Изучение фармакологической активности производных пирроло[1,2-[А]]бензимидазола, проявляющих антиоксидантные и антирадиккальные свойства Ельцова Лариса Витальевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Биологическое значение свободно-радикальных процессов при патологических состояниях (обзор литературы) 12

1.1. Перекисное окисление липидов в патогенезе мембранных патологий 12

1.2. Лекарственные средства, регулирующие процессы свободно-радикального окисления 23

1.3. Заключение 29

Глава 2. Материалы и методы 30

2.1. Правила и рекомендации к проведению экспериментальных исследований 30

2.2. Перечень используемых реактивов и веществ 30

2.3. Список использованного программного обеспечения 36

2.4. Экспериментальные животные 36

2.5. Методы изучения антиоксидантных свойств веществ in vitro 37

2.6. Методы, применяемые для выявления структурных дескрипторов и зависимости степени активности от физико-химических свойств вещества 40

2.7. Методы изучения механизмов антиоксидантного действия наиболее активных соединений на моделях in vitro 42

2.8. Методы изучения влияния веществ на процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантный статус in vivo 45

2.9. Методы изучения гемореологических показателей крови 49

2.10. Экспериментальная модель гипоксии 52

2.11. Экспериментальная модель ишемии головного мозга 53

2.12. Экспериментальная модель токсического тетрахлорметанового поражения печени 56

2.13. Методы исследования острой токсичности веществ 60

2.14. Методы статистической обработки данных 60

Глава 3. Поиск антиоксидантных средств в ряду пирроло[1, 2- А]бензимидазолов 61

3.1. Антиоксидантные и антирадикальные свойства производных бензимидазолов 62

3.1.1. Действие изучаемых соединений на аскорбат-зависимое перекисное окисление липидов 62

3.1.2. Взаимодействие производных бензимидазола со стабильным радикалом 2,2-дифенил-1 -пикрилгидразилом 66

3.2. Исследование зависимости антиоксидантной антирадикальной и активности изучаемых веществ от их химической структуры 69

3.2.1. Зависимость антиоксидантной активности изучаемых веществ от их химического строения 72

3.2.2. Определение зависимости между антирадикальной активностью и химической структурой исследуемых соединений 94

3.2.3. Изучение зависимости антиоксидантной и антирадикальной активности веществ от их физико-химических свойств 110

3.3. Изучение острой токсичности 113

3.4. Исследование механизмов действия веществ, проявляющих антиоксидантную и антирадикальную активность 118

3.4.1. Антирадикальная активность соединений на модели окисления 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновой кислоты 119

3.4.2. Действие изучаемых веществ на гидроксильный радикал в модельной системе с аутоокислением люминола 123

3.4.3. Антиоксидантная активность соединений на модели хемилюминесценции желточных липопротеинов 127

3.5. Заключение 132

3.6. Выводы 134

Глава 4. Фармакологические эффекты соединений ру-756, ру-757, ру-792 на моделях патологических состояний, сопровождаемых активацией свободнорадикальных процессов 135

4.1. Активность веществ при острой гипобарической гипоксии 136

4.2. Противоишемическое действие изучаемых соединений 140

4.2.1. Изучение противоишемических эффектов соединений ру-756, ру-757 и ру-792 на модели 2-х сосудистой ишемии головного мозга 141

4.2.2. Исследование активности вещества ру-792 на модели тотального ишемического повреждения головного мозга 154

4.3. Изучение гепатопротекторной активности соединения ру-792 при остром поражении печени четыреххлористым углеродом 160

4.4. Заключение 180

4.5. Выводы 181

Глава 5. Обсуждение результатов 183

Глава 6. Выводы 204

Литература 206

Приложения 231

• Лекарственные средства, регулирующие процессы свободно-радикального окисления
• Методы, применяемые для выявления структурных дескрипторов и зависимости степени активности от физико-химических свойств вещества
• Исследование зависимости антиоксидантной антирадикальной и активности изучаемых веществ от их химической структуры
• Исследование активности вещества ру-792 на модели тотального ишемического повреждения головного мозга

Введение к работе

Актуальность проблемы. Свободно-радикальное окисление является необходимым процессом для нормального функционирования клеток, но вместе с тем это и один из универсальных механизмов их повреждения [Владимиров, 2000; Клебанов, 2006; Меньщикова, 2006, 2008]. Неконтролируемая генерация активных форм кислорода, кислородных метаболитов и сбой в функционировании антиоксидантной системы вызывают окислительное повреждение биомолекул, что приводит к дисфункции клеток и тканей организма [Шанин, 2003; Halliwell, 2005]. Окислительный стресс играет ключевую роль в патогенезе многих патологических состояний: гипоксических и ишемических повреждениях органов [Лукьянова, 2000; Гусев, 2001; Мирзоян, 2003; Atahan, 2007]; интоксикациях химическими агентами [Сейдахметова, 2005] и заболеваниях печени [Warner 2004; Fukai, 2005]; сахарном диабете и его осложнениях [Балаболкин, 2005; Дедов, 2006]; при интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, старении [Гусев, 1997; Анисимов, 2007; Harman, 2006]. Важную роль в клинической практике играют антиоксидантные средства, способные стабилизировать структуру и функции клеточных мембран и поддерживать структурный гомеостаз организма в условиях патологии [Gutterjdge, 2000; Арзамасцева, 2006]. Антиоксидантные препараты применяются как для профилактики, так и для лечения свободно-радикальных патологий [Сторожок, 2002; Pryor, 2006].

Однако, несмотря на широкий спектр веществ с антиоксидантным и антирадикальным действием в эксперименте, эффективных лекарственных средств, внедренных в клиническую практику, – незначительное количество. Кроме того, существующие препараты имеют ряд недостатков, связанных с особенностями биологического эффекта и его величиной, либо с токсичностью [Шанин, 2003; Бурлакова, 2006]. Поэтому поиск новых высокоэффективных антиоксидантных средств остается актуальным. Перспективным является поиск и разработка новых высокоэффективных антиоксидантных средств в ряду производных бензимидазола [Панченко, 1990; Островский, 1995; Анисимова, 2002; Косолапов, 2007]. Молекулу бензимидазола можно отнести к так называемым «привилегированным химическим структурам» [DeSimone, 2004]. Конденсированные производные бензимидазола – пирроло[1,2-]бензимидазолы – соединения со сложной -электронноизбыточной системой, обладающие более высоким антиоксидантным потенциалом действия [Анисимова, 1996; Спасов, 2001]. Все вышеперечисленное делает актуальным поиск и изучение высокоактивных веществ с антиоксидантным и антирадикальным спектром действия среди производных ряда пирроло[1,2-]бензимидазолов.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 01200116045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ государственной регистрации 01200609434), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета.

Цель исследования. Поиск и исследование механизмов действия на процессы пероксидации новых высокоэффективных антиоксидантных веществ среди производных пирроло[1,2-]бензимидазола; выбор наиболее активных соединений и доклиническое изучение их специфической активности на экспериментальных моделях свободно-радикальных патологий.

Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от 31.10.2003 г.).

Задачи исследования

1. Изучить антиоксидантные и антирадикальные свойства новых производных пирроло[1,2-]бензимидазола и препаратов сравнения на моделях in vitro.

2. Исследовать показатели острой токсичности наиболее активных соединений, рассчитать их терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные вещества для доклинического изучения специфической фармакологической активности.

3. Определить зависимость действия изучаемых соединений на свободно-радикальные процессы от их химических структур и физико-химических свойств.

4. Изучить защитные свойства наиболее активных антиоксидантов и препаратов сравнения на различных моделях с активацией процессов пероксидации при гипоксических и ишемических повреждениях головного мозга.

5. Исследовать влияние соединений, проявляющих наибольшую антиоксидантную и антирадикальную активность, на показатели перекисного окисления, поведенческую активность и неврологический статус у крыс при двухсосудистой ишемии головного мозга.

6. Изучить действия веществ с высокими антиоксидантными и антирадикальными свойствами на процессы перекисного окисления липидов у крыс при тотальном ишемическом повреждении головного мозга с реперфузией.

7. Исследовать влияние веществ с наибольшими антиоксидантной и антирадикальной активностью на показатели процессов пероксидации, биохимические процессы, реологические параметры крови и основные функциональные характеристики печени у крыс с токсическим тетрахлорметановым гепатитом.

Научная новизна. Впервые были получены данные о влиянии 25 оригинальных производных пирроло[1,2-]бензимидазола на свободно-радикальные процессы (СРП). Впервые была установлена взаимосвязь между структурой новых соединений и их антиоксидантной активностью (АОА). Были изучены механизмы действия наиболее активных веществ 8,9-дифенил-N¹-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-]бензимидазола, 8-метокси-9-фенил-N¹-морфолиноэтил-пирроло[1,2-]бенз-имидазола и 8-фенил-9-(3,5-ди-метокси-фенил)-N¹-морфолиноэтил-пирроло[1,2-]бензимидазола на различные звенья СРП in vitro и in vivo. Установлено, что антиоксидантная и антирадикальная активности (АРА) изученных соединений определяются физико-химическими свойствами их молекулы, показано, что АОА определяется стерическими параметрами молекулы, а АРА – также электронными и липофильными характеристиками молекулы. Получены данные о влиянии соединений пирроло[1,2-]бензимидазола на процессы пероксидации при гипоксических состояниях, ишемических поражениях мозга, токсическом повреждении печени.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска ингибиторов ПОЛ, проявляющих антиоксидантные и антирадикальные свойства, среди производных пирроло[1,2-]бензимидазола. На основании выявленной зависимости АОА и АРА соединений от их структуры была выведена математическая зависимость, описываемые двумя регрессионными уравнениями, с помощью которых можно прогнозировать с высокой степенью достоверности тот или иной тип активности у новых соединений. Отработана методология поиска и изучения новых АО веществ с использованием современных методов исследования, даны рекомендации по направленному синтезу гетероциклических соединений. Получены данные о наличии у соединения РУ-792 противогипоксических, противоишемических свойств, а также выявлена способность повышать детоксицирующую функцию печени, снижать образование продуктов перекисного окисления липидов крови и тканей печени на фоне тетрахлорметанового гепатита. Выявленные антиоксидантные и антирадикальные эффекты вещества РУ-792, превосходившего по активности препарат сравнения, определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований соединения с целью создания на его основе нового антиоксидантного средства.

Реализация результатов исследования. Выявленные закономерности между химической структурой и способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов у замещенных производных пирроло[1,2-]бензимидазола учитываются при синтезе новых веществ в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, в экспериментальной работе лаборатории органического синтеза НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пирроло[1,2-]бензимидазолы – перспективный класс соединений для поиска новых веществ, способных ингибировать процессы перекисного окисления липидов.

2. Наиболее выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства выявлены для вещества под лабораторным шифром РУ-792, влияющего преимущественно на активность липопероксильного радикала и ABTS-радикала.

3. Соединение РУ-792 по эффективности при острой гипобарической гипоксии, двухсосудистой ишемии головного мозга, тотальной ишемии-реперфузии головного мозга, а также при остром поражении печени четыреххлористым углеродом превосходит препарат сравнения мексидол.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались: на IX – XIII Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2004 – 2008 гг.); 62 – 66-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2004 – 2009 гг.); Международной научно-практической конференции молодых ученых «Вченi майнбутнего» (Одесса, 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ (из них две в журналах, рецензируемых ВАК).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на ___ страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 рисунками и 47 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2 – 4), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего ___ отечественных и __ зарубежных источника, и приложений.

Лекарственные средства, регулирующие процессы свободно-радикального окисления

В настоящее время накоплено достаточно данных о регуляторных и сиг-нальньгх функциях АКМ и АФК. Активные формы кислорода - физиологические метаболиты и образуются в клетках при нормальном обмене веществ. Они вырабатываются в эндоплазматическом ретикулуме в ходе работы микросо-мальной окислительной системы цитохрома Р45о ПРИ функционировании митохондрий с участием так называемого убисемихинона, в лизосомах и перокси-сомах, под действием мембранных НАДФ-зависимых оксидаз. Многие жизненно важные процессы, например генерация конечных продуктов пуринового обмена, распад дофамина, клеточный и гуморальный иммунитет, реакции фагоцитоза обязательно сопровождаются выработкой АМК [Шанин Ю.Н. и др., 2003; Ляхович В.В. и др.,,2005; Allen, 1999; Wolf, 2002]. Состояние процессов липопероксидации в условиях нормы определяет характер модификации фос-фолипидного бислоя биологических мембран, энергетического и пластического обеспечения клеток, активности транспортных и рецепторных систем мембран, возбудимость клетки и многие внутриклеточные метаболические процессы [Биленко М.В., 1989; Владимиров Ю.А., 2000, 2002; Шанин Ю.Н. и др., 2003; Kohen, 2002]. Высокая реакционная способность и короткое время жизни позволяют клетке использовать их в качестве сигнальных молекул. При избыточном образовании АФК в условиях патологии (ишемические повреждения, ней-родегенеративные заболевания, злокачественное перерождение клеток), губительно воздействующих на клеточные структуры, активные формы кислорода являются молекулами, несущими клетке сигнал о клеточной смерти [Дубинина Е.Е, 2001; Шанин Ю.Н. и др., 2003; Болдырев А.А., 2005].

Разрушающее действие АКМ является ранним и мощным и выходит на первый план в механизмах некробиоза в ряде специальных случаев, когда гибель клеток имеет определенную этиологию. Прежде всего, это ситуации когда резко ускоряется собственная продукция АКМ (окислительный стресс) - воспаление, интоксикационное повреждение, травматический шок, «краш-синдром», реперфузионый шок и другие состояния, сопровождающиеся активным распадом пуринов или повреждением митохондрий. Затем это ситуации, когда внешний агент сам превращает воду и органические молекулы в свободные радика-лы (радиация, различные боевые отравляющие вещества, озон, двухвалентное железо). Наконец, АКМ могут в изобилии образовываться в самом организме при метаболизме поступающих в него из внешней среды химических веществ (лекарства, различные токсины, например четыреххлористый углерод) [Янковский О.Ю., 2000; Федин А.И., 2002; Болдырев А.А., 2005; Чечет И.В. и др., 2006; Knight, 2000].

В результате многолетних исследований патофизиологической роли свободных радикалов был накоплен огромный, и порой противоречивый материал об их роли в развитии различных заболеваний. Тем не менее, сегодня можно с уверенностью утверждать, что АКМ занимают ведущее место в патогенезе многих патологических состояний. Неконтролируемая- генерация пероксидов имеет большое значение в развитии сердечно-сосудистой патологии - ишеми-ческой болезни сердца, артериальной гипертонии, атеросклероза [Голубев А.Г.,. 2003; Арутюнян А.В., Козина Л.С., 2009; Golden et al., 2002]. Окислительный стресс играет важную роль при ишемических и гипоксических повреждениях органов, и прежде всего головного мозга [Зозуля Ю.А. и др., 2000; Бизенкова М.Н. и др., 2006, 2008]. Процессы свободно-радикального окисления (СРО) лежат в основе патогенеза многих хронических заболеваний печени [Девяткина Т.А. и др., 2003; Камышников B.C., 2003]. Окислительный стресс рассматривается в качестве ведущего механизма при нейродегенеративных заболеваниях [Зозуля Ю. А. и др., 2000]. Избыточная активация практически всегда развивается при инфекционных заболеваниях [Дубинина Е.Е и др., 2006, Меньщикова Е.Б. и др., 2008]. Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) оказывают прямое деструктивное действие на внутренние органы при тяжелых травмах и обширных ожогах [Матвеев СБ. и др., 2005; Полутова Н.В. и др., 2007; Latha, Babu, 2001]. Образование свободных радикалов кислорода лежит в основе патогенеза радиационных поражений человека [Магира В. Ф., 2001]. Существует прямая зависимость частоты развития некоторых видов злокачественных новообразований от интенсивности процессов перекисного окисления липидов в организме [Шанин Ю.Н. и др., 2003; Brown, Bicknell, 2001; Valko et al., 2004]. Состояние окислительного стресса имеет место и при ряде физиологических состояний - интенсивных физических и психо-эмоциональных нагрузках, переутомлении, старении [Подколзин А.А. и др., 2000; Зенков Н. К. и др., 2001]. Одними из наиболее значимых патологий, которые могут привести к необратимым последствиям и гибели организма, являются различные повреждения центральной нервной системы и печени.

Известно, что мозг весьма чувствителен к окислительному стрессу в силу особенностей состава вещества мозга и высокого потребления кислорода [Гуг сев Е.И., Скворцова В.И., 2001, 2002]. В патогенезе гипоксии или ишемии мозга окислительный стресс, гиперпродукция свободных радикалов, продуктов ПОЛ играют роль необходимого звена процесса, активного механизма деструкции мембран и гибели нейронов [Скороход А.А., 2004]. Поэтому проблема восстановления функций нервных клеток после гипоксического или ишемического повреждения остается актуальной для современной экспериментальной и клинической нейрофизиологии.

Гипоксия - это универсальный экстремальный фактор, сопровождающий как некоторые физиологические, так и многие патологические состояния организма. Особенно чувствительны к недостатку кислорода клетки центральной нервной системы. Являясь строгим аэробом, они могут функционировать без кислорода всего несколько минут, после чего начинаются необратимые структурные изменения, приводящие к их гибели [Лукьянова Л.Д., 2000; Власова И.Г., Торошин В.И., 2004].

Методы, применяемые для выявления структурных дескрипторов и зависимости степени активности от физико-химических свойств вещества

Антирадикальная активность изучалась по методу J. Glavind [Glavind, 1963]. Использовался спиртовой раствор стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ»), который имеет максимум поглощения при длине волны 517 нм, исчезающий при добавлении антиоксиданта. Антирадикальную активность определяют по падению оптической плотности. Вещества изучались в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкмоль/л. В качестве препаратов сравнения были выбраны фенольный жирорастворимый антиоксидант - дибунол, водорастворимый аналог токоферола - тролокс, а также водорастворимый антиоксидант — мексидол, вводимые в пробу в аналогичных концентрациях.

Спиртовой раствор ДФПГ готовили таким образом, чтобы экстинкция при длине волны 517 нм составила 0,5. Замеряли исходную экстинкцию, добавляли изучаемое вещество и далее измеряли оптическую плотность через 5 минут на спектрофотометре Apel PD-303UV (Япония) при 517 нм в стандартных кюветах с длиной оптического пути 1 см. После измерения добавлялся концентрированный 0,1н раствор сс-пирогаллола в объеме 0,05 мл, который инициировал процесс окисления ДФПГ» до полного окончания реакции. Рассчитывали дельту оптической плотности по отношению к пирогаллолу. Активность вещества сравнивали с контрольными показателями пирагаллола, который полностью подавляет радикал ДФПГ».

Для наиболее активных соединений и препаратов сравнения были экспериментально определены величины ИК5о (ингибирующая концентрация, подавляющая процесс пероксидации на 50%) с использованием метода регрессионного анализа в программе Microsoft Excel (пакет Office ХР, Microsoft, США).

Выявление структурных дескрипторов соединений с АОА проводилось с использованием компьютерного программного комплекса «Микрокосм» 3.0а, основанного на исследовании зависимостей «структура-свойство» методами теории распознавания образов [Васильев П.М., 2006]2. Были детально изучены физико-химические свойства молекул исследуемых веществ с целью дальнейшего построения классической регрессионной модели Хэнча [Голендер В.Е., Розенблит А.Б., 1978]. Для этого были рассчитаны следующие параметры:

На первом этапе были построены модели молекул изучаемых веществ. Молекулы были оптимизированы методами квантовой химии и молекулярной механики, реализованной в программном обеспечении CS Chem3D 8.0. Были посчитаны парциальные заряды атомов и сумма их абсолютных значений. Кроме того, были рассчитаны молекулярная рефракция и липофильность.

Показатели липофильности (Log Р) в виде логарифма коэффициента распределения вещества в системе «октанол-вода» рассчитывались с использованием различных схем фрагментарного приближения [Vellarkad N.V. et al., 1989]. Таким образом, были рассчитаны липофильность молекулы для веществ в виде основания; липофильность радикала R] у первого атома азота у производных пирроло[1,2-а]бензимидазола и у девятого атома азота для производных имидазо[1,2-а]бензимидазола; липофильность радикалов R3 и R2 у восьмого и девятого углеводородных атомов в пиррольном кольце соответственно и радикалов R3 и R2 у второго и третьего атомов углерода в имидазольном кольце соответственно, а также квадраты всех этих показателей.

Заряды на атомах рассчитывались с использованием расширенного метода Хюккеля (ЕНТ) с предварительной оптимизацией конформации [Кларк Т., 1990]. Были рассчитаны суммарные заряды молекулы для веществ в виде основания, суммарный заряд радикала Ri у первого атома азота производных пир-роло[1,2-а]бензимидазола и у девятого атома азота производных ряда имида-зо[1,2-а]бензимидазола; суммарный заряд радикалов R2 и R3 у девятого и восьмого углеводородных атомов в пиррольном кольце соответственно и радикалов R2 и R3 у второго и третьего атомов углерода в имидазольном кольце соответственно, а также квадраты всех этих показателей.

В качестве стерического параметра использовалась молекулярная рефракция (MR), значения которой рассчитывались с использованием классической аддитивной схемы в различных модификациях. Молекулярная рефракция отражает степень поляризуемости молекулы в электромагнитном поле [Amp, Gordon, 1987]. В частности, были рассчитаны: молекулярная рефракция для веществ в виде основания, молекулярная рефракция радикала Rj у первого атома азота (производные пирроло[1,2-а]бензимидазола) и радикала R\ у девятого азотистого атома (производные имидазо[1,2-а]бензимидазола); молекулярная рефракция радикалов R3 и R2 у восьмого и девятого углеводородных атомов в пиррольном кольце соответственно; молекулярная рефракция радикалов R2 и R3 у второго и третьего атомов углерода в имидазольном кольце соответственно; а также квадраты всех этих показателей.

На втором этапе был проведен пошаговый регрессионный анализ зависимости антиоксидантной активности исследуемых веществ от изучаемых физико-химических параметров молекул соединений. На каждом последующем шаге отбирались регрессии с максимальным значением коэффициента корреляции. Таким образом поочередно добавлялись все столбцы с переменными. В результате опять отбирались максимальные показатели коэффициента корреляции, что дало нам возможность построить многопараметровое уравнение (двух-, трех-, четырехпараметровые зависимости и т.д.). Количество повторов манипуляции равнялось 12 (три точки на одну переменную), что согласовалось с целью достижения статистически значимого соотношения числа переменных и числа анализируемых точек. В результате было выведено регрессионное уравнение зависимости физико-химических параметров молекулы от проявляемой активности соединений.

Исследование зависимости антиоксидантной антирадикальной и активности изучаемых веществ от их химической структуры

Опыты были выполнены на 50 белых неинбредных крысах-самцах массой 200-400 грамм. Животные содержались на стандартном пищевом рационе в условиях вивария (см. п. 2.4.), на момент проведения экспериментов животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было.

Забой животных проводился согласно требованиям, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1997). Ишемию создавали лигированием общих сонных артерий [Мирзоян Р.С. и др., 2000] под кетаминовым наркозом, который вводили внутрибрюшинно в дозе 80 мг/кг. Вещества РУ-756, РУ-757, РУ-792 и препарат сравнения мексидол вводили крысам внутрибрюшинно за 30 минут до оперативного вмешательства в изо-антиоксидантных дозах 5,4; 9,8; 8,2 и 122,4 мг/кг соответственно. Группам контрольных животных - контроль-ишемия и ложнооперированный контроль — вводили в эквивалентном объеме физиологический раствор. В ходе эксперимента регистрировали выживаемость животных на 1, 2 и 3-е сутки после проведения билатеральной окклюзии, изучали уровень двигательной активности и неврологический статус, а также исследовали характер поведения крыс в тесте «открытое поле». Неврологический статус животных оценивался по суммарной 12-ти бальной системе. Каждая реакция оценивалась, исходя из возможного максимального количества баллов, равного 2-м - нормальные (2 балла), сниженные (1 балл) или отсутствующие (0 баллов) рефлексы. Рассматривались следующие рефлексы - реакция отдергивания хвоста и лапки, реакция вздрагивания на звуковой раздражитель, хватания передними лапами, переворачивания, роговичный рефлекс [Буреш Я., Бурешова О., 1991]. Показатели локомоторной активности регистрировали с помощью акто-метра («Ugo Basile», Италия). Крыса помещалась в камеру размером 37x27x27 см с прозрачным верхом и полом из 30 стальных перекладин, расположенных на равном расстоянии и изолированных друг от друга. Регистрацию результатов проводили с помощью прилагаемого принтера. Двигательная активность регистрировалась в течение 5 мин и оценивалась в условных единицах.

Также исследовали реакцию свободного поведения крыс в тесте «открытое поле». Для этого животных помещали на 3 мин в равномерно освещенный ринг диаметром 1 м и высотой 80 см, размеченный на квадраты 15x15 см с отверстиями на пересечении квадратов - «норками». Регистрировали латентное время выхода из центрального квадрата, горизонтальную активность - число пересеченных периферических квадратов, вертикальную активность - число «стоек», поисковую активность — число заглядываний в «норки», «груминг» -уход за кожей и шерстью и количество болюсов.

После забоя животных методом декапитации через 3-е суток после операции проводили забор тканей мозга и крови. Ткани взвешивали и гомогенизировали на холоде в 10 объемах физиологического раствора. Для удаления крупных частиц, создающих мутность, гомогенат центрифугировали при 1500 об./мин на центрифуге ОГШ-3 (Россия) в течение 10 мин. Последующие определения проводились в супернатанте.

В крови и тканях мозга крыс определяли содержание малонового диаль-дегида и диеновых конъюгатов, а также активность антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы по методикам как описано ранее в данной главе. Модель тотальной ишемии головного мозга Опыты были выполнены на 62 белых неинбредных крысах обоего пола массой 250-350 грамм. Животные содержались на стандартном пищевом рационе в условиях вивария (см. п. 2.4.) и на момент проведения экспериментов животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было. Забой животных проводился согласно требованиям, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1997). Вещество РУ-792 вводили внутрибрюшинно за 30 минут до оперативного вмешательства в изоантиоксидантной дозе (8,2 мг/кг), препаратом сравнения на данной модели был препарат мексидол, который также вводили в аналогичной дозе (122,4 мг/кг), полученных в исследованиях на кафедре фармакологии. Ишемию создавали путем наложения лигатур (окклюзоров) на общие сонные артерий под наркозом хлоралгидратом (внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг массы животного) в течение 30 минут. Предварительно у животных проводился забор крови из яремной вены из расчета 1 мл крови на 200 г массы животного, для создания артериального давления 80/60 мм рт. ст. Затем проводилась 30-ти минутная реперфузия путем удаления окклюзоров [Мирзоян Р.С., 2006]. Забой проводили через 30 минут и 24 часа после начала реперфузии. После забоя животных методом декапитации проводили забор органов и крови. Ткани взвешивали и гомогенизировали при охлаждении в 10 объемах физиологического раствора. Для удаления крупных частиц, создающих мутность, гомогенат центрифугировали при 3000 об./мин на центрифуге ОПН-3 (Россия) в течение 10 мин. Все последующие определения проводились в су-пернатанте. В крови и тканях мозга животных определяли концентрацию малонового диальдегида и активность антиоксидантных ферментов СОД и ГП по методам, описанным ранее в данной главе.

Исследование активности вещества ру-792 на модели тотального ишемического повреждения головного мозга

В положении С9 пиррольного кольца (радикал R2) у веществ, производных пирроло[1,2-а]бензимидазола могут быть третметильный, фенильный, оксифенильный, диоксифенильный, хлорфенильный, диметоксифенильный радикал или радикал отсутствовать вообще. Установлено, что чаще у наиболее активных веществ (АОА свыше 5 баллов) встречался в данном положении фенильный (42,9%) (РУ-547, РУ-546, РУ-548, РУ-756, РУ-754, РУ-757) и диметоксифенильный (27,3%) (РУ-791, РУ-792, РУ-793) радикалы, однако и у веществ слабоактивных или неактивных (АОА 3 или менее 3 баллов), как правило, в этом положении заместителем чаще был фенил (в 80% случаев). Вероятнее всего, наличие или отсутствие того или иного радикала в данном положении кольца не является строго определяющим для наличия выраженных антиоксидантных свойств соединений. В положении С8 гетероциклического кольца у соединений ряда пирроло[1,2-а]бензимидазола (радикал R3) могут находиться третметильный, фенильный, оксифенильный, диоксифенильный, хлорфенильный, метоксифенильный, диметоксифенильный радикалы или заместитель отсутствовать вообще. Выявлено, что доля присутствия радикала у активных веществ (АОА от 5 баллов и выше) наиболее высока для фенильного радикала -50% (РУ-543, РУ-548, РУ-756, РУ-754, РУ-792, РУ-794, РУ-760), в меньшей степени у метоксифенильного и хлорфенильного радикалов - 28,6% (РУ-541, РУ-757, РУ-791, РУ-758) и 14,3% (РУ-547, РУ-793) соответственно. У слабоактивных или неактивных веществ в данном положении кольца чаще был третметильный заместитель - у 40% соединений.

У изучаемых веществ ряда имидазо[1,2-а]бензимидазола в 1-ом положении имидазольного кольца - незамещенный атом азота, у 3-го атома углерода - водород и у 2-го атома углерода гетероциклического кольца фенильный, хлорфенильный, третметильный, оксифенильный или хлорфенильные заместители (радикал R2). У наиболее активных веществ этого класса заместителем в данном положении (радикал R2) были либо фенил (РУ 63) либо хлорфенил (РУ-285), однако присутствие в структуре данных радикалов было характерно и для неактивных веществ этого класса соединений. Далее более детально рассмотрим зависимость активности от химической структуры по рядам. Выделив три основных ряда веществ, основываясь на характере заместителя в N1-положении или №-положении гетероцикла: соединения с диэтиламиноэтильным, пиперидиноэтильным и морфолиноэтильным радикалами, являющиеся производными или пирроло[1,2-а]бензимидазола или имидазо[1,2-а]бензимидазола соответственно. К группе веществ с диэтиламиноэтильным радикалом у атома азота в гетероцикле относятся производные пирроло[1,2-а]бензимидазола РУ-546, РУ-547, РУ-548, РУ-756 и их структурные аналоги имидазо[1,2-а]бензимидазолы РУ-63, РУ-13 и РУ-1193. У всех соединений группы пирроло[1,2-а]бензимидазола у 9-го атома углерода гетероцикла заместителем является фенильное кольцо. В положении С8 цикла третметильный, хлорфенильный и фенильный радикалы. Исходя из полученных данных, выяснено, что наибольшей антиоксидантной активностью обладало вещество РУ-547, имеющее хлорфенильный радикал в положении С пиррольного кольца (АОА 7 баллов), замещение радикала на третметильный (РУ-546, АОА 6 баллов, ИК5о 1,10 мкмоль/л) или фенильный (РУ-548 и РУ-756, АОА 6 баллов, ИК50 соответственно 1,23 и 1,32 мкмоль/л) приводило к чуть заметному снижению активности до 6 баллов. При этом все вещества данного ряда были высокоактивны (АОА 6 и 7 баллов) независимо от природы радикала, что еще раз подтверждает зависимость эффекта от наличия пиррольного кольца в структуре и, возможно, диэтиламиноэтильного радикала (табл. 7). При смене пиррольного кольца на бензимидазольное активность, как правило, падает - так у вещества РУ-13 эффективность составила менее 3-х баллов сравнительно веществ РУ-548 и РУ-756 с АОА 6 баллов, имеющих пиррол, это отмечается и у РУ-1193 (АОА менее 3-х баллов) относительно РУ-547 (АОА 7 баллов). Однако стоит отметить, что в ряду имидазо[1,2-а]бензимидазолов есть высокоактивное вещество — РУ-63, что, возможно, объясняется наличием фенильного заместителя в структуре (табл. 7).

К ряду веществ с пиперидиноэтильным радикалом в положении N1 (пиррол [1,2-а] бензимидазолы) или N9 (имидазо[1,2-а]бензимидазолы) гетероциклического кольца относятся вещества под лабораторным шифром РУ-746, РУ-748, РУ-541, РУ-542, РУ-543 (ряд пирроло[1,2-а]бензимидазолов) и РУ-17, РУ-126, РУ-127, РУ-140 (ряд имидазо[1,2-а]бензимидазолов). Установлено, что наибольшую активность (АОА 7 баллов) у пирроло[1,2-сс]бензимидазолов проявили вещества, не имеющее у 9-го атома углерода в кольце никакого заместителя, а в 8-м положении либо метоксифенильный радикал (РУ-541, ИК5о 0,84 мкмоль/л), либо незамещенный фенил (РУ-543, ИК50 0,82 мкмоль/л). С заменой данных радикалов на ациклический третметильный заместитель эффективность веществ резко уменьшалась - так, РУ-542, имеющее только третметильный радикал в положении С гетероцикла, неактивно вообще (АОА менее 3 баллов) (табл. 7). Введение в структуру в положение 9-го углеродного атома фенильного радикала приводило к снижению активности веществ в отношении подавления свободно-радикальных процессов. Вещество РУ-748 с третметильным радикалом в восьмом положении пиррольного кольца и с фенильным заместителем - в девятом — обладало средневыраженной антиоксидантной активностью - АОА 4 балла, его аналог РУ-746, но имеющий солевой остаток (сульфатную соль) был слабоактивен (АОА 3 балла). Таким образом, возможно, что наличие фенильного или метоксифенильного радикала в положении С обуславливает достаточно высокий уровень антиоксидантной активности.

Похожие диссертации на Изучение фармакологической активности производных пирроло[1,2-[А]]бензимидазола, проявляющих антиоксидантные и антирадиккальные свойства

Местнообезболивающая активность производных индола и имидазо[1,2-а]бензимидазола в сочетании с вискоэластиком визитоном-ПЭГ при эпибульбарной и внутрикамерной анестезии глазаКиселев Александр Владимирович

Направленный поиск новых блокаторов 5-НТ3-рецепторов среди прооизводных индола и бензимидазола и изучение их фармакологических свойствКолобродова, Наталья Александровна

Обезболивающие свойства конденсированного производного бензимидазолаШтарёва Дарья Михайловна

Фармакокинетические свойства нового обезболивающего средства производного бензимидазолаРащенко Андрей Игоревич

Направленный поиск и фармокологические свойства веществ с антиоксидантной активностью среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазолаТибирькова Елена Викторовна

Направленный поиск и фармакологические свойства веществ с антиоксидантной активностью среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазолаТибирькова Елена Викторовна

Сравнительное изучение психотропных свойств и аспектов механизмов действия Нейроглутамина и его композиций с органическими кислотамиЧернышева, Юлия Владимировна

Экспериментальное изучение фармакологических свойств солей гуминовых кислотБузлама Анна Витальевна

Изучение эндотелиопротекторных свойств флавоноидов при экспериментальном сахарном диабетеСлиецанс, Анна Альбертовна

Сравнительное изучение гастропротекторных свойств антигипоксантов разного химического строения (экспериментальное исследование)Крюкова, Надежда Олеговна