Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы . 18
1.1. Исторические этапы изучения гуминовых веществ 19
1.2. Определение, классификация и физико-химические свойства гуминовых веществ
1.3. Образование гуминовых веществ в природе и промышленные способы получения
1.4. Биологические свойства и экосистемные функции гуминовых веществ
1.5. Перспективы использования солей гуминовых кислот для разработки лекарственных препаратов 36
Заключение обзора литературы 55
Глава 2 Материалы и методы исследования 60
2.1. Объекты исследования – изучаемые фармакологические вещества (соли гуминовых кислот) 60
2.2. Сведения о препаратах сравнения, препараты и реактивы, использованные в экспериментальных доклинических
исследованиях 63
2.3. Описание используемой в исследовании тест-системы 67
2.4. Этические и правовые нормы доклинического исследования 69
2.5. Патологоанатомические и гистологические методы исследования 70
2.6. Методы токсикологических исследований 72
2.6.1. Методы изучения острой токсичности 72
2.6.2. Изучение кумулятивных свойств 74
2.6.3. Методы изучения хронической токсичности 75
2.6.4. Оценка аллергизирующих и местнораздражающих свойств . 77
2.6.5. Методы изучения эмбриотоксического и тератогенного действия 81
2.7. Модели и методы изучения специфической активности 82
2.7.1. Модели для изучения дезинтоксикационных и гепатопротекторных свойств 82
Гексеналовый сон 82
Мединаловый сон 83
Интоксикация клозапином 84
Интоксикация окисленной олеиновой кислотой 85
Острая интоксикация мезоксалилмочевиной 86
Токсический гепатит, вызываемый четыреххлористым углеродом . 87
2.7.2. Модели для изучения гипогликемической и антидиабетической активности . 87 Тест толерантности к глюкозе . 87 Аллоксановый сахарный диабет . 88 Стрептозоциновый сахарный диабет . 89
2.7.3. Модели для изучения противовоспалительных, анальгетических и регенераторных свойств 90
Тест уксусные корчи 90
Электрокожное болевое раздражение 91
Отек лапы крыс 92
Асептический формалиновый абсцесс 93
Термический ожог кожных покровов 94
2.7.4. Модели оценки адаптогенной, актопротекторной и поведенческой активности 96
Тест «принудительное плавание» 96
Нормобарическая гиперкапническая гипоксия 97
Острый иммобилизационный стресс 97
Тест «открытое поле» 100
Модель эвристических решений для оценки психотропной активности 101
2.7.5. Методы выявления ульцерогенного действия и модель для оценки гастропротекторных свойств 105
Выявление наличия ульцерогенного действия 105
НПВС-гастропатия 106
2.7.6. Модели клеточного уровня для изучения мембранопротекторных свойств 108
Методы биотестирования на инфузориях Paramecium caudatum . 108
Метод регистрации эритрограмм кислотного и гипоосмотического гемолиза 109
2.8. Методы лабораторных исследований 115
2.9. Математические методы обработки данных 118
Глава 3 Токсикологические исследования препаратов солей гуминовых кислот . 120
3.1. Физико-химические свойства солей гуминовых кислот . 121
3.2. Изучение острой токсичности солей гуминовых кислот . 123
3.2.1. Острая токсичность солей гуминовых кислот при однократном внутрижелудочном введении . 123
3.2.2. Острая токсичность солей гуминовых кислот при парентеральном введении 126
3.3. Определение наличия кумулятивного действия солей гуминовых кислот 142
3.4. Изучение хронической токсичности солей гуминовых кислот 146
3.5. Изучение местно-раздражающего и аллергизирующего действия солей гуминовых кислот 173
3.5.1. Конъюнктивальная проба 173
3.5.2. Метод накожных аппликаций 179
3.6. Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия солей гуминовых кислот 182
Глава 4 Изучение дезинтоксикационных и гепатопротекторных свойств солей гуминовых кислот 187
4.1. Скрининг дезинтоксикационной и гепатопротекторной активности в тесте гексеналовый сон 187
4.2. Изучение дезинтоксикационных свойств в тесте мединаловый сон.. 191
4.3. Изучение дезинтоксикационных свойств при
острой интоксикации клозапином 192
4.4. Изучение дезинтоксикационных свойств при интоксикации окисленной олеиновой кислотой 195
4.5. Изучение дезинтоксикационных свойств при
острой интоксикация мезоксалилмочевиной 198
4.6. Изучение дезинтоксикационных и гепатопротекторных
свойств при токсическом гепатите, вызываемом
четыреххлористым углеродом 202
Глава 5 Изучение гипогликемической и антидиабетической активности солей гуминовых кислот 214
5.1. Скрининг гипогликемической активности на модели
глюкозо-толерантного теста на здоровых животных 214
5.2. Изучение гипогликемической активности лигногумата на здоровых животных 221
5.3. Изучение антидиабетических свойств на модели аллоксанового сахарного диабета 226
Глава 6 Изучение противовоспалительных, анальгетических и регенераторных свойств солей гуминовых кислот 247
6.1. Скрининг анальгетической активности в тесте уксусные корчи 247
6.2. Изучение анальгетических свойств на модели электрокожного болевого раздражения 251
6.3. Изучение противовоспалительных свойств на модели отека лапы крыс 255
6.4. Выявление наличия ульцерогенного действия солей гуминовых кислот 275
6.5. Изучение регенераторных и противовоспалительных свойств гумата леонардита на модели термического ожога кожных покровов 277
Глава 7. Изучение адаптогенной и актопротекторной активности солей гуминовых кислот 296
7.1. Скрининг адаптогенной и актопротекторной активности в тесте «принудительное плавание» 296
7.2. Изучение адаптогенной и актопротекторной активности лигногумата в тесте «принудительное плавание» 300
7.3. Изучение антигипоксантных свойств лигногумата на модели нормобарической гиперкапнической гипоксии 307
7.4. Изучение адаптогенных свойств лигногумата на модели острого иммобилизационного стресса 312
Глава 8 Изучение гастропротекторных свойств солей гуминовых кислот 334
8.1. Изучение гастропротекторных свойств на модели НПВС-гастропатии 334
Глава 9. Изучение мембранопротекторных свойств солей гуминовых кислот на клеточном уровне 344
9.1. Скрининг биологической активности солей гуминовых кислот на тест-системе инфузорий Paramecium caudatum 344
9.2. Изучение мембранопротекторных свойств солей гуминовых кислот на тест-системе мембран эритроцитов 348
Обсуждение результатов исследований 364
Выводы 374
Практические предложения 375
Список литературы
- Определение, классификация и физико-химические свойства гуминовых веществ
- Модели для изучения дезинтоксикационных и гепатопротекторных свойств
- Определение наличия кумулятивного действия солей гуминовых кислот
- Изучение дезинтоксикационных свойств при интоксикации окисленной олеиновой кислотой
Определение, классификация и физико-химические свойства гуминовых веществ
Гуминовые вещества являются полимерами сложной структуры и состава [45, 52, 115, 151, 210, 245, 281, 282, 236, 245, 246, 247, 288], молекулярная масса находится в пределах 500–200 000 Да. Для фульвокислот молекулярная масса составляет 10 000 – 15 000 атомных единиц массы, а для гуминовых кислот соответственно от 20 000 – 30 000 до 100 – 150 000 атомных единиц массы. Известно, что размер и конфигурация частиц определяют растворимость, а так же способность к миграции и возможность поглощения гуминовых веществ, клетками растений, животных и микроорганизмами. Молекулярная масса гумусовых кислот, кроме того, определяет в некоторой степени их способность к связыванию ионов металлов, например по литературным данным основную часть ионов кадмия связывает фракция гуминовых кислот с молекулярной массой 1 000–10 000 Да [52].
Гуминовые вещества представляют собой высокомолекулярные соединения ароматической, гетероциклической, алициклической, гидроароматической природы, замещенные алкильными цепями разной длинны нормального и изостроения, и включают непредельные связи с различными функциональными группами [52, 131, 170, 223, 266].
В гуминовых веществах, выделенных из природных объектов, проявляется значительное разнообразие по элементному составу – углерод 40– 60%, кислород 30–40%, водород 3–6%, азот 3–5%, сера до 0,7–1,2%, фосфор до 0,5%, катионы металлов, и в том числе микроэлементы [276]. В отличие от гуминовых кислот, фульвокислоты более окислены, чем другие гумино-вые вещества и характеризуются пониженным содержанием углерода (до 40%) при более высоком содержании кислорода. Известно, что общее количество углерода, находящегося в составе гуминовых веществ в почвах, торфах и углях, почти в четыре раза превосходит то количество углерода, которое содержится в органическом веществе всех растений и животных на планете [131]. В общем виде брутто-формула гумусовых кислот представляется таким образом: CxHyNzOpSqMr (А1203)1 (Si02)m (Н20)п, где х, у, z, р, q, 1, m, n - стехиометрические коэффициенты, а М - ионы металлов [130].
Известно, что в составе гумусовых кислот присутствует более 10 типов различных функциональных групп [52, 115, 116, 117], в том числе: - положительно заряженные - аминогруппы -NH2, амидные, пептидные, иминные, - отрицательно заряженные - карбоксильные -СООН, метоксильные, гид-роксильные - спиртовые, фенольные -ОН, хинонные =С=О и гидрокси-хинонные, альдегидные, кетонные.
Карбоксильные, фенолгидроксильные и аминогруппы в структуре фульво- и гуминовых кислот являются наиболее важными и реакционно-способными, способствуя в частности комплексообразованию с ионами металлов [11, 97, 124, 130, 292]. Химическое поведение гуминовых кислот в основном определяется кислородсодержащими функциональными группами, так как суммарное содержание серы и азота невелико и обычно не превышает 5%. Совокупность и разнообразие разнозаряженных функциональных групп позволяет называть природные нативные гуминовые вещества полиэлектролитами и обуславливает их амфотерность. Наличие в составе природных гуминовых веществ ароматических колец обуславливает гидрофобные свойства, однако при этом функциональные группы с присоединенными углеводами и аминокислотами создают гидрофильные участки в молекулах. Такая двойственность строения обеспечивает молекулам гуминовых веществ способность являться амфифильными, т.е. растворяться как в воде, так и в липидах [115, 131, 137]. Известно, что гуминовые вещества обладают поверхностно-активными свойствами [32, 114, 172, 287], причем считается, что выраженность данного свойства определяет степень биологической активности [32, 114].
Различные функциональные группы способствуют образованию внутри- и межмолекулярных связей, причем комплексообразующую (хелатооб-разующую) способность гуминовых веществ определяют внутримолекулярные связи, а межмолекулярные связи обеспечивают вероятность образования крупных ассоциатов, состоящих из разнородных компонентов [11, 96].
Исследование гуминовых веществ современными инструментальными методами органической химии (ИК-спектроскопия, ЯМР-спектроскопия, флуоресцентная спектроскопия, гель-хроматография и др.) позволило в последние годы существенно расширить информацию о структурно-групповом составе гуминовых веществ [47, 48, 50, 65, 93, 96, 139, 168, 170, 174, 175, 184, 194, 214, 214, 221, 285]. Несмотря на всю сложность строения известно, что для всех природных гуминовых веществ независимо от источника получения характерны общие черты – макромолекулы природных гумусовых кислот состоят из так называемой «каркасной части» и «периферийной части» [115]:
1. Каркасная часть представляет собой высокозамещенные ароматические фрагменты, соединенные мостиками – эфирными, алкильными и др. Основными преобладающими заместителями являются кислородсодержащие функциональные группы: карбоксильные, фенолгидроксильные, спиртовые гидроксильные, метоксильные, карбонильные.
2. Периферийная часть состоит из углеводного и протеинового комплекса, которые ковалентно связаны с каркасной частью. До 30% от массы гумусовых кислот составляют углеводные фрагменты. В периферийную часть входят связанные с органической матрицей кислородными мостиками зольные компоненты, например силикаты, алюмосиликаты, оксиды железа и т.п.
Модели для изучения дезинтоксикационных и гепатопротекторных свойств
Поливинилпирролидон (повидон-8000) – лекарственный препарат «Ге-модез Н» (производства ОАО «Мосфарм», Россия; номер регистрационного удостоверения: ЛСР-002137/08; форма выпуска – раствор для инфу зий в бутылках). Фармако-терапевтическая группа: дезинтоксикационное средство; выбран как эталон дезинтоксикационной активности,
Эссенциальные фосфолипиды из соевых бобов – лекарственный препарат «Эссенциале Н» (производства «A.Nattermann and Cie., GmbH», Германия, номер регистрационного удостоверения: П N016326/01; форма выпуска – раствор для внутривенного введения, 50 мг/мл, в ампулах темного стекла). Фармако-терапевтическая группа: гепатопротекторное средство; выбран как эталон гепатопротекторной активности.
Облепихи масло – лекарственный препарат «Масло облепиховое» (производства ЗАО «Алтайвитамины», Россия; номер регистрационного удостоверения: Р №000245/02-2003; форма выпуска – масло для приема внутрь и наружного применения во флаконах оранжевого стекла по 50 мл.) Содержит смесь каротина и каротиноидов (не менее 180 мг%), сумму токоферолов (не менее 110 мг%), хлорофилловых соединений, глицериды олеиновой, линолевой, пальмитиновой и стеариновой кислот. Фармако-терапевтическая группа: репарации тканей стимулятор растительного происхождения; выбран как эталон регенераторной активности.
Диклофенак натрия – лекарственный препарат «Диклофенак» (производства Хемофарм А.Д., Сербия; номер регистрационного удостоверения: П N011648/03; форма выпуска – раствор для внутримышечного введения 25 мг/мл, в ампуллах). Фармако-терапевтическая группа: НПВП; выбран как эталон противовоспалительной и анальгетической активности.
Глибенкламид – лекарственный препарат «Манинил 5» (производства Берлин-Хеми АГ/Менарини Групп, Германия; номер регистрационного удостоверения: П N011519/01; форма выпуска – таблетки 5 мг). Фармако-терапевтическая группа: гипогликемическое средство для перорального применения группы сульфонилмочевины II поколения; выбран как эталон антидиабетической активности. Глибенкламид для проведения исследований извлекали из таблеток «Манинил 5», подлинность контролировали по ИК-спектру, изготавливали суспензию глибенкламида для перорального введения, содержащую белую глину и Твин-80. Подлинность полученного извлечения при помощи ИК-спектроскопии. Для введения лабораторным животным изготавливали 0,01% суспензию глибенкламида. Для этого 100 мг белой глины растирали в ступке, добавляли 10 мг глибенкламида, смешивали, добавляли 0,1 мл Твина-80 и затем дробно воды дистиллированной до 100 мл. Для проведения эксперимента выбрали максимальную суточную дозу глибенкламида для человека 25 мг, что при перерасчете составило 0,36 мг/кг;
Фамотидин – лекарственный препарат «Квамател» (производства Гедеон Рихтер А.О., Венгрия; номер регистрационного удостоверения: П №012002/02; форма выпуска – лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения в комплекте с растворителем: натрия хлорида раствор 0.9% (ампулы) 5 мл; 20 мг фамотидина в каждом флаконе). Фармако-терапевтическая группа: противоязвенное средство - H2-гистаминовых рецепторов блокатор; выбран как эталон противоязвенной активности.
Элеутерококка колючего экстракт корневищ с корнями – лекарственный препарат «Элеутерококка экстракт жидкий» (производства ОАО «Ивановская фармацевтическая фабрика», Россия; номер регистрационного удостоверения: 74/331/72; форма выпуска – экстракт для приема внутрь жидкий во флаконах темного стекла). Фармако-терапевтическая группа: общетонизирующее средство растительного происхождения; выбран как эталон адаптогенной активности.
Препараты и реактивы, использованные в экспериментальных доклинических исследованиях: 1,5-диметил-5 (циклогексен-1-ил)-барбитурат натрия (порошок Гексенал, производства «Рижский ХФЗ», Латвия) – использовали при проведении теста «гексеналовый сон»; – 5,5-диэтилбарбитурат натрия (субстанция-порошок Мединал, производства «Усолье-Сибирский ХФЗ», Россия) – использовали при проведении теста «мединаловый сон»; трихлорметан стабилизированный 0,6-1% этанола (хлороформ), производства ЗАО «Вектон», Россия, ТУ 2631-066-44493179-01 – для ингаляционного наркоза. четыреххлористый углерод (син. тетрахлорметан), химически чистый, (производства ООО «Компонент-Реактив», Россия), ТУ 2631-027-44493179-98 – моделирование токсического гепатита; клозапин – атипичный нейролептик, субстанция-порошок Азалептин, (производства ОАО «Органика», Россия), использовали для моделирования отравления психотропными средствами, окисленная олеиновая кислота получали по методу Ю.Б. Кудряшова (1964) из цис-9-октадеценовой кислоты (кислота олеиновая, производства ЗАО «Вектон», Россия), кислота уксусная ХЧ ледяная ГОСТ 61-75, для проведения теста «корчей»; – формалин, ТУ 38,30314-89, 10,0% водный раствор формалина для фиксации образцов органов и тканей для гистологических исследований; 40,0% и 3,0% водный раствор формалина – моделирование асептической воспалительной реакции, модель «формалиновый отек лапы»; аллоксан (мезоксалиломочевина), химический реактив Аллоксана тетра-гидрат, производства «Sigma-Aldrich Chemie GmbH», Швейцария, использовали для моделирования сахарного диабета; стрептозоцин, химический реактив, производства «Sigma-Aldrich Chemie GmbH», Швейцария, использовали для моделирования сахарного диабета; – кислота соляная реактивная химически чистая, производства ОАО «Каустик», Россия, ГОСТ 3118-77 – моделирование кислотного гемолиза эритроцитов,
Определение наличия кумулятивного действия солей гуминовых кислот
При проведении всех исследований изучение и забор внутренних органов проводили после эвтаназии, которую осуществляли путем передозировки хлороформного наркоза. Исключением являлись эксперименты по изучению острой токсичности. Перед умерщвлением животных взвешивали, после чего помещали в стеклянный бикс объемом 5,0 л с герметичной крышкой и вызывали летальный исход передозировкой хлороформного наркоза. Процедуру патолого-анатомического исследования осуществляли согласно общеизвестным методам [33, 122, 57, 101]. У погибших животных при помощи хирургических ножниц и анатомического пинцета осуществляли препарирование и изъятие внутренних органов для визуального осмотра, определения патолого-анатомических изменений, взвешивания или забора образцов для гистологических исследований.
Взвешивание внутренних органов проводили на аналитических весах, в течение первых 5 мин. после умерщвления, индивидуально для каждого животного. Парные органы (почки, надпочечники) взвешивали по 2 одновременно, в результатах указывали их общую массу. После измерения абсолютной массы внутренних органов проводили перерасчет относительной массы (г/кг массы тела). Расчет относительной массы органов осуществляли по формуле (1): где Морг.отн. – относительная масса органа (г/кг массы тела), m – абсолютная масса органа, выраженная в граммах, М – масса тела животного в граммах. Желудок рассекали по малой кривизне, освобождали от содержимого, помещали на 30 сек. в 0,9% раствор хлорида натрия. С целью облегче-70 ния осмотра, желудок выворачивали слизистой оболочкой наружу, растягивали на плоскости и фиксировали по краям при помощи булавок. Визуально оценивали наличие язвенных дефектов и эрозий на слизистой оболочке желудка. В случае их наличия определяли количество животных с язвенными поражениями выражаемое в процентах, среднюю суммарную длину или площадь язв.
При проведении планиметрических исследований для измерения площади язв или ожоговых участков, нами впервые предложена «Палетка для планиметрических измерений объектов в биологии и медицине» (Патент РФ №114147) с масштабно-координатной сеткой, созданная при помощи компьютерных программных средств векторной графики и распечатанная на прозрачной пленке для лазерных принтеров. Палетка с сеткой масштабно-координатной прикладывается непосредственно сверху на измеряемую поверхность, позволяя визуализировать находящийся под ней объект. Способ позволяет измерить площадь объекта, а так же удобен для измерения длины и ширины.
Фрагменты внутренних органов фиксировали в 10% растворе формалина, после чего по общепринятой методике [122] заливали в парафин, из парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 5–7 мкм. Окраску препаратов для изучения общей морфологической структуры проводили по Романовскому-Гимзе гематоксилином Майера с эозином [122].
Анализ гистологических препаратов проводили при помощи микроскопа светового биологического Биомед-1 (Россия), измерения осуществляли при помощи окуляра-микрометра. Использовали цифровой фотоаппарат Canon PC1099 PowerShot A95 (Китай), монтируемый на окуляр и компьютерную систему ввода изображения на базе цифровой видеокамеры Microscope Digital Camera Levenhuk С800 NG C-Series (Levenhuk, Ltd., USA).
Токсикологические исследования проведены с учетом рекомендаций, изложенных в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, под общей редакцией Р.У. Хаб-риева, 2005 [155].
Проведение токсикологических исследований изучаемых солей гу-миновых кислот осуществлено на лабораторных животных грызунах и негрызунах: белых аутбредных конвенциональных крысах самцах и самках в возрасте 3 мес. со средней массой тела 210,5±35,4 г, белых аутбредных мышах самцах в возрасте 2,5 мес. со средней массой тела 20,3±2,5 г, кроликах самцах породы шиншилла и породы белый великан в возрасте 4 мес. со средней массой тела 2,4±0,5 кг.
Острую токсичность солей гуминовых кислот – лигногумата, гумата леонардита и сапропелевого гумата, изучали при внутрижелудочном способе введения, а так же при внутрибрюшинном, внутримышечном, и подкожном способах введения в зависимости от предполагаемых особенностей применения изучаемых фармакологических веществ. Во всех экспериментах животным контрольных групп вводили 0,9% раствор натрия хлорида в соответствующих объемах и способах введения.
Дозы выбирали согласно рядам Фульда. Общая длительность наблюдения за животными при изучении острой токсичности составляла 14 суток, в 1 сутки наблюдение за состоянием животных осуществляли непрерывно. Оценивали особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координацию движений, тонус скелетных мышц, реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раз дражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние волосяного и кожного покрова, окраску слизистых оболочек, размер зрачка, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания и окраску мочи, потребление корма и воды, изменение массы тела [155]. Проводили патолого-анатомические исследования, измерение массы и макроскопическое исследование внутренних органов погибших животных.
Изучение дезинтоксикационных свойств при интоксикации окисленной олеиновой кислотой
Изучение хронической токсичности лигногумата, сапропелевого гу-мата и гумата леонардита проведено на 100 белых аутбредных крысах массой тела 190,5±5,6 г, из них интактная группа здоровых животных и 9 опытных групп для 3 доз каждого из трех изучаемых веществ, по 10 голов в каждой группе. Изучаемые вещества вводили способом, соответствующим предполагаемому терапевтическому: лигногумат – внутримышечно, сапропелевый гумат и гумат леонардита перорально. Лигногумат вводили в дозах: 100 мг/кг (предполагаемая терапевтическая, составляющая 1/10 от LD50 при внутримышечном введении крысам 974,9±135,0 мг/кг), 360 мг/кг (максимальная переносимая доза при внутримышечном введении крысам) и 280 мг/кг (доза, принятая за среднюю между предполагаемой терапевтической и максимальной переносимой). Сапропелевый гумат и гумат лео-нардита вводили в дозах: 100 мг/кг (предполагаемая терапевтическая, составляющая 1/10 от дозы, принятой за LD50 при внутрижелудочном введении крысам 1000 мг/кг или от доз LD50 1482,5±203,0 и 799,8±144,8 при подкожном введении крысам), 1000 мг/кг (максимальная переносимая доза при внутрижелудочном введении крысам) и 500 мг/кг (доза, принятая за среднюю между предполагаемой терапевтической и максимальной переносимой).
Длительность введения лигногумата, сапропелевого гумата и гумата леонардита при изучении субхронической токсичности составляла 3 мес., так как предполагаемая длительность применения для терапевтических целей вероятно не будет превышать 15–30 дней. Изучаемые вещества вводили ежедневно в одни и те же часы, 7 дней в неделю. Осуществляли контроль потребления корма и воды, состояние волосяного покрова, слизистых оболочек, отмечали изменения общего клинического состояния животных. Один раз в неделю на протяжении периода наблюдения определяли массу тела. Трехкратно (в начале, середине и конце эксперимента) контролировали состояние сердечно-сосудистой, выделительной системы (суточный диурез, рН, удельная плотность мочи), пищеварительной системы (внешний вид, консистенция, количество фекальных болюсов), контролировали основные гематологические и биохимические показатели крови. По окончании периода наблюдения (через 1 мес. введения изучаемых веществ) животных подвергали эвтаназии путем передозировки хлороформного наркоза, осуществляли вскрытие и патологоанатомические исследования (определяли массу внутренних органов, осуществляли макроскопическое описание патолого-анатомических изменений) и производили забор материала для гистологических исследований. Сравнение всех изучаемых показателей проводили с интактной группой здоровых животных (вводили 0,9% раствор натрия хлорида в эквивалентных объемах и способах введения).
В результате постоянных наблюдений в течение 3 мес. установлено, что лигногумат в дозах 100; 280 и 360 мг/кг, сапропелевый гумат и гумат леонардита в дозах 100, 500 и 1000 мг/кг не вызывали изменения поведенческих реакций (не выявлено повышенной возбудимости, настороженности, агрессивности, пугливости), не выявлено изменений двигательной активности и нервно-мышечной возбудимости (изменения спонтанной двигательной активности, сонливости, тремора, судорог, атаксии, изменения рефлексов положения, изменения реакций на прикосновение). Не выявлено изменений ритма дыхания, цианоза кожных покровов.
На фоне применения сапропелевого гумата и гумата леонардита у животных не наблюдалось отеков и эритемы кожных покровов. Внутримышечное введение лигногумата в дозе 100 мг/кг через 7–14 дней ежедневных инъекций у части животных вызывало отек и болезненность (в течение 1–3 ч) в зоне внутримышечных инъекций, в связи с чем места инъекций в дальнейшем ходе эксперимента ежедневно меняли, что позволило исключить выбывание животных из опыта и не препятствовало завершению эксперимента. Лигногумат в дозах 280 и 360 мг/кг вызывал отек и болезненность в зоне инъекций у половины животных, у некоторых из них в дальнейшем развивался асептический абсцесс на месте инъекций, который заживал самостоятельно через 14 дней после окончания введения лигногу-мата. У животных опытных групп отсутствовали лакримация, миоз или мидриаз, не выявлено экзофтальма, птоза. Не выявлено изменений саливации, отсутствовала взъерошенность шерстных покровов, видимые слизистые оболочки влажные, гладкие, розоватого цвета, кожные покровы бледно-розового цвета.
Результаты еженедельного измерения массы тела животных свидетельствуют, что при ежедневном введении в течение 30 дней лигногумат в дозах 100; 280 и 360 мг/кг, сапропелевый гумат и гумат леонардита в дозах 100, 500 и 1000 мг/кг не оказывали отрицательного влияния на динамику прироста массы тела, животные всех опытных групп набирали массу с той же скоростью, что и здоровые животные интактной группы, разница в показателях не превышала 10% (Табл. 3.22).
