Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Фосфорорганические соединения (ФОС). История создания 14
1.2. Роль казанской школы фармакологов в изучении ФОС 15
1.3. Димефосфон – наиболее изученный представитель малотоксичных ФОС с неантихолинэстеразныммеханизмом действия 19
1.3.1. Общая характеристика 19
1.3.2. Острая и субхроническая токсичность димефосфона 19
1.3.3. Гипотермические свойства 21
1.3.4. Противосудорожная активность 22
1.3.5. Антидотные свойства при отравлении животных антихолинэстеразными средствами 23
1.3.6. Противовоспалительная активность 25
1.3.7. Участие димефосфона в метаболических процессах 26
1.3.8. Применение димефосфона в клинике 30
1.3.9. Аналоги Димефосфона 31
1.4. Современные тенденции по изучению малотоксичных ФОС в
фармакологии 32
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 35
2.1. Объекты исследования 35
2.2. Определение острой токсичности 36
2.3. Изучение влияния курсового введения исследуемых препаратов на общее состояние и функции печени крыс 37
2.4. Изучение антидотного действия при отравлении животных антихолинэстеразными фосфорорганическими соединениями (ФОС) 38
2.5. Изучение противосудорожной активности 39
2.6. Изучение противовоспалительной активности на модели каррагенинового отека лап у крыс 40 2.7. Изучение противовоспалительной активности на модели адъювантного артрита у крыс 40
2.8. Изучение антимикобактериальной активности 41
2.9. Изучение антимикробной активности 42
2.10. Изучение исследовательской и двигательной активности 43
2.11. Исследование влияния на мышечный тонус 43
2.12. Определение соединения 8а и Изониазида в водных растворах, органах и тканях 43
2.13. Статистическая обработка данных 44
ГЛАВА 3. Биологическая активность аналогов димефосфона с модификацией функциональных групп у атома фосфора (результаты собственных исследований) 45
3.1. Роль эфирных связей у атома фосфора в молекуле аналогов Димефосфона в
проявлении фармакологических эффектов 45
3.1.1. Общее действие и острая токсичность соединения 2а 45
3.1.2. Антидотное действие соединения 2а при отравлении антихолинэстеразным средством Фосфаколом 47
3.1.3. Эффективность комбинированного применения соединения 2а с холиноблокатором атропином и реактиватором холинэстеразы дипироксимом при отравлении мышей антихолинэстеразным средством фосфаколом 48
3.1.4. Противосудорожная активность соединения 2а при отравлении мышей стимуляторами ЦНС 50
3.1.5. Противовоспалительные свойства соединения 2а в сравнении с димефосфоном 51
3.2. Биологическая активность аналогов димефосфона, лишенных эфирных связей
у атома фосфора 52
3.2.1. Общее действие и токсичность диалкилфосфиноксидов 53
3.2.2. Антидотное действие соединения 4d при отравлении антихолинэстеразным средством фосфаколом 53
3.2.3. Противосудорожная активность соединения 4d в сравнении с димефосфоном 54
ГЛАВА 4. Биологическая активность аналогов димефосфона с модификацией кетонной группы в 3-ем положении (результаты собственных исследований) 56
4.1. Биологическая активность аналогов димефосфона, содержащих в 3-ем положении оксимную группу 56
4.1.1. Общее действие и острая токсичность оксимных аналогов Димефосфона 3а, 3b, 3c 56
4.1.2. Влияние соединения 3а на летальность мышей при отравлении антихолинэстеразным средством фосфаколом 57
4.1.3. Сравнительное изучение антидотного действия соединений 3а, 3b и 3c при отравлении мышей фосфаколом 59
4.1.4. Противосудорожная активность соединения 3а при отравлении мышей стимуляторами центральной нервной системы 60
4.1.5. Противовоспалительная активность соединения 3а в сравнении с димефосфоном на модели каррагенинового отека лапки у крыс 63
4.2. Биологическая активность аналогов димефосфона, содержащих в 3-ем положении изоникотиноилгидразидный и никотиноилгидразидный фрагменты 64
4.2.1. Общее действие и острая токсичность гидразонов димефосфона 8а и 8b 64
4.2.2. Антимикобактериальная активности соединений 8а, 8b, изониазида и никотинамида 66
4.2.3. Оценка антимикробной активности гидразонов димефосфона 8а и 8b в сравнении с димефосфоном и изониазидом 67
4.2.4. Противовоспалительные свойства гидразонов димефосфона 8а и 8b в сравнении с димефосфоном и изониазидом 68
4.2.5. Изучение противовоспалительного действия соединения 8а на модели хронического иммунного воспаления 70
4.2.6. Изучение влияния курсового введения соединения 8а на общее состояние и функции печени крыс 72
4.2.7. Изучение влияния курсового введения соединения 8b на общее состояние и функции печени крыс 75
4.2.8. Влияние курсового введения соединения 8а на гепатотоксичность рифампицина в эксперименте 76
4.2.9. Влияние соединения 8а и изониазида на исследовательскую, двигательную активность и мышечный тонус мышей 78
4.2.10. Разработка ВЭЖХ-методики определения соединения 8а и изониазида в водных растворах 79
4.2.11. Изучение стойкости порошка субстанции 8а а также его водного и буферных растворов (pH 1.5, 7.5 и 8.0) 80
4.2.12. Разработка методики определения соединения 8а в крови крыс 82
4.2.13. Некоторые фармакокинетические параметры соединения 8а в сравнении с изониазидом 82
4.2.14. Взаимоотношение изониазида с димефосфоном 85
4.2.15. Влияние димефосфона на содержание изониазида в сыворотке крыс 86
4.2.16. Влияние димефосфона на распределение изониазида во внутренних органах крыс 87
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 92
Выводы .107
Практические рекомендации 109
Список сокращений 110
Список литературы 111
Список иллюстративного материала
- Димефосфон – наиболее изученный представитель малотоксичных ФОС с неантихолинэстеразныммеханизмом действия
- Изучение влияния курсового введения исследуемых препаратов на общее состояние и функции печени крыс
- Эффективность комбинированного применения соединения 2а с холиноблокатором атропином и реактиватором холинэстеразы дипироксимом при отравлении мышей антихолинэстеразным средством фосфаколом
- Биологическая активность аналогов димефосфона, содержащих в 3-ем положении изоникотиноилгидразидный и никотиноилгидразидный фрагменты
Димефосфон – наиболее изученный представитель малотоксичных ФОС с неантихолинэстеразныммеханизмом действия
Пряжниковым Е.Г. изучено влияние димефосфона и его гомологов, содержащих у атома фосфора диэтиловые, дипропиловые и дибутиловые эфиры («диэтон», «дипрон» и «дибуон»), на токи концевой пластинки в нервно-мышечном соединении и проведена оценка зависимости «структура-действие». Эксперименты проводили на изолированном нервно-мышечном препарате (седалищный нерв – портняжная мышца) лягушек Rana ridibund и Rana temporaria. Оказалось, что димефосфон является блокатором открытого ионного канала н-холинорецептора мышечного типа, а его гомологи, являющиеся более липофильными веществами, опосредуют свое действие как через медленный блок открытого ионного канала н-холинорецептора, так и через аллостерическое взаимодействие с ним. С увеличением длины алкильных радикалов растет липофильность соединений, повышается роль аллостерического ингибирования ионного канала холинорецептора и возрастает токсичность соединений для животных [114]. Полученные данные соотносятся с результатами предыдущего исследования каналблокирующих свойств гомологов оксафосфоланола. Авторы указывают на то, что с ростом длины углеводородного радикала возрастает сродство блокатора к липидзависимым местам их связывания [138].
В мире сегодня активно изучается биологическая активность соединений фосфора. Так, одним из перспективных направлений сегодня является изучение ациклических нуклеозидных фосфонатов как потенциальных лекарственных средств с антиретровирусной активностью для лечения ВИЧ-инфекции [151, 181]. Изучаются также фосфонаты, обладающие противовирусной активностью в отношении герпес-вируса, вируса гепатита С [150, 171, 156]. Среди указанных фосфонатов имеются аналоги со специфической активностью в отношении полиомавирусов [185]. Имеются работы, указывающие на то, что алкокси-алкильные производные ациклических нуклеозидных фосфонатов как пролекарства повышают противовирусную активность и снижают токсичность для теплокровных [162]. Фосфонатные аналоги циклопропавирфосфата также обладают противовирусной активностью [173].
Интересными в отношении противомалярийной активности являются производные ациклических иммуциллинфосфонатов [161]. Изучена антишистосомозная активность некоторых алкокси-алкильных эфиров ациклических нуклеозидных фосфонатов [154].
Ряд исследователей изучает ФОС, обладающих противотуберкулезной активностью [149, 158, 172, 169, 174, 178, 166, 184]. Встречаются работы по изучению зависимости «структура-действие» среди кардиопротективных фосфонатов, мишенью которых является сердечный Р2Х-рецептор [167]. В лечении остеопороза высокую эффективность проявляют бисфосфонаты [152, 165, 179].
Совершенно очевидно, что кластер фосфорорганических соединений как потенциальных лекарственных средств продолжает вызывать неподдельный интерес у фармакологов. А опыт создания успешных лекарственных препаратов на основе ФОС еще больше стимулирует фармакологов и химиков на совместную работу, направленную на получение высокоэффективных оригинальных лекарственных средств.
На сегодняшний день, несмотря на то, что накоплен огромный пласт знаний о низкотоксичных ФОС, не раскрыты до конца все механизмы их действия. А многогранность биологического действия димефосфона, как следствие воздействия его на множество систем и функций организма, подчеркивает с одной стороны - неограниченные перспективы синтеза на его основе новых потенциальных лекарств для применения в различных областях медицины, с другой - необходимость поиска универсальных механизмов действия на клеточном уровне, в том числе и учитывая работу ионных каналов.
При изучении аналогов димефосфона важно выяснить, как они действуют в организме – как цельные препараты, или же это результат действия компонентов вследствие метаболизма. Эти данные также могут оказаться ценными для раскрытия механизмов действия соединений.
Одновременно с теоретическими вопросами можно попытаться решать и практические. К примеру, несмотря на широкий спектр фармакологической активности и низкую токсичность, у димефосфона имеются свои недостатки. Это жидкая лекарственная форма, что не позволяет выпускать препарат в виде таблеток, удобных для хранения и транспортировки, и горький вкус, что существенно ограничивает его применение, особенно у детей.
Эти факты побудили авторов исследования к изучению фармакологических свойств новых аналогов димефосфона – продуктов модификации химической структуры оригинального препарата.
В последние годы возникли новые взгляды использования димефосфона в качестве транспортера других лекарственных средств или фармакофорных групп, ответственных за проявление фармакологического эффекта. Этому способствует реакционная способность кетонной группы в 3-ем положении в структуре димефосфона. Так были синтезированы аналоги димефосфона, несущие оксимную группу [39] и гидразидные группы [20].
Изучение влияния курсового введения исследуемых препаратов на общее состояние и функции печени крыс
Противосудорожную активность изучаемых соединений оценивали на мышах, используя модели коразоловых, никотиновых и стрихниновых судорог [36]. Соединения вводили, как правило, в 1/2МПД, а при определении ЭД50 в разных дозах от минимально эффективной до максимально эффективной животным опытной группы внутрибрюшинно за 15 минут до введения судорожного агента. Контрольная группа получала дистиллированную воду. Судорожные яды вводили животным опытной и контрольной групп подкожно в смертельной дозе (ЛД100): коразол в дозе 125 мг/кг, никотин – 25 мг/кг, стрихнин – 2 мг/кг. После введения конвульсанта вели наблюдение за поведением животных: вычисляли латентный период (время от введения судорожного яда до возникновения первых судорог) и продолжительность жизни животных. Также оценивали характер и выраженность судорожного синдрома, вели учет погибших и выживших животных. Критерием противосудорожной активности являлись выживаемость животных, продолжительность их жизни, длительность латентного периода и интенсивность тонической фазы судорог. 2.6. Изучение противовоспалительной активности на модели каррагенинового отека лап у крыс
Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводили на крысах субплантарным введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина (сульфатированный полисахарид из ирландского морского мха) [186]. Выраженность воспалительной реакции оценивали через 3 часа после индукции воспаления по изменению объема лапки, измеряя объем жидкости, вытесненной лапкой при погружении в узкий сосуд, полностью заполненный водой. Исследуемые вещества вводили животным опытной группы внутрибрюшинным способом за 1 час до каррагенина. Контрольная группа получала дистиллированную воду. Противовоспалительный эффект оценивали по степени уменьшения отека лапы крыс по отношению к контролю в объемных единицах (мл) и выражали в % к контролю.
При исследовании противовоспалительной активности соединения 8а использовали также модель адъювантного артрита. Для этого субплантарно вводили 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда в правую заднюю лапу крыс контрольной и опытных групп [177]. Водные растворы исследуемых веществ вводили внутрибрюшинным способом ежедневно, начиная с 1-го дня эксперимента в течение 30 дней. Выраженность воспалительной реакции оценивали по изменению объема воспаленной лапки в динамике (на 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 28, 40, 50, 85-й дни эксперимента). Кроме первичного (острого отека) оценивали и вторичную (иммунную) воспалительную реакцию и летальность. Критерием эффективности изучаемых веществ были снижение летальности и уменьшение объема воспаленной лапки по отношению к контрольной группе (адьювант Фрейнда). 2.8. Изучение антимикобактериальной активности
Бактериостатическую активность в отношении микобактерий туберкулеза против штамма H37Rv изучали совместно с к.м.н., доцентом Честновой Р.В. на базе ГАУЗ «Республиканский клинический противотуберкулезный диспансер» (гл. врач Р.Ш. Валиев), используя стандартную ростовую систему BACTEC MGIT 960 («BectonDickinson», США). Использовали питательную среду Мидлбрук 7Н9 с обогатительной добавкой BACTEC MGIT.
Возбудитель в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 выделяется на основе постоянного компьютерного мониторинга состояния бактериальной популяции. Основным компонентом системы является пробирка MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) с флюоресцентным индикатором роста, который находится под силиконом на дне пробирки и погашается высокими концентрациями кислорода, растворенного в среде. В системе используется обогащенная жидкая питательная среда Middlebrook 7H9. Размножающаяся микробная популяция активно поглощает кислород, высвобождая флюоресцентный компонент, который начинает светиться при ультрафиолетовом облучении. Технология MGIT предполагает периодическое (1 раз в час) ультрафиолетовое тестирование индикаторных пробирок с диагностическим материалом при помощи встроенного компьютера. На жидкокристаллическом дисплее в каждой секции специальные индикаторы высвечивают информацию о наличии положительных и отрицательных посевов. Прибор BACTEC MGIT 960 оценивает пробирку как позитивную, если количество живых микробов ней достигло 100 тыс. на 1 мл среды.
Для подтверждения роста микобактерий в «позитивной» пробирке используют мазок из выросшей культуры с окраской по Цилю – Нильсону для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ). Дополнительно для исключения контаминации мазки из «позитивных» пробирок окрашивают по Граму и применяют пересев содержимого на чашки с кровяным агаром.
В системе BACTEC MGIT 960 для определения лекарственной чувствительности культур микобактерий туберкулеза к исследуемому соединению используется набор индикаторных пробирок, содержащих препараты, которые крепятся на специальном носителе со штрих–кодом для непрерывного мониторинга скорости размножения культуры. Прибор оценивает рост микробной популяции, фиксируя его в специальных единицах роста GU (Growth Unit), и определяет её статус: R (Resistant) – устойчивый и S (Susceptible) - чувствительный.
Антимикробная активность исследуемых соединений изучалиinvitro на 5 видах бактерий (E. сoli, Ps. Aeruginosa, St. Аureus, C. Albicans, S. Paratyphi B) совместно с д.м.н., профессором О.К. Поздеевым, к.б.н., доцентом М.П. Шулаевой на базе ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия». Взвесь суточной культуры бактерий добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие по 1 мл водные растворы изучаемых соединений, при этом конечное разведение испытуемых веществ составило 1:50, 1:100, 1:1000 и 1:10000. Через 2, 24 и 48 часов с помощью платиновой петли делали высевы в пробирки, содержащие по 5 мл питательной среды. Пробирки термостатировали при 37С и проводили наблюдение в течение 7 суток. Контролем служили посевы микробных культур, контактировавшие с аналогичным объемом дистиллированной воды. Индикатором антимикробной активности служило отсутствие роста в пробирке.
Эффективность комбинированного применения соединения 2а с холиноблокатором атропином и реактиватором холинэстеразы дипироксимом при отравлении мышей антихолинэстеразным средством фосфаколом
Безопасность курсового введения соединения 8b оценивали по той же методике, что и для вещества 8а. Всего в эксперименте использовано 20 крыс (по 10 в каждой группе). Длительность введения составила 30 дней.
В первые 20 дней введения каких-либо изменений в поведении животных отмечено не было. Начиная с 21-го дня введения, у крыс в обеих опытных группах появилась некоторая тревожность, агрессивность, обусловленная, вероятно, токсическим действием вводимых агентов на ЦНС.
Анализ динамики изменения массы тела показал, что статистически значимых отличий в массе тела животных в опытной и контрольной группах нет (Рисунок 4).
Динамика изменения массы тела крыс при курсовом введении соединения 8b Расчет относительных масс внутренних органов (печень, почки, селезенка, надпочечники) не выявил достоверных отличий в испытуемых группах (Приложение 5). Статистически значимых различий в показателях красной крови (содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина, СОЭ) в изучаемых группах также не было выявлено (Приложение 5).
Биохимический анализ крови показал, что содержание трансаминаз (АЛТ и АСТ), общего билирубина, глюкозы а также ГГТ в опытной группе не отличалось от контроля (Приложение 5).
Интересно отметить, что курсовое (30 дней) введение соединения 8b вызывает достоверное снижение уровня мочевины по сравнению с контрольной группой (6,5±0,6 и 9,4±1,2 ммоль/л, p 0,05) (Приложение 5). Уровень креатинина не отличался во всех группах (Приложение 5). Таким образом, соединение 8b также не оказывает токсического действия на печень.
Учитывая, что терапия туберкулеза носит комплексный характер и больные, как правило, получают комбинацию из разных препаратов, в состав которых входят изониазид и рифампицин, что в разы увеличивает вероятность развития токсического гепатита [170]. Целью данного эксперимента было оценить, как соединение 8а влияет на гепатотоксичность рифампицина при курсовом введении. Для этого использовали модель токсического гепатита, которая воспроизводится при двухнедельном введении крысам комбинации Изониазида с Рифампицином в соотношении доз 1:2 соответственно [160]. Критерием развития токсического гепатита согласно этой модели является повышение уровня АЛТ и АСТ в 2-3 раза по сравнению с интактными животными.
Вещество 8а вводили опытной группе крыс внутрибрюшинно в дозе187,5 мг/кг. Т.к. молекула соединения 8а состоит из 40% изониазида, то в указанной дозе содержится 75 мг/кг изониазида. Этой же опытной группе вводили рифампицин перорально через желудочный зонд в дозе 150 мг/кг. Водные растворы соединений готовили непосредственно перед введением. Контрольная группа получала дистиллированную воду. В эксперименте использовано 20 белых нелинейных крыс-самцов массой 150-170 г (по 10 животных в каждой группе). Курс введения – 16 дней. Регулярно (каждые 4 дня) регистрировали поведение животных, оценивали динамику роста массы тела. В конце эксперимента животных забивали кровопусканием, кровь отбирали для гематологических и биохимических показателей (АЛТ, АСТ, ГГТ). Определяли относительную массу печени.
Из рисунка 5 видно, что между опытной и контрольной группами достоверной разницы в приросте массы тела нет. Рисунок 5 - Динамика изменения массы тела крыс при курсовом введении комбинации 8а с рифампицином и изониазида с рифампицином
Результаты экспериментов не выявили достоверной разницы в гематологических и биохимических показателях, относительной массы печени между обеими группами, что свидетельствует о том, что курсовое введение соединения 8а в комбинации с рифампицином не оказывает общетоксического и гепатотоксического влияния на животных. 4.2.9. Влияние соединения 8а и изониазида на исследовательскую, двигательную активность и мышечный тонус мышей
Изучение двигательной и исследовательской активности препарата 8а и изониазида проводили с помощью теста «Открытое поле» на 30 белых мышах обоего пола массой 17-24 г. На этой модели использовали эквимолярные дозы: 20 мг/кг для вещества 8а и 8 мг/кг для изониазида - препарата сравнения (молекула препарата 8а состоит на 40% из изониазидного фрагмента и на 60% из димефосфонового). Исследуемые препараты вводили внутрибрюшинно за 30 минут до теста.
Как видно из таблицы 16, изониазид в дозе 8 мг/кг по сравнению с контролем вызывал уменьшение исследовательской и двигательной активности почти в 2 раза (p 0,05), в то время как соединение 8а не влияло на эти параметры.
В следующей серии экспериментов на модели вращающегося стержня оценивали влияние соединения 8а и изониазида на мышечный тонус в дозах 20 и 8 мг/кг соответственно. Фиксировали время удержания животного на стержне, что отражает уровень мышечного тонуса.
Как видно из таблицы 16 время удержания животного на стержне (в секундах), отражающего уровень мышечного тонуса, было для соединения 8а достоверно ниже, чем у контрольной группы - 4,13±1,73 с, то есть гидразон 8а в указанной дозе проявил мышечно-расслабляющее действие. Время удержания в группе изониазида не отличалось от контроля и составило 6,0±4,09 с (контроль -7,25±0,96с). То есть изониазид в малых дозах не обладает миорелаксирующим действием. По-видимому, выявленное свойство 8а обусловлено его молекулой в целом, а не продуктами его гидролиза.
Биологическая активность аналогов димефосфона, содержащих в 3-ем положении изоникотиноилгидразидный и никотиноилгидразидный фрагменты
Противовоспалительные свойства димефосфона установлены как при местном, так и при резорбтивном действии [34]. Возможность проявления противовоспалительной активности у изоникотиноилгидразона 8a, рассматриваемого как одного из потенциальных противотуберкулезных средств, представляет важную научно-практическую ценность, т.к. туберкулез является инфекционным заболеванием, в патогенезе которого существенную роль играет воспаление. Сопоставление противовоспалительной активности димефосфона, гидразона 8а и изониазида в МПД показало, что эффективность этих веществ в отношении каррагенинового отека различается: димефосфон в дозе 1000 мг/кг угнетал развитие отека лапки крысы на 33,1% (p 0,05), 8а (800 мг/кг) – на 64,3% (p 0,05), а изониазид – не проявил такой активности. При уменьшении дозы гидразона 8а в 2 раза (400 мг/кг) его противовоспалительная активность снижается - 31,7% (p 0,05), а доза 200 мг/кг вызывает такой же эффект – 42,3% (p 0,05).
Предполагая, что в организме животных возможен частичный гидролиз гидразона 8а до исходных прекурсоров, то мы изучили противовоспалительную активность комбинации изониазида (160 мг/кг) с димефосфоном (240 мг/кг). Такое соотношение доз препаратов может возникать при полном распаде молекулы 8а, введенного в дозе 400 мг/кг. Оказалось, что применение указанной смеси изониазида и димефосфона дает даже более высокий противовоспалительный эффект (65,9%) по сравнению с веществом 8а, введенным в дозе 400 мг/кг (31,7%) и димефосфоном, введенным в отдельности в дозе 240 мг/кг(36,8%) (p 0,05). Соединение 8а, вероятно, действует в организме как цельная молекула.
Пролиферативная тканевая реакция наиболее характерная и специфическая для туберкулезного воспаления [127]. Нам было интересно выяснить, влияет ли изучаемый нами гидразон 8а на продуктивную реакцию. Для этого оценивали противовоспалительное действие соединения 8а на модели адьювантного артрита у крыс. Результаты исследования показали, что препарат подавлял пролиферативную реакцию на 40,7% на 50-й день после введения адьюванта Фрейнда (p 0,05).
Соединение 8а – потенциальный противотуберкулезный препарат, и изучение его стойкости является одним из этапов доклинических исследований. Химиками, синтезировавшими 8а (профессор Бузыкин Б.И. и сотр.), было высказано предположение, что в кислых средах соединение может разрушаться с образованием исходных продуктов – изониазида и димефосфона.
В первой серии экспериментов изучали стойкость субстанции-порошка. Для этих целей нами был разработан ВЭЖХ-метод определения соединений 8а и изониазида, позволяющий фиксировать оба соединения на одной хроматограмме. Результаты исследования вещества 8а, синтезированного 3 года назад, показали, что примеси Изониазида в нем нет, что говорит о хорошей стойкости субстанции.
Во второй серии экспериментов в течение 3 месяцев изучали динамику гидролиза соединения 8а в водном растворе и фосфатных буферных растворах с pH 1,5, 7,5, 8,0. Как оказалось, в кислой среде соединение 8а разрушается: на хроматограмме уже через 2 часа определяется пик изониазида без пика вещества 8а. Повышение pH в буферных растворах увеличивала стойкость препарата 8а. В водном растворе 8а не стоек и судя по нарастанию содержания в пробе свободного изониазида, через 3 месяца практически полностью разлагается (в пробе определяется 88% изониазида от его первоначального содержания в молекуле соединения 8a). Полученные результаты позволяют предсказать, что пероральное применение препарата 8а нерационально, т.к. в кислой среде желудка он будет разрушаться. Однако это не исключает возможность разработки твердых лекарственных форм, покрытых оболочкой для защиты от кислого содержимого желудка, а также приготовление раствора вещества для парентерального применения непосредственно перед введением (ex tempore). В слабо-щелочной среде кишечника, по-видимому, препарат будет стабилен.
Для нас было интересно изучить взаимоотношение димефосфона с изониазидом, так как они являются фрагментами молекулы 8а. Ранее профессором Хафизьяновой Р.Х. показано противосудорожное действие димефосфона в отношении изониазида. Мы изучали также влияние димефосфона на токсичность изониазида. Оказалось, что димефосфон при совместном применении с изониазидом предупреждает нейротоксический эффект последнего, подавляя судороги и снижая токсичность по ЛД50 в 1,57 раз.
Далее было исследовано влияние димефосфона в дозе 200 и 1000 мг/кг на фармакокинетику изониазида. Анализ фармакокинетических кривых, полученных методом ВЭЖХ, показал, что в группах (изониазид, 100 мг/кг + димефосфон, 200 мг/кг) и (изониазид, 100 мг/кг + димефосфон, 1000 мг/кг) концентрация изониазида была достоверно ниже, чем в контрольной группе (изониазид, 100 мг/кг). Причем, в группе (изониазид, 100 мг/кг + димефосфон, 1000 мг/кг) это явление было более выраженным. Таким образом, димефосфон дозозависимо уменьшает конечную концентрацию изониазида в крови. Для объяснения полученного явления было изучено влияние димефосфона на распределение изониазида во внутренних органах (головной мозг, легкие). Результаты исследования показали, что в группе (изониазид, 100 мг/кг + димефосфон, 1000 мг/кг) концентрация изониазида в крови и в органах достоверно ниже, чем в группе (изониазид, 100 мг/кг). Более того в сыворотке крыс группы (изониазид, 100 мг/кг + димефосфон, 1000 мг/кг) выявлен пик при длине волны 263 нм, по характеристикам, совпадающий с пиком 8а. В группе (изониазид, 100 мг/кг) этот пик не определялся.
