009; Kumar V. et al., 2012].
Отличительным физиологическим свойством некрахмальных полисахаридов является их устойчивость к действию амилаз экзокринных желез млекопитающих, благодаря чему они не абсорбируются в тонкой кишке и не оказывают резорбтивные эффекты [Plaami S.P., 1997; Walsh M.C. et al., 2012]. Несмотря на это некрахмальные полисахариды обладают широким спектром фармакологических эффектов, таких как гастропротективный [Хасина Э.И. и др., 2003; Крылова С.Г. и др., 2009; Ефимова Л.А. и др., 2010], гепатопротективный [Сонина Л.Н., Хотимченко М.Ю., 2007; Li T.P., 2013; Hua Y. et al., 2014], нефропротективный [Хотимченко М.Ю. и др., 2008a, 2009], гиполипидемический [Metzger B.T. et al., 2009; Brouns F. et al., 2012; Jakobsdottir G. et al., 2013], иммуномодулирующий [Tsuji R.F. et al., 2003; Yoshikawa Y. et al., 2008] и некоторые другие. Благодаря низкой токсичности и возможности получения модифицированных производных с более высокой или принципиально новой фармакологической активностью растительные полисахариды рассматриваются в качестве потенциальных фармацевтических субстанций [Laurienzo P., 2010; Vasile C. et al., 2013; Pomin V.H., Mourаo P.A., 2014].
Вместе с тем, из обнаруженных эффектов некрахмальных полисахаридов наибольший интерес вызывает способность, прежде всего, пектинов и альгинатов взаимодействовать с тяжелыми металлами с образованием ионно-координационных связей с участием карбоксильных и гидроксильных групп пиранозных циклов уроновых кислот соседних полимерных цепей и катиона металла [Хотимченко Ю.С. и др. 2001а, б; Davis T.A. et al., 2003a, b; Khotimchenko M.Y. et al., 2007a, b, 2008a, b, 2010, 2012a, b; Khotimchenko Y.S. et al., 2012]. Это свойство позволяет использовать полиурониды для предупреждения всасывания токсичных металлов из кишечника в кровь и выведения депонированных в организме металлов, в том числе радионуклидов [Савченко О.В., Хотимченко Ю.С., 2002; Khotimchenko M.Y. et al., 2014]. Учитывая тот факт, что нативные полисахариды, выделенные из растений и водорослей, являются крупными молекулами, не способными абсорбироваться в кровь после орального применения, мы предположили, что уменьшение молекулярной массы полисахаридов увеличит их биодоступность и, возможно, повысит эффективность фармакологического воздействия. Для решения этих вопросов необходимо было на первых этапах изучить, как изменяются и в какую сторону фармакологические свойства низкомолекулярных полисахаридов в сравнении с их высокомолекулярными предшественниками.
Цель работы: исследовать металлсвязывающую активность низкомолекулярных пектинов и альгинатов и определить зависимость количественных параметров сорбции металлов от молекулярной массы полисахаридов.
Задачи работы:
1. Модифицировать метод получения низкомолекулярных пектинов и альгинатов.
2. Изучить кинетику связывания катионов свинца, кадмия и ртути низкомолекулярными пектинами и альгинатами и влияние на этот процесс рН реакционной среды.
3. Определить максимальную сорбционную емкость и аффинитет низкомолекулярных пектинов и альгинатов по отношению к катионам свинца, кадмия и ртути.
4. Провести сравнительный анализ сорбционных характеристик низкомолекулярных и высокомолекулярных пектинов и альгинатов, а также микрокристаллической целлюлозы, полифепана и активированного угля.
5. Исследовать влияние пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой на экскрецию катионов свинца в организме экспериментальных животных.
Научная новизна и теоретическое значение работы. В диссертационной работе проведен анализ зависимости сорбционной активности пектинов и альгинатов от их молекулярных масс. Экспериментальным путем in vitro определено влияние молекулярной массы пектинов и альгинатов на количественные параметры процесса сорбции катионов кадмия, свинца и ртути с применением математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммет-Теллера. Установлено, что с уменьшением молекулярной массы пектинов и альгинатов возрастает их связывающая активность по отношению к катионам свинца, кадмия и ртути. Наиболее эффективным сорбентом катионов кадмия и свинца является альгинат кальция с молекулярной массой 8,1 кДа, катионов ртути – пектат кальция с молекулярной массой 6,8 кДа. Важное значение для процесса сорбции катионов тяжелых металлов низкомолекулярными пектинами и альгинатами имеет зависимость от рН среды. Альгинат кальция с молекулярной массой 8,1 кДа проявлял наибольший эффект по выведению катионов свинца по сравнению с другими исследованными полисахаридами в экспериментах на животных.
Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют рекомендовать низкомолекулярные фракции пектинов и альгинатов для более глубокого изучения в качестве потенциальных лекарственных средств с целью выведения тяжелых металлов из организма. Модифицированный метод получения низкомолекулярных полисахаридов путем ступенчатого кислотного гидролиза позволяет получить пектины и альгинаты с молекулярной массой 1-10 кДа и 10-20 кДа, увеличить их выход и предотвратить деградацию полисахаридов за счет увеличения исходной концентрации и снижения времени контакта с гидролизующим агентом. Метод может быть использован для получения новых фармакологических субстанций на основе некрахмальных полисахаридов. Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре фармации ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России (акт внедрения от 02.12.13г).
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены и обсуждены на Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2010, 2013), научно-практической конференции «Первые Международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010), на отчетной конференции в рамках Целевой комплексной программы фундаментальных научных исследований в ДВО РАН на период 2008-2012 гг. «Получение, исследование и моделирование биогенных и биомиметических наноструктурных материалов» (Владивосток, 2010), на Международной виртуальной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Красноярск, 2012), на Международной научно-практической конференции «Теория и практика актуальных исследований» (Краснодар, 2012), на Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012 года), на XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации основных положений диссертации.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Взаимодействие низкомолекулярных полисахаридов с катионами свинца, кадмия и ртути происходит в соответствии с сорбционными моделями Лэнгмюра и Фрейндлиха. При снижении молекулярной массы пектинов и альгинатов увеличивается их связывающая активность по отношению к катионам свинца, кадмия и ртути.
-
Применение низкомолекулярных пектинов и альгинатов достоверно повышает экскрецию катионов свинца у экспериментальных животных по сравнению с высокомолекулярными полисахаридами.
Личный вклад автора. Автором выполнен основной объем работ по обобщению литературных данных по теме диссертации, разработан дизайн экспериментов, спланированы и проведены опыты по установлению металлсвязывающей активности in vitro и оценке влияния некрахмальных полисахаридов на экскрецию свинца in vivo, систематизированы, статистически обработаны и проанализированы экспериментальные данные. Метод получения низкомолекулярных полисахаридов модифицирован совместно со старшим научным сотрудником лаборатории фармакологии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН Ковалевым В.В.
Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 12 таблицами. Библиография состоит из 254 отечественных и зарубежных источников.
Влияние тяжелых металлов на здоровье человека: острые и хронические отравления
Резкие выбросы отравляющих веществ в окружающую среду наблюда-ются в случае техногенных катастроф, таких как авария на Чернобыльской АЭС и Фукусима-1, после которых радиоактивному загрязнению были под-вержены вода, воздух, почва и продукты питания [Evangeliou N. et al., 2014; Onishi Y., 2014]. Аварии на промышленных предприятиях приводят к массовым случаям острых отравлений среди их сотрудников и жителей прилегающих террито-рий. Симптомы острых интоксикаций зависят от способа поступления отрав-ляющего вещества в организм. При пероральных отравлениях первичные симптомы проявляются со стороны ЖКТ, к ним относятся тошнота, рвота, боли и диарея. Ингаляционные отравления возникают, например, при вдыха-нии паров ртути, в этом случае у пострадавших появляются кашель, одышка, бронхоспазм, развиваются пневмония, отек легких, а также поражение цен-тральной нервной системы (угнетение сознания вплоть до оглушения, сни-жение зрения и слуха). Отравления всеми без исключения тяжелыми метал-лами приводят к поражению печени и почек [Muhammad S et al., 2011; Ola-woyin R. et al., 2012; Liu X. et al., 2013; Rahman M.A. et al., 2014].
Хроническим интоксикациям отдельными тяжелыми металлами прису-щи более специфические симптомы. Описано массовое отравление кадмием жителей Японии, вызвавшее остеомаляцию, нефропатию, болезненность и переломы костей, получившее название болезни «Итай-Итай» [Nordberg D.F., 2009]. При хроническом кадмиозе поражаются мочевыводящая, половая и бронхолегочная системы, развивается анемия, повышается артериальное дав-ление, отмечаются остеопластические и остеопорозные изменения костной ткани. Доказана роль кадмия в индукции рака легких и почек у курящих, раз-витии патологии предстательной железы [McKelvey W., 2007; Wong W.W. et al., 2008; Ильинских Н.Н. и др., 2011].
Характерными симптомами интоксикации свинцом являются расстрой-ства пищеварения, потеря аппетита, острые боли в животе со спазмами абдо-минальных мускулов («свинцовые колики»), изменения в составе крови (свинцовая анемия). На более поздних стадиях проявляются такие симптомы как головокружение, потеря ориентации и проблемы со зрением. Специфиче-ское почернение («свинцовая линия») может появиться у основания десен. Возможен паралич («свинцовые судороги»), обычно затрагивающий в пер-вую очередь пальцы и кисти рук [Ouldali O. et al., 2013]. У детей наблюдают-ся повреждения головного мозга, сопровождающиеся слепотой или глухотой, которые в тяжелых случаях заканчиваются летальным исходом [Шаров П.О., 2005; Fraser S. et al., 2006; Gonick H.C., 2008; Clark C.S. et al., 2009].
При хронических поражениях ртутью наблюдаются эмоциональная не-устойчивость, раздражительность, снижение работоспособности, нарушение сна, дрожание пальцев рук, снижение обоняния, головные боли. Характер-ный признак отравления – появление по краю десен каймы сине-черного цве-та, разрыхленность и кровоточивость десен, гингевит и стоматит [Моисеенко В.Г. и др., 2004; Guan R., Dai H., 2009; Koh C. et al., 2009; Рукавишников В.С. и др., 2011]. При отравлениях органическими соединениями ртути (диэтил-меркурофосфатом, диэтилртутью, этилмеркурохлоридом) преобладают при-знаки одновременного поражения центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, желудка, печени и почек [Sarikaya S. et al., 2010]. Болезнь Минамата развивается при отравлении метиловой ртутью, ее основные про-явления – нарушения координации, шаткость походки, дизартрия, гипесте-зия, нарушение жевания, глотания. При более тяжелых формах – тремор, по-теря сознания, судороги.
Степень негативного влияния тяжелых металлов на организм зависит от химической формы, в которой токсикант попал в организм, дозы и продол-жительности воздействия, возраста и состояния здоровья пострадавшего [Lu-kacinova A. et al., 2011]. Хронические интоксикации малыми дозами тяжелых металлов могут проявляться головной болью, усталостью, снижением имму-нитета, что не всегда позволяет поставить точный диагноз и назначить лече-ние. У детей такие интоксикации приводят к дисбалансу эссенциальных эле-ментов, снижению уровня физического развития, повышению частоты ост-рых респираторных заболеваний, изменениям со стороны мочевыделитель-ной, нервной, пищеварительной, сердечно-сосудистой систем, показателей красной крови. Некоторые авторы связывают развитие рака у детей, прожи-вающих в урбанизированных зонах, с высоким уровнем загрязнения окру-жающей среды тяжелыми металлами [Absalon D., Slesak B., 2010]. Результа-ты недавних исследований элементного статуса у детей в возрасте от 1 до 8 лет с синдромом дефицита внимания и гиперреактивностью (СДВГ) показали вклад в патогенез этой патологии элементного дисбаланса [Llop S. et al., 2013]. К методам лабораторной диагностики, позволяющим установить точ-ную причину недомогания прибегают крайне редко.
В клинической токсикологии для оказания неотложной помощи при от-равлениях тяжелыми металлами находят препараты-комплексоны: «Унити-ол», «Купренил», «Натрия тиосульфат», «Сукцимер», «Тетацин-кальция», В состав этих соединений входят функциональноактивные группы, образую-щие с тяжелыми металлами хелатные связи. Димеркаптопропансульфонат натрия («Унитиол», «Зорекс») является комплексообразующим средством, оказывающим дезинтоксикационное дей-ствие, за счет активных сульфогидрильных групп, взаимодействующих с ка-тионами металлов и образующих с ними нетоксичные, водорастворимые со-единения. Применяется в виде раствора для парентерального введения, свя-зывает как тяжелые металлы, так и эссенциальные элементы [Bastrup-Madsen P., 1950; Mouret S. et al., 2013].
Пеницилламин («Купренил», «Артамин», «Бианодин») обладает высо-кой комплексообразующей активностью по отношению к металлам, главным образом к меди, ртути, мышьяку, свинцу, железу и кальцию за счет образо-вания с ними стойких комплексных соединений, растворимых в воде и выво-димых с мочой. Препарат уменьшает резорбцию тяжелых металлов из пищи и устраняет их избыток в тканях [Jang D. et al., 2011; Siatkowski R.M. et al., 2011; Bradberry S., Vale A., 2012 Naik R.M. et al., 2013]. Натрия тиосульфат обладает свойствами антидота за счет образования нетоксичных или малотоксичных соединений с солями тяжелых металлов, таких как неядовитые сульфиты мышьяка, ртути, свинца. При терапии ин-токсикации препарат назначают внутривенно.
Димеркаптоянтарная кислота («Сукцимер») и натрия кальция эдетат («Тетацин-кальция») обладают схожими с «Купренилом» и «Унитиолом» свойствами и показаниями к применению [Bradberry S., Vale A., 2012], но в России не применяются, так как данные препараты отсутствуют в Государст-венном реестре лекарственных средств. Существенными недостатками препаратов-комплексонов являются влияние на обмен эссенциальных элементов и быстрое выведение токсикан-тов, приводящее ко вторичному поражению почек и других внутренних ор-ганов. Поэтому данные препараты используют только при острых отравлени-ях тяжелыми металлами под постоянным контролем за состоянием пациента со стороны медицинского персонала. Описаны случаи применения высокомолекулярных пектинов и альгина-тов для лечения хронических отравлений тяжелыми металлами у детей и взрослых. В исследованиях Транковской Л.В. показан положительный эф-фект биологически активных добавок «Полисорбовит-50» на основе высоко-молекулярного пектина и «Детоксала-95» на основе высокомолекулярного альгината. У детей с нарушениями элементного гомеостаза наблюдались снижение содержания тяжелых металлов и улучшение состояния здоровья [Trankovskaya L.V. et al., 2002; Khotimchenko Y.S., 2003].
Получение низкомолекулярных некрахмальных полисахаридов
Образцы пектинов и альгинатов получали методом ступенчатого кислотного гидролиза в присутствии 0,5 М раствора соляной кислоты при температуре 90±0,5С. Данный метод позволяет получать фракции со средневесовой молекулярной массой 1-10 кДа и 10-20 кДа. Процесс получения пектатов кальция включал в себя следующие стадии: деэтерификацию пектина, получение пектовой кислоты, два этапа гидролиза продолжительностью по 2 ч каждый, фракционирование продуктов гидролиза по молекулярным массам. Получение альгинатов кальция модифицированных по молекулярной массе включало следующие этапы: перевод альгината натрия в альгиновую кислоту, проведение предварительного гидролиза, проведение основного гидролиза альгината, фракционирование по молекулярным массам.
Полученные в ходе гидролиза олигоурониды переводили в кальциевую форму путем реакции с эквивалентным объемом 1 М раствора хлорида кальция. Полученный осадок пектата кальция отделяли фильтрованием, промывали 70% этанолом и сушили при 80С.
Стандартизацию образцов проводили по таким физико-химических параметрам, как среднечисловая и средневесовая молекулярная масса и молекулярно-массовое распределение, массовая доля ангидро-D-галактуроной кислоты для образцов пектата, массовая доля альгиновых кислот для образцов альгината, массовая доля кальция.
Для установления молекулярно-массового распределения использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии и метод концевых восстанавливающих групп. Для определения средневесовой молекулярной массы олигоуронидов применяли хроматографическую систему Shimadzu LC-20 AD с рефрактометрическим детектором RID-10A и светорассеивающим лазерным детектором ELSD-LTII. Разделение фракций осуществляли на колонке с гидрофильным полимерным сорбентом Shodex Asahipak GS-320 7E. Для пектатов в качестве элюента использовали 50 мМ ацетатно-аммиачный буфер при скорости элюирования 0,7 мл/мин. Для альгинатов элюентом служил 0,1 М раствор нитрата натрия при скорости элюирования 0,9 мл/мин при температуре 35С. Для оценки результатов предварительно калибровали колонку по стандартам пуллуланов с молекулярной массой 1,2, 3, 5, 10 и 20 кДа. Образцы олигоуронидов и пуллуланов для проведения анализа готовили в концентрации 1 г/л. Молекулярную массу рассчитывали с помощью компьютерной программы 7GPC (Shimadzu, Япония). Хроматограммы исследованных образцов приведены на рисунках 9-12.
Метод определения среднечисловой молекулярной массы пектатов и альгинатов по концевым восстанавливающим группам основан на реакции восстановления двухвалентной меди олигоуронидами при нагревании в при-сутствии арсеномолибденовой кислоты. Продуктом данной реакции является молибденова синь, интенсивность окраски которой измеряли фотометриче-ски при 620 нм. Калибровочный график для расчетов строили в координатах: оптическая плотность при 620 нм – концентрация D-галактуроновой кисло-ты, мкМоль/л. В качестве стандарта использовали D-галактуроновую кислоту («Sigma», США). Среднечисловую молекулярную массу образца олигоуро-нида (Мn) в Да вычисляли по формуле: (2) , где Мn – среднечисловая молекулярная масса образца олигоуронида; m – масса навески олигоуронида, мг; W – массовая доля воды в образце олигоуронида; С – концентрация D-галактуроновой кислоты, установленная по калиб-ровочному графику, мкМоль/л; 0,907 – коэффициент пересчета D-галактуроновой кислоты в ангидро-D-галактуроновую кислоту; 0,884 – коэффициент пересчета олигоуронида натрия в полигалактуро-новую кислоту. Массовую долю ангидро-D-галактуроной кислоты в образцах пектата кальция определяли фотометрическим методом для фракции менее 20 кДа и титриметрическим методом для остальных фракций. Титриметрический метод неприменим для низкомолекулярной фракции в связи с ее частичным растворением в спирте при переводе в кислую форму полигалактуронида и, как следствие, возникновению погрешности в анализе. По этой причине для анализа пектата с молекулярной массой 6,8 и 15,5 кДа применяли фотометрический метод, основанный на образовании мета-гидроксидифенилом окрашенного соединения с продуктами деградаций ангидро-D-галактуроной кислоты в серной кислоте. Определению предшествовало построение калибровочного графика, в качестве стандарта использовали D-галактуроновую кислоту. Массовую долю ангидро-D-галактуроновой кислоты (X1), в пересчете на сухое вещество, вычисляли по формуле: (3) , где m – масса D-галактуроновой кислоты, установленная по калибровочному графику, мг; m1 – масса исследуемого продукта, мг; W – массовая доля воды в образце, %; 0,907 – коэффициент пересчета D-галактуроновой кислоты в ангидро-D- галактуроновую кислоту. Титриметрический метод определения массовой доли ангидро-D-галактуроновой кислоты в пектине основан на титровании свободных и метоксилированных карбоксильных групп в остатках уроновых кислот 0,1 М раствором натрия гидроксида в присутствии индикатора Хинтона в среде 70% этилового спирта. Определению предшествовало промывание образца кислотным спиртовым раствором (5 см3 концентрированной соляной кислоты в 100см3 70%-го спирта).
Для определения влияния молекулярной массы на кинетику взаимодействия пектинов и альгинатов с катионами тяжелых металлов и оптимального времени инкубирования проб, обеспечивающего полную сорбцию металлов исследуемыми образцами и препаратами сравнения, проводили эксперименты по изучению кинетики связывания металлов с сорбентами. С этой целью в емкость, снабженную магнитной мешалкой, помещали 0,25 г изучаемого сорбента, 10 мл буферного раствора для обеспечения необходимого рН, рассчитанный объем 0,1 М раствора исследуемого металла, эквивалентный количеству сорбента, и дистиллированную воду до 100 мл. Через установленные промежутки времени отбирали пробы по 10 мл, в которых после фильтрования определяли остаточное содержание металла. На основе полученных данных строили графики зависимости доли сорбированного металла в процентах от времени инкубации. За 100% принимали максимальное значение сорбционной емкости [Мыкоц Л.П. и др., 2010].
Оценку сорбционной активности образцов в отношении катионов свинца, кадмия и ртути проводили in vitro. Для этого в стакан, снабженный магнитной мешалкой, вносили рассчитанный объем 0,1 М раствора соли металла (Pb(NO3), Cd(NO3)2 или Hg(NO3)2), соответствующий его концентрации в растворе от 50 до 1200 мг/л, 1 мл 0,1 М ацетатного буфера со значением рН от 2,0 до 6,0 и 10 мл 0,25% суспензии исследуемого сорбента. По показаниям рН-метра корректировали значение рН среды добавлением 0,1 М раствора натрия гидроксида или азотной кислоты, после чего объем реакционной смеси доводили до 20 мл дистиллированной водой. Время инкубации при постоянном перемешивании составляло 60-120 мин при температуре 22-24С. После инкубации раствор со свободным металлом отделяли фильтрованием через гидрофильный фильтр Omnipore с диаметром пор 5,0 мкм. Определение остаточного содержания металла в жидкой фазе проводили комплексонометрически, и в качестве металлоиндикаторов использовали ксиленоловый оранжевый для кадмия и эриохром черный Т – для ртути и свинца.
Изучение количественных параметров сорбции тяжелых металлов пектатами и альгинатами кальция различной молекулярной массы осуществляли с использованием математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммет-Теллера (БЭТ).
По результатам пяти экспериментов, рассчитывали константы Лэнгмюра, Фрейндлиха и БЭТ. Для оценки релевантности моделей использовали коэффициент аппроксимации (R2), в соответствии с которым для описания изученных процессов наиболее подходящими оказались модели Лэнгмюра и Фрейндлиха. Математическая модель БЭТ позволяла получить результаты с достоверностью менее 90% для описания связывания исследованных металлов полисахаридными препаратами и энтеросорбентами (R2 0,90).
Кинетика связывания свинца пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой и препаратами сравнения
Изучению свинец-связывающей активности некрахмальных полисахаридов, олигоуронидов и препаратов сравнения предшествовали выявление влияния молекулярной массы образцов на кинетику их взаимодействия с катионами металла и выбор оптимального времени инкубации (глава 2.2). Для этого максимальную сорбционную емкость каждого образца в отношении катионов свинца, полученную в ходе соответствующего эксперимента, принимали за 100%, а количество металла, связанного сорбентом за 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 и 120 мин выражали в процентах от максимального значения. Результаты представляли в виде графиков.
На первом этапе взаимодействия, в течение первых 20 мин, концентрация металла в растворе снижалась резко, насыщение сорбента катионами составляло около 90%. Полное равновесие устанавливалось на 60-ой минуте взаимодействия. Дальнейшая инкубация не приводила к изменению остаточной концентрации катионов, что обусловило выбор оптимального времени взаимодействия образцов пектатов и альгинатов с катионами свинца (Рисунки 8, 9). Таким образом, кинетика взаимодействия некрахмальных полисахаридов с катионами свинца не зависела от молекулярной массы пектата кальция и альгината кальция.
Количественно данные по связыванию катионов свинца исследуемыми образцами использовали для построения изотерм сорбции на графиках по оси ординат откладывали сорбцию свинца, а по оси абсцисс – остаточную концентрацию металла. Форма полученных кривых соответствовала изотермам Лэнгмюра. Определение количественных параметров сорбции осуществляли с использованием математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммет-Теллера (БЭТ). Для подтверждения релевантности методов использовали коэффициенты достоверности аппроксимации. Их значения для математической модели БЭТ были значительно ниже 0,90, что указывало на невозможность дальнейшего использования данной математической модели. Для математической модели Лэнгмюра коэффициент аппроксимации R2 0,95, следовательно, данную модель можно использовать для установления коэффициентов сродства экспериментальных образцов к катионам свинца и показателей максимальной сорбционной емкости сорбентов. Коэффициент аппроксимации для модели Фрейндлиха был ниже, чем для модели Лэнгмюра (R2 0,90), но данная величина позволяла использовать его для характеристики сорбционного взаимодействия между исследуемыми сорбентом и сорбатом.
При изучении влияния рН на сорбционную емкость пектатов и альгинатов кальция различной молекулярной массы была выявлена общая закономерность: увеличение показателя максимальной сорбции с ростом рН от 2,0 до 6,0 (Таблицы 2-3). Данный диапазон рН охватывал рН желудка (1,5-2,0) и частично кишечника (5,6–7,9) здорового человека. При дальнейшем увеличении рН происходило образование гидроксида свинца, нерастворимого в воде, что значительно затрудняло течение сорбционных процессов. При рН ниже 2,0 все некрахмальные полисахариды вне зависимости от молекулярной массы седиментировались и теряли сорбционную активность, что делало нецелесообразным проведение опытов при данных значениях рН.
Максимальная сорбционная емкость альгината кальция 8,1 кДа при рН 6,0 была наибольшей среди трех образцов альгинатов кальция и превосходила в среднем в 1,2 и в 1,1 раза образцы альгината кальция 403 кДа и 18,0 кДа соответственно, при рН 4,0 в среднем в 1,2 и в 1,1 раза, при рН 2,0 – в среднем в 1,1 и 1,1 раза, соответственно (Таблицы 2-3).
Сравнительная оценка экспериментальных констант всех исследованных образцов показала, что наибольшей связывающей активностью в отношении катионов свинца при рН 2,0 обладал пектат кальция 6,8 кДа. Его максимальная сорбционная емкость превосходила таковую для альгината кальция 8,1 кДа, активированного угля, полифепана и микрокристаллической целлюлозы в среднем в 1,5, 12,5, 10,4, 9,8 раза, соответственно (Таблицы 2-3).
При рН 4,0 максимальная сорбционная емкость альгината кальция 8,1 кДа была наибольшей и превышала этот показатель для пектата кальция 6,8 кДа, активированного угля, полифепана и микрокристаллической целлюлозы в среднем в 1,1, 6,7, 5,9, 23,4 раза, соответственно. При значении рН 6,0 указанная закономерность сохранялась, показатель максимальной сорбционной емкости альгината кальция превосходил этот параметр для о пектата кальция 6,8 кДа, активированного угля, полифепана, микрокристаллической целлюлозы в среднем в 1,10; 5,39; 5,69 и 26,36 раза соответственно (Таблицы 2-3).
Методика определения кинетики связывания катионов кадмия была аналогична таковой для катионов свинца (глава 2.2). В первые 5 минут эксперимента образцы альгината кальция сорбировали около 80% металла. Для пектина этот показатель был несколько выше и в среднем составляло 88%. В дальнейшем процесс сорбции резко замедлялся, и полное сорбционное равновесие для исследованных полисахаридов достигалось через 60 мин.
Снижение молекулярной массы пектатов кальция и альгинатов кальция приводило к незначительному увеличению доли связанного металла в единицу времени, равновесие в пробах достигалось не ранее 60 минут.
Полифепан и микрокристаллическая целлюлоза не проявляли кадмий-связывающей активности при рН 2,0, 4,0 и 6,0, поэтому кривые сорбции для них не были построены. Активированный уголь при рН 6,0 незначительно связывал ионы кадмия.
Ртутьсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro
В ходе исследования кинетики сорбции способность связывать катионы ртути была выявлена у всех некрахмальных полисахаридов. Среди препаратов сравнения данным свойством обладал только активированный уголь, поэтому графики зависимости доли связанного металла от времени инкубации были построены только для этих сорбентов. Дальнейшие эксперименты с микрокристаллической целлюлозой и полифепаном не проводили, изотермы сорбции построены не были, параметры сорбции не рассчитывались.
Полученные для некрахмальных полисахаридов кривые свидетельствовали о незначительной зависимости кинетики процесса от молекулярной массы сорбента (Рисунки 27,28). На кривых, отображающих связывание катионов ртути альгинатами кальция с молекулярной массой 403,0, 18,0 и 8,1 кДа показано, что в первые 5 мин образцы сорбировали в среднем 75% от максимально возможного количества металла, к 40-й мин этот показатель достигал 95%. Пектаты кальция в тех же условиях сорбировал ртуть быстрее; за первые 5 мин связывалось около 80%, к 20-й минуте доля связанного металла от максимальной сорбционной емкости превышала 90%, полное равновесие наступило к 40-й минуте. Исследования кинетики сорбционного процесса позволило определить оптимальное время инкубации; для альгинатов кальция и активированного угля оно составило 60 мин, для образцов пектатов 40 мин (Рисунки 27-29).
Наибольшей сорбционной активностью в отношении катионов ртути обладал пектат кальция 6,8 кДа при рН 6,0. Данный показатель для образца 15,5 кДа был ниже в среднем в 1,2 раза, для образца 48,6 кДа – в среднем в 1,2 раза. Этот же показатель для альгината кальция 8,1 кДа так же превосходил показатель сорбции образца 18,0 кДа в среднем в 1,4 раза, образца 403,0 кДа – в среднем в 1,6 раза (Рисунки 30-35). С ростом рН от 2,0 до 6,0 происходило увеличение максимальной сорбционной емкости у всех исследованных образцов. Ее значение для пектата кальция 6,8 кДа при рН 6,0 превосходило аналогичный показатель при рН 4,0 в среднем в 1,3 раза, при рН 2,0 – в среднем в 2,7 раза, для образца 15,5 кДа в среднем – в 1,3 и 2,3 раза, для образца 48,6 кДа – в среднем в 1,6 и 2,3 раза, соответственно. На рисунках 30-36 q – количество ртути, связавшейся с образцом, мг/г; Ce – равновесная концентрация ртути в растворе, мг/л.
Ртутьсвязывающая активность альгината кальция 8,1 кДа при рН 6,0 была выше, чем при рН 4,0 в среднем в 1,6 раза, и чем при рН 2,0 в среднем в 3,0. Для образца альгината кальция 18,0 кДа сохранялась та же закономерность. Максимальная сорбционная емкость при рН 6,0 была выше в среднем в 1,58, чем при рН 4,0 и в среднем в 2,4 раза выше, чем при рН 2,0. Образец альгината кальция 403 кДа при рН 6,0 связывал ртути в среднем в 1,5 больше, чем при рН 4,0 и 3,3 раза больше, чем при рН 2,0, соответственно.
Максимальную сорбционную емкость в отношении катионов ртути при рН 2,0-6,0 наблюдали у пектата кальция 6,8 кДа, которая превосходила данную константу для альгината кальция 8,1 кДа при рН 2,0 в среднем в 1,7 раза, при рН 4,0 – в среднем в 1,6 раза, при рН 6,0 – в среднем в 1,3 раза (Таблицы 6-7). Для остальных констант сорбции четкой закономерности не было выявлено. Для пектата кальция 6,8 кДа при рН 2,0-4,0 константа сродства к катионам ртути была выше, а при рН 6,0 ниже, чем для альгината кальция 8,1 кДа. Коэффициент Фрейндлиха при рН 2,0-4,0 у пектата кальция 6,8 кДа был выше, а коэффициент интенсивности сорбции – ниже, чем у альгината кальция 8,1 кДа. При рН 6,0 обе константы Фрейндлиха пектата кальция 6,8 кДа превосходили аналогичные параметры альгината кальция (Таблицы 6-7).
Образцы некрахмальных полисахаридов вне зависимости от молекулярной массы превосходили по ртуть-связывающей активности активированный уголь при рН 6,0 (Рисунок 36). Максимальная сорбционная емкость пектата кальция 6,8 кДа в отношении катионов ртути достоверно выше, чем для активированного угля в среднем в 3,9 раза. Значение максимальной сорбционной емкости альгината кальция 8,1 кДа для катионов ртути превышает этот показатель у активированного угля, в среднем в 3,0 раза.
Свинец – один из распространенных промышленных ядов, занимающих по уровню мирового производства четвертое место после алюминия, меди и цинка. Ведущими отраслями, использующими свинец, являются электротех-ническая промышленность, приборостроение, полиграфия и цветная метал-лургия. В настоящее время в России свинцовая интоксикация среди профес-сиональных заболеваний занимает первое место [Бурак Ж.М. и др., 2005].
Свинец и его неорганические соединения в зависимости от их агрегатно-го состояния и характера контакта с ними могут проникать в организм через дыхательные пути (ингаляционный путь), желудочно-кишечный тракт (энте-ральный путь) и, частично, через кожные покровы. В производственных ус-ловиях наиболее распространенным путем поступления свинца в организм является ингаляционный (в виде пыли, аэрозоля и паров). В желудочно-кишечный тракт свинец и его соединения попадают преимущественно при бытовых интоксикациях, реже – на производствах, при несоблюдении правил личной гигиены [Mackay A.K. et al., 2013]. Поглощенный свинец поступает в кровь и распределяется во внутренних органах в количествах, зависящих от уровня кровоснабжения этих органов и их тропности к металлу. Свинец относится к ядам политропного действия, что объясняет многообразие патогенетических механизмов интоксикации. Ведущая роль среди них отводится расстройствам биосинтеза порфиринов, гемма, ключевых энзимов печени, почек и эритроцитов [Bellinger D.C. et al., 2013; Thuppi V., Tannir S., 2013].
Присутствующий в организме свинец разделяют на обмениваемую (10%) и стабильную (90%) фракции. К обмениваемой фракции относится свинец крови, на 95% связанный с эритроцитами, и свинец паренхиматозных органов (печень, почки). Содержание металла в них находится в состоянии динамического равновесия с уровнем свинца в крови. С точки зрения токси-ческого действия на организм существенное значение имеет обмениваемая фракция. К стабильной фракции относится свинец, находящийся в костях. Обмениваемая фракция свидетельствует о текущем либо недавнем контакте со свинцом, в то время как стабильная фракция отражает длительное кумуля-тивное воздействие.
