Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 9
1.1 Полимерные сорбенты и носители для выделения биологически активных веществ 9
1.2. Полимерные сетчатые сорбенты, применяемые для сорбции макромолекул 10
1.3. Макропористые сорбенты 13
1.4. Гетеросетчатые сорбенты 14
1.5. Макросетчатые сорбенты 16
1.6. Новые подходы к синтезу сорбентов 17
1.7. Особенности при использовании сорбционных методов при выделении и очистке белков 24
1.8. Виды хроматографических процессов. Ионообменная и гидрофобная хроматография 25
1.9. Термодинамический и кинетико-динамический анализ сорбционных процессов. 30
1.10. Модификация биологически активных веществ 38
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 46
2.1. Структура и свойства панкреатической дезоксирибонуклеазы 46
2.2. Структура и свойства цитохрома С 47
2.3. Физико-химические характеристики сорбентов 49
2.4. Физико-химические характеристики применяемых ПАВ. 50
2.5. Носители для иммобилизации 51
2.6. Свойства хлоргексидина биглюконата 52
2.7. Определения концентрации белка по методу Лоури 53
2.8. Определение концентрации белка по методу с биуретовым реактивом (связыванием с Кумасси синим) 54
2.9. Определение ферментативной активности ДНК-азы в растворе 55
2.10. Количественное определение цитохрома С 57
2.11. Гельхроматографический анализ 57
2.12. Метод определения концентрации хлоргексидинабиглюконата 58
2.13. Метод кислотно-щелочной обработки сорбентов 58
2.14. Модификация сорбентов 59
2.15. Методика по изучению комплексов с липосомами и гликосферами 59
2.16. Исследование сорбции белков в статических условиях (рН-зависимость и изотермические процессы сорбции) 60
2.17. Исследование кинетики сорбции белков 61
2.18. Проведение процесса сорбции и десорбции в динамических условиях 62
2.19. Статистическая обработка результатов 62
ГЛАВА 3 Изучение равновесных и кинетических параметров сорбции ферментов на различных хроматографических носителях 63
3.1. Сорбция ферментов на ионогенных и молекулярном сорбентах с модифицированной и немодифицированной поверхностью 64
3.2. Термодинамический анализ сорбции 70
3.3. Кинетический анализ сорбции 75
ГЛАВА 4 Исследование динамических процессов сорбции и десорбции 80
4.1. Теоретический анализ условий оптимизации. Изучение влияния скорости подвижной фазы на процесс сорбции ферментов из многокомпонентной смеси 80
4.2. Изучение динамического процесса выделения цитохрома С на сульфокатионитах КУ-23 и С-160 90
4.3. Изучение динамического процесса выделения ДНК-азы на сульфокатионитах КУ-23 и С-160 92
4.4. Разработка гибкой технологической схемы выделения и очистки цитохрома С и ДНК-азы на сульфокатионите КУ-23 95
ГЛАВА 5 Модификация панкреатической днк-азы с целью создания новых готовых лекарственных форм 97
5.1. Изучение влияния антисептика, липосом и глигосфер на активность ДНК-азы 97
5.2. Изучение процесса связывания ДНК-азы с наноматериалами и хлоргексидином по кинетике диффузии через пористые мембраны 100
5.3. Изучение процесса связывания фермента с антисептиком 103
5.4. Изучение процесса связывания фермента с липосомами и гликосферами 104
5.5. Влияние гликосфер на стабильность активности ДНК-азы в растворе 107
5.6. Салфетки медицинские для обработки воспаленных участков кожи, слизистой, а также профилактики герпетических высыпаний «Герпестоп»108
Заключение 113
Список литературы 115
Приложения 130
- Полимерные сетчатые сорбенты, применяемые для сорбции макромолекул
- Определение концентрации белка по методу с биуретовым реактивом (связыванием с Кумасси синим)
- Сорбция ферментов на ионогенных и молекулярном сорбентах с модифицированной и немодифицированной поверхностью
- Изучение процесса связывания ДНК-азы с наноматериалами и хлоргексидином по кинетике диффузии через пористые мембраны
Введение к работе
Актуальность работы. Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии. Ферментные препараты широко используются во многих отраслях промышленности: медицинской, микробиологической и других. Особое значение в настоящее время приобретает получение лекарственных средств на основе ферментов из животного сырья, которые могут успешно заменить продукты аналогичного действия, производимые химическим и микробиологическим синтезом. Гидролитические ферменты имеют ряд особенностей, выгодно отличающих их от другого вида сырья: высокая эффективность в микроколичествах, высокая специфичность, быстрое достижение желаемого результата, возможность создания на их основе продукта с заданными свойствами. Однако, расширение номенклатуры новых лекарственных форм, включающих ферменты, затруднено в виду их высокой лабильности, а также инактивации ферментов за счет взаимодействия с компонентами лекарственных форм. Все это не позволяет выдерживать срок хранения готового продукта (2-3 года). Современные достижения позволяют использовать такие носители, которые могут не только устранить негативное воздействие сопутствующих компонентов, но и стабилизировать сами ферменты.
Потребность в ферментных препаратах определяет необходимость
совершенствования технологии их выделения с целью получения
высокоочищенных ферментов. В настоящее время при получении
высокоочищенных ферментных препаратов значительную роль играют
сорбционные методы, которые, однако, недостаточно широко используются в
промышленности. Особенности физико-химических свойств белковых
макромолекул, а именно: большая молекулярная масса, лабильность молекулы, с одной стороны, и многокомпонентность растворов, содержащих помимо целевых компонентов большое количество примесных соединений различной природы, с другой стороны, свидетельствуют о том, что выделение и очистка ферментов представляет определенные трудности.
Наиболее эффективной является гибкая технологическая схема, где на
одном и том же оборудовании можно получать несколько препаратов в
зависимости от потребности рынка. Задачей работы является разработка
сорбционно-хроматографического метода выделения и очистки
панкреатической ДНК-азы и цитохрома С на одном хроматографическом носителе.
Целью работы явилась разработка эффективной гибкой схемы выделения и очистки ДНК-азы и цитохрома С, которая позволит оптимизировать существующую технологию, увеличить выход и чистоту целевого продукта, а также создать новую фармацевтическую композицию для профилактики герпетических высыпаний.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить равновесные, термодинамические и кинетические закономерности сорбции цитохрома С и ДНК-азы на различных хроматографических носителях (ионогенных и неиногенных), на основании чего выбрать оптимальный сорбент для препаративной хроматографии.
-
Теоретически обосновать условия разделения компонентов смеси, на примере смеси цитохрома С и ДНК-азы; оптимизировать хроматографический процесс по скорости подвижной фазы.
-
Подобрать селективные параметры выделения и очистки ферментов с целью разработки гибкой технологической схемы для имеющихся производственных мощностей.
-
Разработать состав и технологию производства изделия медицинского назначения на основе ДНК-азы и носителя, которая может использоваться для лечения заболеваний, вызванных вирусами герпеса.
-
Разработать методики качественного и количественного анализа изделия медицинского назначения с целью стандартизации.
-
Разработать нормативную документацию на изделие медицинского назначения салфетки медицинские для обработки воспаленных участков кожи, слизистой, а также профилактики герпетических высыпаний «Герпестоп» -проект ТУ и лабораторный регламент.
-
Изучить стабильность ДНК-азы в полученном изделии для обоснования сроков годности.
Научная новизна. Впервые созданы и изучены комплексы ДНК-азы с липосомами и гликосферами, позволяющие получить на их основе новые лекарственные средства, обеспечивающие стабильность ДНК-азы в течении срока годности.
Впервые разработана и оптимизирована гибкая схема выделения и очистки ферментов, имеющих различные физико-химические свойства, с использованием одной и той же хроматографической системы.
Теоретически обоснованы условия разделения компонентов смеси, на примере смеси цитохрома С и ДНК-азы; оптимизирован хроматографический процесс по скорости подвижной фазы.
Практическая значимость. На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований:
Разработаны состав и технология производства изделия медицинского назначения салфетки медицинские для обработки воспаленных участков кожи, слизистой, а также для профилактики герпетических высыпаний «Герпестоп»;
Разработан лабораторный регламент на производство салфеток медицинских «Герпестоп»;
Составлены технические условия (ТУ 9393-021-01899876-2009) на салфетки медицинские для обработки воспалённых участков кожи, слизистой, а
также для профилактики герпетических высыпаний "Герпестоп» для ЗАО «Московская фармацевтическая фабрика», данный вид продукции внедрен в производство и реализуется на территории РФ (Акт о внедрении от 17.04.2014
г.);
Предложен эффективный масштабируемый способ очистки ДНК-азы и цитохрома С, исключающий недостатки известной схемы очистки фермента и позволяющий увеличить выход целевого продукта, сократить время технологического цикла процесса получения фермента и повысить удельную активность препарата (номер заявки на патент 2013144910). Предложенный способ апробирован в цехе ферментных препаратов ООО «Самсон-Мед» (Акт о внедрении от 10.02.2014 г.);
Результаты выполненной работы используются в учебном процессе СПХФА при изучении дисциплины «Химия и технология выделения и очистки биологически активных веществ» (Акт о внедрении от 18.03.2014 г.)
Апробация работы
Основные результаты исследований были доложены на научно-практической конференции «Фармация из века в век» (СПб, 2008), IV международной научно-практической конференции «Наука: теория и практика» (Прага, 2008), III международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни» (Белгород, 2008), XV Международный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи, входящие в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК РФ и подана 1 заявка на патент.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Экспериментальное доказательство эффективности модели оптимизации хроматографического разделения в двухкомпонентной системе по скорости подвижной фазы при разделении цитохрома С и ДНК-азы.
-
Показана возможность выделения и очистки различных ферментов (ДНК-азы и цитохрома С) с использованием гибкой технологической схемы.
-
Результаты исследований по обоснованию состава и технологии получения изделия медицинского назначения.
-
Результаты изучения стабильности изделия салфеток медицинских «Герпестоп» для обоснования срока годности.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 144 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 147 страницах, содержит 12 таблиц, 33 рисунка.
Полимерные сетчатые сорбенты, применяемые для сорбции макромолекул
Структуры сетчатых сополимеров возникают при полимеризации с использованием взаиморастворимых мономеров, каждый из которых является хорошим растворителем для образующегося сополимера. При дегидратации сетчатые сорбенты образуют непроницаемые блочные структуры [44, 72]. Разработка наиболее регулярных сетчатых полимерных структур развивалась на основе реакций в цепях полимеров, когда уже образованные линейные полимерные макромолекулы, содержащие реакционноспособные мономеры, вступают во взаимодействие между собой, образуя наиболее регулярные структуры изопористых сорбентов [11].
Среди сетчатых полиэлектролитов наибольшее значение для выделения и очистки БАВ имеют карбоксильные сорбенты. В отличие от поликислот, содержащих сульфогруппы, они не проявляют существенной каталитической активности даже при значительном повышении кислотности раствора [43, 89]. Вместе с тем, возможность плавного изменения степени ионизации в карбоксильных ионитах позволяет регулировать энергию их межмолекулярного взаимодействия с органическими противоионами. При этом образуются обратимо диссоциирующие полимерные комплексы, в которых можно осуществлять полную десорбцию БАВ. Кроме того, низкие величины значений рК фиксированных групп сульфо- и фосфорнокислых ионитов требуют применения сильнокислых и сильнощелочных растворов при сорбции и десорбции органических веществ. На карбоксильных катионитах эти же процессы протекают в относительно «мягких» физико-химических условиях, при которых в большинстве случаев не происходит структурных изменений нативной формы БАВ [66].
Полимерные сетчатые сорбенты могут быть синтезированы на основе процессов полимеризации или поликонденсации. В сравнении с поликонденсационными полимеризационные сорбенты обладают большей механической прочность [66].
Среди катионитов поликонденсационного типа главное место занимают сорбенты фенолформальдегидной природы. Поликонденсационные иониты обычно получают на основе формальдегида и простых эфиров фенола, содержащих карбоксильные группы, - феноксиуксусной, оксифеноксиуксусной. Поликонденсационные карбоксильные иониты мало набухают в водородной форме, что обусловлено гидрофобной природой сетчатой матрицы [66].
Сорбционная емкость полимерных сорбентов по отношению к ионам органических веществ составляет лишь часть от емкости тех же сорбентов по отношению к ионам металлов. Одной из причин снижения сорбционной емкости органических веществ является незначительная степень пористости зерен ионитов, ограничивающая доступность функциональных групп для ионов большого размера. У поликонденсационных гелевых ионитов происходит увеличение размеров пор по сравнению с полимеризационными. Это, по-видимому, обусловлено образованием большого числа физических узлов в сетчатых структурах, возникающих при полимеризации [66]. Показано, что термодинамические константы ионного обмена, характеризующие избирательность сорбции ионов органических веществ при их конкуренции с ионами натрия или водорода, возрастают при усложнении как структуры сорбируемого иона, так и структуры полиэлектролита. Это обусловлено полифункциональными взаимодействиями различного типа [4, 30, 31]. В частности, наблюдалось увеличение избирательности сорбции ионов органических веществ при переходе от полимеризационных ионитов к поликонденсационным, включающим, например, значительное количество щестичленных циклических структур. Так, иониты КФУ и КФУХ по отношению к антибиотикам эритромицину, неомицину, стрептомицину и др. имеют константы избирательности более высокие, чем иониты КБ-4П-2 и КБ-4 [4, 31]. Этот эффект был объяснен как неоднородностью химической и физической структур поликонденсационных ионитов, так и наличием ароматических ядер и фенольного гидроксила, что ведет к проявлению дополнительного взаимодействия ионитов с сорбируемыми ионами. Полимеризационные сетчатые карбоксильные катиониты обычно получают на основе метакриловой и акриловой кислот или их эфиров, так как эти соединения наиболее доступны и относительно легко сополимеризуются с другими мономерами. В качестве сшивающих агентов применяют дивинилбензол, диметакрилаты этилен- и диэтиленгликоля, алилметакрилат [89]. Карбоксильные катиониты, полученные сополимеризацией указанных мономеров характеризуются невысоким набуханием, как и поликонденсационные иониты, особенно в неионизированной водородной форме, несмотря на использование гидрофильных алифатических кислот и их производных. Дополнительной причиной формирования мало набухающих сеток является проведение сополимеризации в отсутствии разбавителя мономерной смеси, приводящее к образованию большого количества физических узлов и к увеличению плотности сетки, вследствие значительного переплетения цепей в процессе сополимеризации. При этом использование поливинильных соединений гидрофобной природы еще в большей степени снижает способность матрицы к набуханию [89].
Определение концентрации белка по методу с биуретовым реактивом (связыванием с Кумасси синим)
Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка.
Метод предназначен для определения белка в пробе с концентрацией не более 0,03 мг/мл.
Ход анализа: К 1,5 мл образца, содержащего не более 50 мкг белка (0,03 мг/мл), добавляют 1,5 мл реактива; через 20-30 минут измеряют поглощение при 595 нм.
Приготовление реагента:
а) 100 мг Кумасси ярко-синего G-250 растворяют при энергичном перемешивании в 50 мл 95 % этанола и смешивают этот раствор со 100 мл 85 % фосфорной кислоты. Смесь разбавляют до 1 л водой и фильтруют для удаления нерастворившегося красителя. Раствор устойчив 1-2 недели. б) 60 мг Кумасси ярко-синего G-250 растворяют в 1 л 3 % хлорной кислоты и фильтруют для удаления нерастворившегося красителя. Величина поглощения при 465 нм должна быть между 1,3 и 1,5. Этот раствор устойчив в течение неопределенно долгого времени.
Если имеют дело с концентрированными белковыми растворами ( 5 мг/мл), удобнее взять 1,5мл воды или разбавленного раствора хлористого натрия, добавить образец, при помощи микролитрового,шприца, тщательно перемешать раствор и затем добавить в него красящий реактив. Концентрированный белковый раствор при контакте с красящим реактивом будет давать осадок. Реактив а) дает более высокое поглощение, чем реактив б) но он менее устойчив. Концентрацию белка определяли по калибровочному графику, построенному по модельному раствору альбумина (рисунок 2.5.).
За единицу активности дезоксирибонуклеазы (ЕА) принимают количество фермента, вызывающее при воздействии его на субстрат (ДНК) в стандартных условиях освобождение такого количества кислоторастворимых веществ, которое приводит к возрастанию оптической плотности при длине волны 260 нм на одну единицу.
Ход анализа: В контрольную и две опытные пробирки вносят по 0,5 мл субстрата и 0,3 мл 0,2 М трис-буфера, рН=7,0. В опытные пробирки прибавляют по 0,2 мл приготовленного раствора препарата. Все пробирки выдерживают в водяном термостате при (37,5±0,5)С в течение 30 минут по секундомеру, после чего в каждую пробирку вносят по 1 мл охлажденного на ледяной бане 1 М раствора хлорной кислоты (осадителя). В контрольную пробирку прибавляют 0,2 мл раствора препарата. Пробирки сильно встряхивают и выдерживают во льду в течение 20 минут по секундомеру. Образовавшиеся осадки отделяют центрифугированием в течение 10 минут по секундомеру при 4000 оборотов в минуту. Из надосадочного слоя отбирают по 0,5 мл раствора, прибавляют по 2,5 мл воды и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 260 нм, против воды, в кювете с толщиной слоя в 10 мм. Содержание единиц активности (ЕА) вычисляют по формуле: _ где: А2бо - разница величин оптических плотностей опытной и контрольной проб;
Активность 1 мг дезоксирибонуклеазы субстанции по ФС 000223-011111 должна быть не менее 1700 ЕА/мг. 2.10. Количественное определение цитохрома С
Определение концентрации цитохрома С основано на его свойстве изменять окраску при переходе железа гема из окисленной формы в востановленную.
Ход анализа: К 3 мл испытуемого раствора добавляли 0,30,5 мг NaНS03. Через 30 секунд определяли величину экстинции при А,=550 нм и толщине кюветы 10 мм. Концентрация цитохрома С равнялась величине экстинции, исходя из калибровочного графика (рисунок 2.6.), построенного по цитохрому С (чистота образца 0,999).
Оптическая плотность, 7 Метод гельхроматографического анализа на разделении молекул различных веществ в соответствие с их размерами при прохождении через молекулярное сито [77].
В качестве молекулярно-ситового геля использовали сефадекс фирмы «Sigma» G-75, пригодный для фракционирования глобулярных белков с молекулярной массой от 5000 до 150000 Да, что соответствует диапазону молекулярных масс белков, исследуемых в работе.
Ход анализа: Предварительно набухший гель загружали в колонку объемом 9,5 мл. Колонку предварительно промывали дистиллированной водой. Далее наносили пробу - 1 мл исследуемого раствора. Элюцию вели дистиллированной водой. Скорость элюции была постоянной и составляла 30 мл/час. Во фракциях определяли содержание белка по методу Лоури, а также концентрацию ДНК-азы.
Определение свободного объема колонки. Для определения V0 брали голубой декстран с М=106 Дa. Вещества с такой молекулярной массой не задерживаются в геле и объем их выхода равен свободному объему колонки.
Количественное определение по ФС 42-2761-98.
Ход анализа: В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 мл 0,05 % препарата или 1 мл 0,1 % препарата или 2 мл 0,5 % препарата, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (растворы А, В и С соответственно). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мл раствора А или 10 мл раствора В или 1 мл раствора С, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Оптическую плотность полученного раствора измеряют на спектрофотометре в области максимума поглощения при длине волны 253 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют воду.
Сорбция ферментов на ионогенных и молекулярном сорбентах с модифицированной и немодифицированной поверхностью
Одним из способов повышения эффективности сорбционных методов является модификация поверхности сорбентов с целью уменьшения или увеличения плотности заряда на полимерной матрице [20]. При этом возможно использование различных поверхностно-активных веществ (ПАВ) катионного или анионного типа, которые, присоединяясь к поверхности зерна гидрофобными концами, образуют вторичные заряженные центры за счет гидрофильных ионогенных концов, обращенных в фазу раствора. Поэтому, сорбент, предварительно обработанный ПАВ катионного (анионного) типа, будет более избирательно сорбировать органические молекулы, несущие отрицательный (положительный) заряд.
С целью выбора оптимальных условий очистки ферментов в статических условиях были изучены рН-зависимости емкости сорбции ДНК-азы и цитохрома С из трис-буферного раствора на ряде сорбентов АР-500, С-160 и КУ-23.
Как видно из рисунка 3.1. а) на молекулярном сорбенте АР-500 с не модифицированной поверхностью не наблюдается изменения емкости сорбции ДНК-азы от рН равновесного раствора из-за отсутствия функциональных групп, способных к ионизации. Кроме того, при достаточно высокой емкости сорбции невозможна десорбция без использования органических растворителей. Однако, вид зависимости существенно меняется при введении заряженных группировок. Емкость сорбции ДНК-азы уменьшается в кислой области рН (при рНрI) и возрастает в щелочной области рН (при рНрI), что обусловлено возникновением электростатических взаимодействий молекул белка с положительно заряженными группировками катамина. Сорбцию следует проводить в щелочной области, а десорбцию – в кислой, где ДНК-аза наиболее стабильна. Таким образом, с молекулярного сорбента АР-500 возможно провести почти полное снятие фермента без применения органического растворителя, что в дальнейшем может представлять практический интерес. Для цитохрома С прослеживается аналогичная зависимость (рисунок 3.1. б)), но дополнительно наблюдается понижение емкости сорбции в области рН=рI когда белок имеет нейтральный заряд.
Как видно из рисунка 3.2., максимальная емкость сорбции ДНК-азы наблюдается на сорбентах С-160 и расположена в кислой области рН. Емкость сорбции на сорбенте КУ-23 меньше, однако, проведение десорбции возможно сразу после перезарядки фермента вблизи изоточки (4,5-5). На катионите С-160 процесс десорбции возможен в более щелочной области рН=811 и, по-видимому, будет затруднен. Даже при высоких значениях рН после перезарядки белка не наблюдается полноты десорбции. Это связано с большой гидрофобностью этих носителей. С целью уменьшения гидрофобности была проведена модификация сорбента растворами катамина различных концентраций. Катамин закрыл часть гидрофобной поверхности и ввел заряженные группировки (рисунок 3.2.).
Как видно из рисунка 3.3. а) максимальная емкость сорбции ДНК-азы на сульфокатионите С-160 и расположена в кислой области рН и уменьшается при рН рI. Емкость сорбции на сорбенте КУ-23 меньше, однако, проведение десорбции возможно сразу после перезарядки фермента вблизи изоточки. На катионите С-160 процесс десорбции возможен в более щелочной области рН (8-11) и, по-видимому, будет затруднен. Даже при высоких значениях рН после перезарядки белка не наблюдается полноты десорбции. По всей вероятности, это связано с большой гидрофобностью этих носителей. Поэтому возможно потребуется введение органического растворителя для разрыва гидрофобных связей и облегчения процесса десорбции, что не требуется для КУ-23.
Изучение процесса связывания ДНК-азы с наноматериалами и хлоргексидином по кинетике диффузии через пористые мембраны
Следующим этапом работы было выяснение возможности расчета количества ДНК-азы в комплексе для изучения стабильности фермента во времени, что необходимо при создании готовой формы. Для этого применили метод кинетики диффузии через пористые мембраны, который позволяет рассчитать количество свободного и связанного в комплекс с носителем фермента (раздел 2.15). Этот метод был эффективно использован для изучения растворимых комплексов фермент : полимер.
Оптимизация условий для применения метода
Для проведения экспериментов по методу кинетики диффузии ДНК-азы через пористые мембраны необходимо было подобрать полупроницаемую мембрану. Для исследования были взяты слабонабухающие мембраны фирмы “Millipore” с диаметром пор 0,22 мкм, 0,65 мкм и 1,22 мкм. Выбор мембраны обуславливался следующими требованиями:
- необходимо, чтобы мембрана пропускала фермент и была непроходимой для носителя, с которым изучается процесс связывания;
- прохождение фермента через пористую перегородку должно подчиняться линейной зависимости.
Экспериментальные данные по подбору пористой перегородки представлены на рисунок 5.3., из которого видно что для каждой из мембран наблюдается начальный прямолинейный участок, выходящий на плато тем позднее, чем больше размер пор мембраны. Причем, угол наклона для каждой из мембран различается незначительно. Однако, в результате для ДНК-азы была выбрана мембрана с диаметром пор 0,22 мкм, так как при большем значении размера пор велика вероятность прохождения через мембрану комплекса ДНК-азы с носителем.
Подбор оптимальной концентрации фермента
Для оптимизации экспериментов по методу кинетики диффузии ДНК-азы через пористые мембраны изучалось прохождение через пористую мембрану с размером пор 0,22 мкм растворов ДНК-азы с концентрациями фермента 1; 1,5; 2 мг/мл Экспериментальные данные по подбору оптимальной концентрации представлены на рисунке 5.4., из которого видно что при уменьшении концентрации фермента начальный прямолинейный участок сокращается. Это объясняется большей скоростью прохождения фермента при снижении его содержания в растворе. При концентрации ДНК-азы равной 1 мг/мл прямолинейный участок практически отсутствует. При концентрации ДНК-азы равной 1,5 мг/мл он настолько мал, что проведение эксперимента сильно затруднено. Таким образом, концентрация ДНК-азы 2 мг/мл при использовании мембраны с размером пор 0,22 мкм является оптимальной.
Пример расчета проницаемости мембраны 0,22 мкм для ДНК-азы по формуле (2.3.). Для расчета использовались три контрольные точки, значения которых взяты с рисунка 5.4. Результаты расчета представлены в таблице 5.1.
Так как в предыдущем опыте (раздел 5.1.) показано влияние хлоргексидинабиглюконата на общую активность ДНК-азы, то можно предположить, что это происходит вследствие связывания антисептика с ферментом. Чтобы подтвердить это была исследована кинетика прохождения ДНК-азы через пористую мембрану в присутствии хлоргексидинабиглюконата.
Эксперимент проводили по методу кинетики диффузии через пористые мембраны с системой фермент:антисептик. Из рисунка 5.5. видно, что кинетическая кривая фермент:антисептик проходит ниже кинетической кривой нативной ДНК-азы, что говорит о сильное связывание фермента с антисептиком. Это происходит, возможно, вследствие взаимодействия ДНК-азы и хлоргексидина с образованием ассоциатов, которые не проходят через мембрану. Расчет количества связанной и свободной ДНК-азы не представляет интереса, так как образующиеся комплексы и ассоциаты находятся в растворе.
Особый интерес представляет изучение процесса связывания ДНК-азы с липосомами и гликосферами, так как они, являясь липофильными соединениями, имеют гидрофильные внешнюю и внутреннюю части. Поэтому фермент может проходить внутрь ядра и быть на наружной оболочке, липосомы имеют не такую жесткую структуру, как гликосферы, что не препятствует проникновению субстрата и повышению активности фермента.
В результате экспериментов были получены кинетические кривые С, мг/мл=ґ0, мин) для ДНК-азы в комплексе с гликосферами и липосомами.
Как видно из рисунка 5.6., получены свои кинетические кривые для разных носителей для иммобилизации. В камере №1 количество свободной ДНК-азы уменьшилось (преобладает ДНК-аза связанная, которая не проходит через полупроницаемую перегородку), соответственно, резко снизилась и скорость проникновения ее через мембрану в камеру №2, то есть произошло уменьшение угла наклона кривой к оси Х, что и говорит о явном связывании фермента носителями. Причем, чем меньше угол наклона кривой, тем больше происходит связывание в комплекс.
Пользуясь полученными данными, а также, зная проницаемость мембраны, были рассчитаны концентрации связанного в комплекс с носителем и свободного фермента. Аналогично рассчитывали концентрации ДНК-азы свободной и связанной для липосомами. Получили следующие значения: Ссвоб=0,21 мг/мл, Ссвяз=1,79 мг/мл. То есть, процент связывания ДНК-азы с липосомами составил 90 %, с гликосферами 70 %. Зная общую активность ДНК-азы в растворе, для сравнения связывания различными носителями удобно пользоваться такой величиной, как удельная активность, которая показывает, сколько единиц активности фермента приходится на один грамм носителя. Таким образом, этот показатель составляет 7560 ЕА/г и 18360 ЕА/г гликосфер и липосом, соответственно.
Кроме того, интерес представляло изучение процесса связывания ДНК-азы с носителями по методу кинетики диффузии через пористые мембраны в различных соотношениях фермент:носитель. Для этого ставились эксперименты с системой ДНК-аза : гликосферы в соотношениях 2:1, 8:1, 14:1. результаты опытов представлены на рисунке 5.7., из которого видно что для разных концентраций гликосфер получены свои кинетические кривые, причем, чем больше концентрация гликосфер, тем меньше угол наклона кривой к оси Х. Однако, при существенном изменении соотношений, угол наклона меняется не столь значительно. Пользуясь полученными данными и зная проницаемость мембраны, были рассчитаны концентрации связанного в комплекс с гликосферами и свободного фермента и представлены в таблице 5.2.
