Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Общая характеристика радионуклидных методов, используемых для диагностики воспалительных процессов 10
1.2 Радиофармацевтические препараты на основе технеция-99м (99шТс) 13
1.3 Использование фторхинолонов в медицине и их свойства 1.3.1 Общая характеристика фторхинолонов 19
1.3.2 Механизм действия фторхинолонов 22
1.3.3 Развитие резистентности к фторхинолонам 23
1.3.4 Фармакокинетика фторхинолонов 24
1.3.5 Клиническое применение и побочные реакции 26
1.4 Предпосылки использование фторхинолонов в ядерной медицине 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1 Характеристика используемых веществ и материалов 33
2.2 Методика приготовления реагентов для получения фторхинолонов, меченных 99шТс
2.2.1 Приготовление реагентов с различным содержанием Sn 34
2.2.2 Приготовление растворов радиофармацевтических препаратов 35
2.2.3 Приготовление раствора "Драгендорфа"
2.3 Методика получения радиохроматограмм 35
2.4 Определение химических (неактивных примесей) примесей 36
2.5 Методика определения содержания Sn и соотношения Sn/ 99mTc в продуктах взаимодействия фторхинолонов с 99тТс и Sn (II) 37
2.5.1 Методика приготовления раствора, содержащего изотоп олова (117mSn) 37
2.5.2 Определение количества Sn 37
2.5.3 Определение количества 99тТс
2.6 Качественное и количественное определение Sn (II) 38
2.7 Определение ципрофлоксацина гидрохлорида 40
2.8 Определение норфлоксацина гидрохлорида 41
2.9 Определение бактериальных эндотоксинов 43
2.10 Определение стерильности 46
2.11 Методика проведения фармакокинетических исследований РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" з
2.12 Определение диагностической пригодности РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" 47
2.13 Методика проведения оценки токсичности РФП "Ципрофлоксацина, 99тТс" и "Норфлоксацина, 99гаТс" 48
2.14 Методы статистической обработки результатов 50
Глава 3. Экспериментальные исследования по получению фторхинолонов, меченных 99тТс 51
3.1 Исследование продуктов взаимодействия фторхинолонов с 9 шТс в присутствии Sn(II) 53
3.2 Исследование влияния рН среды на процесс образования коллоида в системе [Фторхинолон + Sn (II) + NaTcO 58
3.3 Изучение влияния концентрации Sn (II) на процессы образования коллоида и восстановления 99тТс 60
Глава 4. Экспериментальные испытания рфп "ципрофлоксацин, 99ттс" и "норфлоксацин, 99тТс" 70
4.1 Исследование диагностической пригодности РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" для визуализации очагов бактериального воспаления
4.2 Изучение фармакокинетики РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" 72
4.3 Влияние РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99шТс" на состояние периферической крови 75
Функциональное состояние внутренних органов под воздействием РФП
"Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" 75
4.4 Определение срока хранения 78
4.6 Разработка схемы аналитического контроля и стандартизация показателей качества радиофармацевтических препаратов 79
4.7 Определение срока годности 82
Заключение 89
Выводы 97
Практические рекомендации 97
Список литературы
- Использование фторхинолонов в медицине и их свойства 1.3.1 Общая характеристика фторхинолонов
- Приготовление растворов радиофармацевтических препаратов
- Исследование влияния рН среды на процесс образования коллоида в системе [Фторхинолон + Sn (II) + NaTcO
- Разработка схемы аналитического контроля и стандартизация показателей качества радиофармацевтических препаратов
Введение к работе
Актуальность работы. Диагностика воспалительных процессов бактериальной
этиологии остаётся одной из наиболее актуальных проблем современной медицины.
Широкая распространённость такой патологии и связанные с ней высокая степень
инвалидизации и летальности требует новых методов диагностики, поскольку даже
акие современные лучевые методы исследования как ультрасонография, компью-
ерная и магнитно-резонансная томография не позволяют выявить воспалительный
роцесс до появления анатомических изменений в ткани, т.е. на ранней стадии раз-
ития процесса. Кроме того, этот метод не позволяет разграничить асептические и
актериальные формы воспаления, где единственным дифференциальным призна-
ом является наличие патогенных микроорганизмов в воспалительном очаге.
Решением этой проблемы может служить использование радионуклидных ме-одов индикации, которые во многих случаях позволяют сделать оценку патофизио-іогических изменений в повреждённых органах и тканях с помощью гамма-цинтиграфии. В последние годы была сделана попытка синтезировать радиофарма-евтические препараты (РФП), связывающиеся непосредственно с возбудителем и, аким образом, позволяющие селективно визуализировать очаги бактериального оспаления. По имеющимся в литературе сведениям, в качестве таких индикаторов огут быть использованы меченые различными радиоактивными изотопами лейко-иты, антитела, пептиды, цитокины, а также антибактериальные лекарственные редства (ЛС) из группы фторхинолонов (ФХ). Предпосылкой применения меченых X для обнаружения очагов бактериального воспаления является то, что они не свя-ываются с мёртвыми бактериями и не накапливаются в очагах асептического вос-аления. Эти свойства обеспечивают высокую специфическую тропность РФП к чагам бактериального воспаления.
Наиболее доступным радионуклидом для медицины является "генераторный" 9шТс, имеющий период полураспада (Тиг) 6,02 часа. Для его получения непосредст-енно в радиологических лабораториях используются 99Мо/99тТс-генераторы, из ко-орых Тс элюируют в виде раствора натрия пертехнетата. В настоящее время на снове 99тТс разработано большое количество органотропных РФП, которые приме-яются более чем в 80% диагностических тестов от общего количества радионук-идных исследований. Как правило, для получения таких РФП используются стан-артные наборы (чаще лиофилизаты), при прямом смешивании которых с элюатом тТс получаются препараты с заданными свойствами. Обычно такие реагенты по-тавляются в клиники вместе с генератором 99тТс (ГФ XII, 2008; Wynn A. Volkert, 999). В этой связи, разработка подобных реагентов для получения антибактериаль-ых ЛС, меченных 9шТс, является наиболее предпочтительным решением задачи оздания РФП для диагностики воспалительных процессов. На начало проведения астоящих исследований в литературе уже имелись сведения о высокой специфич-ости к очагам бактериального воспаления противомикробных ЛС из группы фтор-инолонов, в частности, ципрофлоксацина гидрохлорида (ЦФГ), меченного 9тТс Шоп К., 1997; Hall A.V., 1998; Kleisner I., 2002; Kerim S., 2001; Sarda L., 2002; oroa V.E., 2001; Prandini N.. 2001; Rein H. Siaens, 2004; VinjamuriS., 1996). Однако, се известные методики его получения не достаточно удобны для непосредствен-ого применения в условиях клиник, не обладающих специальным оборудованием ля проведения очистки полученного продукта и последующего контроля его каче-іва.
Следует также отметить, что в литературе отсутствуют какие-либо сведения о получении другого ЛС из данной группы - норфлоксацина гидрохлорида (НФГ), меченного Тс, который также имеет все предпосылки для применения в диагностике воспалительных процессов.
Настоящая работа является фрагментом госбюджетной темы "Разработка технологий получения радиофармацевтических препаратов для ядерной медицины" (Регистрационный номер 01.9.60.012447) и научных тем основного плана фунда ментальных НИР, проводимых в Томском политехническом университете по иссле дованию ядерно-физических закономерностей получения короткоживущих радио нуклидов и процессов синтеза РФП для медицины (№ госрегистрации НИ 226.2.9.99) и исследованию физико-химических закономерностей реакций изотопно го обмена короткоживущих радионуклидов (№ госрегистрации НИР 0120.0403329).
Целью работы является разработка радиофармацевтических препаратов "Ци профлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс", проведение экспериментальных ис следований их безопасности и эффективности использования для сцинтиграфиче ской диагностики очагов бактериального воспаления.
Задачи исследования:
Разработать состав и методики приготовления реагентов для получения РФ "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс", имеющих наилучшую биодос тупность в организме экспериментальных животных.
Оценить диагностическую пригодность РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" "Норфлоксацин, 99тТс" для выявления очагов бактериального воспаления.
З.В экспериментальных исследованиях изучить фармакокинетику РФП "Ци профлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс".
4. Оценить влияние РФП на состояние периферической крови и функциональ ное состояние внутренних органов экспериментальных животных.
Научная новизна исследования заключается в том, что впервые:
проведены исследования по определению оптимального количественного состав реагентов для прямого получения фторхинолонов, меченных 99шТс (99тТс-ФХ). Пок зано, что повышенное коллоидообразования отрицательно влияет на биодоступ ность РФП;
на экспериментальных животных определена диагностическая пригодность и следуемых РФП для специфической визуализации очагов бактериального воспаления.
установлено, что для фармакокинетики РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" "Норфлоксацин, 99тТс", характерна преимущественная аккумуляция данных индик торов в почках и печени, с последующим их элиминированием мочевыводящей си темой. Кроме того, данные РФП в незначительном количестве накапливаются в о ганах средостения и костном мозге, что предполагает возможность их использов ния в ортопедической, пульмонологической и кардиологической практике.
доказано, что при введении 10-кратно завышенных (53 МБк на кг массы тел диагностических доз РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" не вь является изменений периферической крови и нарушений функционального состо ния основных физиологических констант дыхания и кровообращения.
Практическая значимость и реализация результатов работы.
В результате проведённых исследований подобран оптимальный состав реагентов к генератору 99тТс и определены условия их приготовления, обеспечивающие возможность прямого получения тТс-ФХ, для сцинтиграфической диагностики очагов бактериального воспаления.
Установлены оптимальные дозы РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлокса-цин, 99тТс" и сроки сцинтиграфических исследований для обнаружения бактериальных воспалительных процессов у экспериментальных животных.
Полученные данные являются основой для подготовки нормативно-технической документации для серийного производства стандартных реагентов и использования в учебно-педагогическом процессе.
Результаты данной работы используются в учебно-педагогическом процессе Томского политехнического университета, Сибирского государственного медицинского университета, Кемеровской государственной медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
Разработан оптимальный состав реагентов и схема аналитического контроля качества РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс".
Экспериментально доказано, что РФП "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, тТс" могут быть использованы для сцинтиграфического выявления очагов бактериального воспаления.
3. В физиологических условиях РФП на основе фторхинолонов, меченных
Тс, накапливаются преимущественно в почках и печени, что создает предпосылки
их использования в пульмонологии, кардиологии и ортопедии.
4. Радиофармацевтические препараты "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлокса
цин, 99тТс" не токсичны при внутривенном введении и соответствуют требованиям
ОСТ "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения.
№91500.05.001-00".
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: международной конференции "Современные проблемы в ядерной физике" (г. Ташкент, 2006), научной конференции "Новые технологии в ядерной медицине" (г. Санкт-Петербург, 2006), VI международной конференции "Ядерная и радиационная физика" (г. Алматы, 2007), IV международной научно-практической конференции "Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения" (Северск-Томск, 2007); Ш Троицкой конференции "Медицинская физика и инновации в медицине" (г. Троицк, 2008), VI международной конференции "Ядерная медицина" (Хорватия, 2008), российско-бельгийском симпозиуме "Использование ядерных реакторов и циклотронов для медицинских целей" (г. Томск, 2008), всероссийской научно-практической конференции "Перспективы развития высокотехнологичной радиологической лечебно-диагностической помощи населению восточной части России" (г. Томск, 2008), VII международной конференции "Современные проблемы ядерной физики" (г. Ташкент, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них, 3 публикаций в отечественных и зарубежном рецензируемых журналах, и 8 публикаций в материалах международных и всероссийских научных конференций.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы; со-ержит 113 машинописных страниц, включая 19 рисунков, 33 таблиц, 116 библиографических ссылок, из них отечественных - 53.
Использование фторхинолонов в медицине и их свойства 1.3.1 Общая характеристика фторхинолонов
Мишенью их действия в микробной клетке являются два жизненно важных фермента из группы топоизомераз, отвечающие за процесс нормального деления клетки. В первую очередь, это топоизомераза-П бактерий или ДНК-гираза. Фермент катализирует процесс суперскручивания или суперспи-рализации нитей ДНК, что необходимо для оптимальной укладки (топологии) ДНК в клетке. Второй фермент - топоизомераза-IV, регулирует уровень су-перспирализации. В настоящее время показано, что при действии на грамот-рицательные бактерии в первую очередь мишенью является ДНК-гираза, а при действии на грамположительные - топоизомераза-IV. Ингибирование функции указанных ферментов приводит к необратимым изменениям в клетке и, в итоге, к её гибели (бактерицидному эффекту). Специфичность мишени обеспечивает активность ФХ в отношении большинства штаммов бактерий, устойчивых к действию антибактериальных ЛС других фармакологических групп. ФХ, подавляя биосинтез ДНК в микробной клетке, не влияют на биосинтез ДНК в клетках макроорганизма. Ферменты клеток млекопитающих из группы топои-зомераз, связанные с биосинтезом ДНК, нечувствительны к хинолонам и ФХ, рекомендованным для медицинского применения. Эти ЛС не проявляют мутагенного действия в отношении клеток макроорганизма и, с этой точки зрения, безопасны для человека [4, 31-33, 110]. 1.3.3 Развитие резистентности к фторхинолонам
У бактерий может развиваться устойчивость к ФХ. Основной механизм развития резистентности к ФХ строго специфичен для класса хинолонов и зависит от изменения структуры мишеней их действия. В этом случае резистентность развивается по типу хромосомной и связана с мутациями по генам, кодирующим ДНК-гиразу (субъединицы А или В ДНК-гиразы) или топоизоме-разу-IV. Мутации могут быть одно- или многоступенчатые, соответственно и уровень устойчивости будет различным (более высокий при многоступенчатых мутациях). Это приводит к развитию резистентности только в пределах класса хинолонов, и перекрестная устойчивость к другим группам антибактериальных ЛС не развивается. Частота спонтанных мутаций очень низкая. Следует отметить, что высокая бактерицидная активность ФХ позволяет в отношении ряда штаммов преодолевать уровень устойчивости, возникший к неф-торированным хинолоном. Одновременно следует подчеркнуть, что при некотором типе мутаций, в частности по субъединице В ДНК-гиразы, возможно повышение чувствительности к ФХ. Другой механизм резистентности может быть связан с нарушением проницаемости внешней клеточной мембраны бактерий (в частности, с нарушением транспорта через пориновые каналы) и, как следствие, с нарушением проникновения ЛС в клетку, или, наоборот, с активацией т.н. "белков выброса", которые приводят к выведению ФХ из клетки. При развитии устойчивости в результате нарушения транспортных систем может наблюдаться перекрёстная устойчивость с другими классами антибактериальных ЛС (Р-лактамы, аминогликозиды, тетрациклины), для которых также нарушается нормальный транспорт в клетку или ускоряется выведение из клетки.
По мере расширения клинического применения ФХ, показана возможность развития приобретённой устойчивости к ним у клинических штаммов бактерий, однако, эта устойчивость развивается достаточно медленно, и процесс не приобрёл клинического значения. С наибольшей частотой отмечают возможность развития резистентности у штаммов "P. Aeruginosa" и "S. Aureus", главным образом, в результате длительных курсов лечения хронических форм инфекции; отмечено появление устойчивых к ФХ штаммов клеб-сиелл и некоторых других микроорганизмов [68, 72, 91, 108-110]. 1.3.4 Фармакокинетика фторхинолонов
Важной особенностью ФХ является их оптимальная фармакокинетика, обеспечивающая широкие возможности применения ЛС при различной локализации воспалительного процесса.
Всасывание. ФХ быстро всасываются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), достигая максимальных концентраций в крови через 1-3 ч. Приём пищи несколько замедляет всасывание ЛС, не влияя на объём всасывания [71, 94, 106]. Для ФХ характерна высокая биодоступность при приёме внутрь, которая для большинства ЛС достигает 80-100% (исключением является норфлокса-цин, биодоступность которого после приёма внутрь составляет 35-45%). Длительность циркуляции ФХ в организме людей (для большинства ЛС показатель полувыведения составляет 5-10 ч) позволяет назначать их 2 раза в сутки. Среди новых ФХ имеются ЛС с более длительным пребыванием в организме: спарфлоксацин и руфлоксацин, величина полувыведения которых составляет 18-20 и 36 ч, соответственно, в связи с чем, возможно их применение 1 раз в сутки и реже [46-53].
Распределение. ФХ в низкой степени связываются белками сыворотки крови (в большинстве случаев менее 30%). ЛС имеют большой объём распределения (90 л и более), что свидетельствует об их хорошем проникновении в различные ткани, где создаются концентрации, во многих случаях близкие к сывороточным или их превышающие [26, 61, 87, 89, 114]. Отмечается хорошее проникновение ФХ в слизистые оболочки ЖКТ, мочеполовых и дыхательных путей, лёгкие, почки, синовиальную жидкость, где концентрации ФХ составляют более 150%, по отношению к сывороточным; показатель проникновения ФХ в мокроту, кожу, мышцы, матку, воспалительную жидкость и слюну составляет 50-150%, а в спинномозговую жидкость, жир и ткани глаза-менее 50% [95]. Хорошая диффузия ФХ в ткани обусловлена их физико-химическими свойствами: высокой липофильностью и низким связыванием белками. ЛС хорошо проникают в альвеолярные макрофаги и полиморфноя-дерные лейкоциты человека, что имеет важное значение для лечения инфекций с внутриклеточной локализацией микробов.
Метаболизм. ФХ метаболизируют в организме, при этом, биотрансформации в большей степени подвержен пефлоксацин (50-85%), в наименьшей -офлоксацин и ломефлоксацин (менее 10%); остальные ЛС по степени метаболизма занимают промежуточное положение. Количество образующихся метаболитов колеблется от 1 до 6. Ряд метаболитов (оксо-, дезметил-, формил-) обладают некоторой антибактериальной активностью [89].
Выведение. Элиминация ФХ в организме осуществляется почечным и внепочечным (биотрансформация в печени, экскреция с желчью и др.) путями. Между ФХ наблюдаются различия в отношении основных путей элиминации: почти полностью почечным путём элиминируют офлоксацин и ломефлоксацин, преимущественно внепочечными механизмами - пефлоксацин и спарфлоксацин; другие ЛС занимают промежуточное положение. Выведение ФХ почками происходит различными механизмами: наряду с клубочковой фильтрацией, некоторые ЛС (ципрофлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин и др.) активно секретируются в канальцах почек, а ряд ЛС (пеф-локсацин, руфлоксацин, спарфлоксацин, флероксацин) подвергается канальце-вой реабсорбции. При экскреции ФХ почками в моче создаются концентрации, достаточные для подавления чувствительной к ним микрофлоры в течение длительного времени
Приготовление растворов радиофармацевтических препаратов
Флаконы укупоривали пробкой резиновой с алюминиевым колпачком, завальцовывали и стерилизовали в автоклаве в течение 8 мин при температуре 120С и давлении 1,2 кгс/см2.
Во флаконы с реагентами, приготовленными по методике раздела 2.2.1, вводили 5 мл раствора натрия пертехнетата,99тТс с активностью 200-300 МБк и инкубировали в течение 20 мин до полного растворения.
Раствор №1: 17 г раствора азотнокислого висмута и 200 г винной кислоты растворяли в 800 мл воды. Раствор №2: 160 г йодистого калия растворяли в 400 мл воды. Оба раствора смешивали. Для опрыскивания радиохроматограмм брали 50 мл смеси растворов №1 и №2, 100 г винной кислоты и 500 мл воды.
На полоску пластины силикагеля, предварительно очищенную концентрированным раствором аммиака, размером 20 100 мм, отступив от одного из краев на 10 мм, наносили испытуемый раствор РФП объёмом 5 мкл. Полоски сушили на воздухе в течение 1 мин и затем помещали в камеру, предварительно насыщенную растворителем. В качестве растворителей (подвижных фаз) использовали смеси: а) "этилацетат:изопропиловый спирт .концентрированный аммиак" (в объёмном соотношении 12:6:4). Время хроматографирования - 40 мин; б) "этанолконцентрированный аммиак:вода" (в соотношении 2:5:5). Время хроматографирования - 40 мин; в) ацетон. Время хроматографирования - 10 мин. Полученные радиохроматограммы, после просушивания на воздухе, обклеивали с обеих сторон полиэтиленовой лентой с липким слоем. Затем разрезали, начиная от линии старта, на кусочки длиной 10 мм и измеряли их радиоактивность (скорость счёта) на одноканальном амплитудном анализаторе "Strahlungsmessgerat-20 046" или радиометрической установке "УРС-06/07". По этим данным строили зависимости распределения радионуклидов ( Тс или 117mSn) по длине хроматограмм, с последующим расчётом их содержания в про 99п т дуктах взаимодействия реагентов с раствором натрия пертехнетата, 1 с.
Проводили методом эмиссионного спектрального анализа по стандартным методикам, приведённым в статье "Определение примесей химических элементов в радиофармацевтических препаратах" [9], с использованием спектрографа "ИСП-30" и многоканального анализатора атомно-эмиссионных спектров "МАЭС". Обработку спектров и вычисление концентраций анализируемых элементов осуществляли с помощью программного пакета "Атом". В соответствии с действующими нормативными требованиями, получаемые РФП проходили проверку на содержание неактивных примесей алюминия, бария, бериллия, бора, висмута, железа, кадмия, кремния, мышьяка, марганца, меди, молибдена, никеля, олова, ртути, свинца, сурьмы, теллура, цинка и хрома.
Согласно методике приготовления реагентов (раздел 2.2.1), основной неактивной примесью в "Ципрофлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" является Sn, используемое в качестве восстанавливающего агента. Его предельное содержание в РФП регламентируется условиями их приготовления. Остальные примеси не должно превышать пределы их обнаружения, указанные в вышеприведённой статье. 2.5 Методика определения содержания Sn и соотношения Sn/99mTc в продуктах взаимодействия фторхинолонов с 99тТс и Sn (II)
Навеску металлического олова массой 18,8 мг облучали в потоке нейтронов 5-Ю13 н/см2-с в течение 40 ч, в результате чего по ядерной реакции U7Sn (n,n )117mSn образуется изотоп олова 117mSn, с Ti/2= 13,6 суток. Основная линия в спектре у-излучения имеет энергию Еу= 0,158 МэВ, с выходом 86,4%.
После "охлаждения" в течение 5 суток, облучённую навеску растворяли в 100 мкл концентрированной НС1 и доводили объём раствора до 5 мл дистиллированной водой. Концентрация Sn в растворе (по металлу) составляет 3,76 мг/мл. 100 мкл полученного раствора вносили во флакон и готовили реагент, содержащий 117mSn и ФХ, по методике раздела 2.2.1. Далее в реагент вводили 5 мл раствора натрия пертехнетата,99тТс и после инкубации проводили хроматографирование РФП, в соответствии с методикой, приведённой в разделе 2.3, с последующим измерением активностей 99тТс и 117mSn и кусочков хро-матограмм, с использованием радиометрической установки "УРС-06/07" с по-лупроводниковым Ое(1Л)-детектором объёмом 60 см . Одновременно с этим, измеряли активности радионуклидов в пробе РФП объёмом 5 мкл, нанесённой на "пятачок" из фильтровальной бумаги (образец сравнения). Продолжительность измерения каждой пробы 600 с.
Исследование влияния рН среды на процесс образования коллоида в системе [Фторхинолон + Sn (II) + NaTcO
В соответствии с теорией Бренстеда, в молекуле ЦФГ в условиях прото-литического равновесия в водно-органических средах можно выделить два активных центра: кислотный и основный, что предполагает широкое разнообразие их координации с металлами. Аналогичные электронные эффекты наблюдаются и в молекуле НФГ. В зависимости от рН среды эти центры могут не только отдавать протон, принадлежащий карбоксильной группе, но и присоединять до двух протонов с участием кислорода карбонильной группы и атома азота пиперазинового кольца. Этому способствует относительная подвижность электронов и протонов при сложных окислительно-восстановительных про 58 цессах. Согласно [15], присоединение Тс (IV) к молекулам ФХ может происходить по карбоксильным группам. При этом, возможно "прямое" его присоединение, например, в виде иона Тс (ОН)0+ или же через цепочку -Sn(OH)2-0-Тс(ОН)0.
Предварительные испытания РФП, содержащих 0,7 мг Sn (II) и 5 мг ФХ в 5 мл натрия пертехнетата, Тс, на экспериментальных животных показали, что основное накопление изотопной метки происходит в печени, что свойственно РФП, имеющим коллоидную структуру.
Одной из причин образования коллоида, с учётом достаточно хорошей растворимости ФХ в водных средах, является гидролиз Sn (II), протекающий по уравнению: SnCl2 + Н20 - Sn(OH)Cl + НС1. (12) Точно также, гидролиз по связи Sn-Cl происходит и в комплексе Sn (IV) с Тс (IV), представленном формулой (12). Особенно сильно этот эффект проявляется с повышением рН среды [15]. Исходя из этого, можно предполагать, что именно этот комплекс, регистрируемый на хроматограммах в виде 1 пика, даёт основной вклад в коллоидообразование.
С целью снижения количества коллоида были проведены исследования в двух направлениях. Первый путь состоял в смещении величины рН среды при смешивании исходного реагента [ФХ + Sn (II)] с элюатом тТс в более кислую область, второй - в изменении общего количества Sn (II) в составе реагента для нахождения оптимальной концентрации восстановителя.
Исследование влияния рН среды на процесс образования коллоида в системе [Фторхинолон + Sn (IIJ+NaTcO Количество коллоида в приготавливаемых РФП после проведения инкубации определяли методом их фильтрации через фильтр с диаметром пор 220 нм. При этом, измеряли активности 99тТс в РФП до и после его фильтрации, с последующим снятием их хроматограмм. Для проведения расчётов количества коллоида, образовавшегося при смешивании компонентов, использовали соотношение: К= (АИсх - А Ф)/АИсх, где (13) К - относительное содержание коллоида (остаток на фильтре), %; Аисх нАф - активности 99шТс в исходном РФП и в его фильтрате, соответственно. Исследования были проведены на смеси [ЦФГ + Sn (II) + NaTcOJ, содержащей 0,7 мг Sn (II) и 5 мг ЦФГ в 5 мл раствора натрия пертехнетата, 99шТс. Значения рН среды измеряли потенциометрически после введения в приготовленный РФП требуемого количества НС1. В качестве подвижной фазы была система: "этилацетат:изопропиловый спирт:аммиак" (табл. 13).
Результаты хроматографирования РФП [ЦФГ + Sn (II)+NaTc04] с различным значением рН до и после их фильтрации РФП Расстояние от линии старта, L, см к,% 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Активность, имп/с Исходный рН = 4 216 158 731 171158 322 324 407 387 570 1294 224 93 Фильтрат 137 7 662 4 108 274 259 328 328 580 1476 138 Исходный рН = 3,08 30 349 253 148 7 774 7 144 5 856 7 124 5 780 4 929 7 004 4 700 72 Фильтрат 438 77 571 2 659 1444 1436 1874 1 501 1465 3 002 2 624 Исходный рН = 2,85 2 861 232 269 11385 11 161 13 880 14 855 10 545 11317 14 775 10 734 32 Фильтрат 431 147 110 9 761 10 310 10 971 10 957 9 739 5 960 12 534 9 742 Исходный рН=1,92 42 836 203 424 28 531 9313 9 982 10 639 7 855 7 855 11779 1493 0 Фильтрат 34 303 200 647 44 415 10 824 10 242 13 332 11761 12 433 13 245 4 895 Результаты исследований приведены в табл. 13, которые показывают, что по мере изменения рН среды от 4 до 1,9, количество коллоида в РФП снижается от 93 до 0,7% (рис. 7).
Однако, РФП с таким низким значением рН не могут быть использованы для внутривенного введения. В этом плане, более предпочтительным оказался путь снижения коллоида, за счёт уменьшения количества Sn (II) в составе исходного реагента.
Изучение влияния концентрации Sn (II) на процессы образования 99т коллоида и восстановления Тс В табл. 14 приведены результаты хроматографирования [ЦФГ + 8п(П) + NaTcO/t] с различным содержанием Sn (П)до и после их фильтрации. рН = 3,5. Подвижная фаза: "этилацетат:изопропиловый спирт:аммиак".
Исходя их данных, представленных в табл. 14, были проведены расчёты с использованием формулы (12) общего содержания коллоида в РФП в зависимости от количества Sn (II) в исходном реагенте, а также сделана оценка изменения активности шТс в отдельных комплексах, представленных 1, 2 и 3 пиками хроматограмм. На рис. 8 показано изменение содержания коллоида в "Ципрофлоксацин, 99п1Тс" в зависимости от количества Sn (II) (кривая 1). Здесь же (кривая 2) приведена аналогичная зависимость, полученная для "Норфлок 99ГП/-Г сацин, Тс .
Разработка схемы аналитического контроля и стандартизация показателей качества радиофармацевтических препаратов
Возможность использования ФХ в ядерной медицине была впервые продемонстрирована на ЦФГ. Введение изотопной метки (99тТс) в его структуру явилось новым подходом к проблеме визуализации воспалительных очагов [63]. Кроме того, ЦФГ связывает и ингибирует фермент ДНК-гиразу, присутствующий в делящихся бактериях, в т.ч. резистентных к ЦФГ. Вследствие этого, нарушается репликация ДНК и синтез клеточных белков микроорганизмов [38]. Считается, что ФХ не связываются с мёртвыми бактериями и не накапливаются в участках асептического воспаления [113], за счёт этого обеспечивается высокая специфичность РФП к воспалительным очагам. Первые испытания показали высокую точность сцинтиграфии с ципрофлоксаци-ном гидрохлоридом, меченным 99тТс (99тТс-ЦФГ) в диагностике септических процессов. Так, в исследовании Hall A.V. и соавт. [77], чувствительность сцинтиграфии с данным РФП составила 70%, а специфичность - 93%. Особенности физиологического распределения 99шТс-ЦФГ, в частности низкая аккумуляция его костным мозгом, определяют спектр его клинического применения: наиболее успешно РФП используется для диагностики воспалительных заболеваний костей [92, 107] и септических осложнений после ортопедического протезирования [ИЗ]. Существуют также отдельные публикации, свидетельствующие о возможности использования данного РФП для диагностики бактериального эндокардита [63], которая обусловлена низкой физиологической аккумуляцией 99тТс-ЦФГ в грудине и лёгких.
В настоящее время известно несколько лабораторных методик приготовления тТс-ЦФГ. Проведённый анализ существующих методик введения изотопной метки 99тТс в структуру ЦФГ, показывает, что все они не достаточно удобны для прямого получения РФП в условиях клиник, не обладающих специальным оборудованием для проведения очистки полученного продукта и последующего контроля его качества. На начало проведения настоящих исследований не были разработаны и составы реагентов в виде стандартного набора, при взаимодействии которого с элюатом 99тТс из генератора, будет получаться шТс-ЦФГ с заданными свойствами и требуемыми показателями качества. Следует также отметить, что на сегодняшний день в литературе отсутствуют какие-либо сведения о попытках получения норфлоксацина гидрохлорида, меченного 99тТс (99шТс-НФГ), который по своим характеристикам близок с 99тТс-ЦФГ и тоже имеет все предпосылки для использования в диагностике воспалительных процессов.
В данной работе решались задачи по созданию устойчивых реагентов (в виде стандартных наборов к генератору 99тТс) для получения РФП "Ци-профлоксацин, 99тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" с перспективой их использования для сцинтиграфического обнаружения очагов бактериального воспаления. Полученные данные о диагностической пригодности РФП "Ци-профлоксацин, тТс" и "Норфлоксацин, 99тТс" являются основанием для дальнейшего проведения работ в плане подготовки новых диагностических РФП к серийному производству. В последующем предполагается детальная отработка технологии приготовления реагентов в виде лиофилизатов, с проведением полного комплекса испытаний.
В результате проведённой работы были исследованы процессы образования комплексов 99тТс с ФХ в присутствии восстанавливающего агента Sn (II). Было показано, что кроме ожидаемых целевых продуктов [99тТс-8п-ФХ] или [99тТс-ФХ], может образовываться сопутствующий ком 99тг-г плекс Тс с оловом, а также радиохимические примеси в виде непрореаги-ровавших ионов 99тТс (VII) и его восстановленных ионов 99тТс (IV).
Основным осложняющим фактором при получении РФП, является образование коллоида олова, поглощающего до 70% изотопной метки 99тТс. Предварительные испытания РФП на экспериментальных животных также показали, что основное накопление изотопной метки происходит в печени, что свойственно препаратам, имеющим коллоидную структуру. При этом, с учётом достаточно хорошей растворимости ФХ в водных средах, пришли к выводу, что основной причиной образования коллоида является гидролиз комплекса олова с Тс. С целью снижения количества коллоида в получаемых РФП были проведены исследования в двух направлениях. Первый путь состоял в смещении величины рН среды при смешивании реагентов с элюатом 99шТс в более кислую область, второй - в изменении общего количества Sn (II) в составе реагента, для нахождения оптимальной концентрации восстановителя.
При изучении влияния рН среды готовых индикаторов на коллоидообразование было выявлено, что для получения РФП с предельно низким содержанием коллоида, величина его рН не должна превышать 2, что ограничивает возможность его использование для внутривенного введения. В этом плане, более предпочтительным оказался путь снижения коллоида, за счёт уменьшения в составе исходного реагента количества Sn (II).
Предельные значения концентраций Sn (ожидаемых целевых продуктов [99тТс-8п-ФХ] или [99тТс-ФХ], может образовываться сопутствующий ком 99тг-г плекс Тс с оловом, а также радиохимические примеси в виде непрореаги-ровавших ионов 99тТс (VII) и его II), обеспечивающие минимальное содержание коллоида в РФП при допустимом количестве радиохимической примеси невосстановленного 99тТс (VII)-1% составили 0,120-0,175 мг. Для РФП "Ципрофлоксацин, гаТс" количество радиоактивного коллоида в этом случае составляет 10%, для "Норфлоксацин, 99тТс" - 5%. Анализ результатов исследований, проведенных на экспериментальных животных показывает, что при уменьшении содержания Sn (II) в составе реагентов накопление РФП "Ципрофлоксацин, тТс" в печени снижается с 71% до предельно минимального значения 14%), с одновременным увеличением накопления в почках с 1 до 10%. Аккумуляция препарата "Норфлоксацин, 99тТс" в печени так же снижается с 46 до 1%, с одновременным увеличением накопления в почках с 1 до 10% . Данные результаты позволяют сделать вывод, что РФП с содержанием Sn (II) в пределах 0,105-0,175 мг, могут быть использованы без дополнительной фильтрации.
Одновременно с изучением процесса коллоидообразования исследовалось влияние Sn (II), на изменение относительной активности 99тТс в отдельных комплексах, образующихся в РФП, а также его влияние на количество радиохимической примеси невосстановленных ионов 99тТс (VII). На основании полученных данных было сделано заключение, что по мере уменьшения в составе реагента содержания Sn (II), относительная активность комплекса [Sn (IV)c (IV)], снижается более чем в 6 раз, а активность комплекса [ЦФГ 93
