Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Перспективы применения противовоспалительных свойств бетулина (обзор литературы) 11
1.1. Биологические свойства основных компонентов бересты экстракта сухого 11
1.2. Гепатопротекторы - средства патогенетической терапии заболеваний печени 16
1.3. Гепатит С - актуальная проблема гепатологии 24
Заключение 31
Глава 2. Материал и методы исследования 32
2.1. Общая структура исследований 32
2.2. Исследуемое вещество 34
2.3. Исследование ранозаживляющих свойств бетулина 34
2.4. Изучение противоожоговой активности бетулина 36
2.5. Оценка противовоспалительного действия бетулина 39
2.6. Определение противомикробного действия бетулина 40
2.7. Оценка гепатопротекторного действия бетулина 41
2.8. Клиническая оценка противовоспалительной активности бетулина у больных хроническим гепатитом С 43
Глава 3. Результаты экспериментальных исследований 48
3.1. Влияние бетулина на репаративную регенерацию травмированной кожи 48
3.1.1. Сравнительное изучение влияния бетулинсодержащих мазевых композиций на морфофункциональное состояние кожи в условиях механической травмы 55
3.2. Влияние бетулина на репарацию ожоговых ран 65
3.2.1. Сравнительное изучение влияния бетулинсодержащих мазевых композиций на морфофункциональное состояние кожи в условиях термотравмы 65
3.3. Влияние бетулина на воспалительный процесс 71
3.4. Влияние бетулина на рост исследуемых бактериальных тест-культур 73
3.5. Влияние бетулина на течение D-галактозаминового гепатита 75
Глава 4. Результаты клинических исследований 77
4.1. Клиническая характеристика больных хроническим гепатитом С 77
4.2. Оценка биохимических и молекулярно биологических показателей у больных хроническим гепатитом С 80
4.3. Оценка ферментов антиоксидантной защиты у больных хроническим гепатитом С 83
4.4. Динамика клинических и лабораторных показателей на фоне лечения бетулином у больных хроническим гепатитом С 89
Заключение 96
Глава 5. Обсуждение результатов 98
Выводы 114
Практические рекомендации 115
Список литературы 116
- Биологические свойства основных компонентов бересты экстракта сухого
- Клиническая оценка противовоспалительной активности бетулина у больных хроническим гепатитом С
- Сравнительное изучение влияния бетулинсодержащих мазевых композиций на морфофункциональное состояние кожи в условиях термотравмы
- Динамика клинических и лабораторных показателей на фоне лечения бетулином у больных хроническим гепатитом С
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время активно ведется поиск и изучение различных лекарственных средств растительного происхождения. Фитопрепараты популярны как среди врачей, так и среди пациентов, поскольку по общепринятому мнению их эффективность и безопасность проверены временем (Stickel et al., 2005; Christen, Cuendet, 2012). Тем не менее, лишь небольшое количество средств растительного происхождения обладают выраженной эффективностью и широким спектром активности с минимальными побочными эффектами (Seeff, 2007). В связи с этим большой интерес представляет изучение активности тритерпеновых соединений из коры березы и в первую очередь наиболее распространенного из них – бетулина, обладающего разнообразными фармакологическими эффектами (Барнаулов О.Д., 1986; Дьячук Г.И. с соавт., 2004; Weckesser et al., 2010). В частности, противовоспалительная активность бетулина опосредована его репаративным, антиоксидантным, противомикробным и противовирусным действием (Иванова С.А. с соавт., 2004; Радькова Е.А., 2007; Носик Н.Н. с соавт., 2005; Szuster-Ciesielska et al., 2010). Также известно, что противовоспалительная активность бетулина значительно превышает таковую у нестероидных противовоспалительных средств (Рапп О.А., 1993). Все это обусловливает необходимость оценки противовоспалительного действия бетулина при различных вариантах воспаления, в том числе у больных хроническим гепатитом С.
Проблема вирусных гепатитов с гемоконтактным путем передачи не утратила своей актуальности. Хотя на первое место среди парентеральных вирусных гепатитов выходит гепатит B, которым инфицировано порядка 2 млрд. человек на земном шаре (Шахгильдян И.В. с соавт., 2003), но лидерство постепенно переходит к HCV-инфекции (Шахгильдян И.В. с соавт., 2008). По данным ВОЗ, что во всём мире вирусом гепатита C инфицировано 500-700 миллионов человек, что составляет около 10% населения земного шара (Аналитический обзор «Вирусные гепатиты в Российской Федерации», 2008; Maghlaoui, 2012). В России число инфицированных HCV составляет около 5 млн. человек (Михайлов И.В., Шахгильдян И.В., 2007). В то же время имеется высокая вероятность хронизации (80%), а также развития цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы как исхода HCV-инфекции (de Oliveria Andrade et al., 2009). Основным направлением лечения гепатита C является этиотропная терапия комбинацией препаратов интерферона и рибавирина (Козлов В.К. с соавт., 2008). Стандартная терапия хронического гепатита С пегилированными формами интерферона- и рибавирином приводит к элиминации вируса у 50% больных, инфицированных 1-м генотипом HCV, и у 80% пациентов, инфицированных 2-м и 3-м генотипами вируса (Zeuzem, 2008), что показывает относительную устойчивость вируса гепатита C к этиотропной терапии. Помимо того, этиотропная противовирусная терапия имеет множество нежелательных побочных эффектов (Pockros, 2012), делая невозможным её применение у ряда пациентов.
Латентное течение HCV-инфекции, отсутствие методов специфической профилактики и, кроме того, высокая стоимость этиотропной терапии и невысокая эффективность в случае хронизации гепатита C, повышают необходимость поиска новых методов патогенетического лечения этого заболевания с участием гепатопротекторов. Желательным для данной категории веществ является наличие противовоспалительных свойств в сочетании с минимальными побочными эффектами.
Все это послужило основанием для проведения данного исследования.
Цель исследования
Изучить противовоспалительные свойства бетулина и в экспериментальных и клинических условиях обосновать его применение.
Задачи исследования
-
На модели полнослойной кожно-плоскостной раны у крыс изучить противовоспалительные и репаративные свойства бетулина с дальнейшей их оценкой на модели ожогов уха кролика.
-
Изучить влияние бетулина на различные фазы воспалительного процесса на модели «ватной гранулемы».
-
Оценить бактерицидные свойства бетулина на культурах микроорганизмов S. aureus, B. cereus, P. aeruginosa и E. coli.
-
На модели D-галактозаминового гепатита у крыс оценить гепатопротекторное действие бетулина.
-
Оценить динамику клинико-лабораторных, молекулярно-биологических (вирусную нагрузку при различных генотипах) показателей и антиоксидантное действие бетулина у пациентов с хроническим гепатитом C.
Личный вклад автора
Личное участие автора осуществлялось на всех этапах подготовки и проведения научной работы, включавших определение основной идеи исследования и методов его выполнения. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор современной зарубежной и отечественной литературы, выполнены все экспериментальные исследования и комплексное клиническое обследование пациентов, включенных в исследование с оценкой и анализом результатов их обследования.
Научная новизна работы
В данной работе получены новые данные о противовоспалительной активности бетулина в различных концентрациях на моделях полнослойной кожно-плоскостной, ожоговой раны, модели «ватной гранулемы», а также о гепатопротекторном действии на модели D-галактозаминового гепатита и у больных хроническим гепатитом C с цитолитическим синдромом.
Впервые показано, что противовоспалительное действие бетулина в эксперименте обусловлено как специфическим ранозаживляющим, противоожоговым, антиэкссудативным и антипролиферативным действием, так и бактерицидной активностью преимущественно в отношении грамотрицательных микроорганизмов.
Установлены наиболее эффективные концентрации бетулина, обладающие выраженным противовоспалительным и репаративным действием. Впервые установлено, что гепатопротекторное действие бетулина при D-галактозаминовом гепатите обратно пропорционально его концентрации.
В клинике установлено, что бетулин нормализовал активность АЛТ и снижал уровень РНК вируса гепатита C в плазме крови больных хроническим гепатитом С, проявляя гепатопротекторную и противовирусную активность.
Практическая значимость работы
Данные, полученные в результате проведенного исследования, позволили рекомендовать включение бетулинсодержащих мазей в схему лечения раневых и ожоговых процессов, а также определить оптимальную концентрацию бетулина и состав мазевой основы.
Полученные экспериментальные данные о наличии у мазевых композиций, содержащих бетулин, противовоспалительного и репаративного эффектов могут представлять практический интерес в области хирургии и косметологии.
Экспериментально и клинически обоснована возможность использования бетулина в практике гепатологии в качестве нового гепатопротектора с противовирусной активностью.
Данные о гепатопротекторной и противовирусной активности бетулина легли в основу методических рекомендаций «Бетулин – новый гепатопротектор в терапии легочного туберкулеза и вирусных поражений печени».
Биологические свойства основных компонентов бересты экстракта сухого
Целебные свойства березы известны с давних времен. Береста, являющаяся наружной частью коры березы, содержит большое количество химических соединений, представляющих интерес для медицины, ветеринарии и фармацевтической промышленности. На территории РФ в лесной и лесостепной зоне Европейской части и Сибири широко распространены береза бородавчатая (повислая) В. pendula Roth. (В. verrucosa Ehrh.) и береза пушистая В. pubescens Ehrh. (Куцик Р.В., Зузук Б.М., 2001; Первышина Г.Г. с соавт., 2002). В настоящее время наиболее полно изучен химический состав березы бородавчатой, особенно кора, из которой выделено 17 производных лупанового и олеананового ряда. Общее содержание тритерпеноидов в коре березы бородавчатой достигает 315 г/кг в пересчете на абсолютно сухое сырье. Доминирующим является тритерпеновый спирт бетулин, который придает наружной части коры белую окраску (Бромштейн А.Л. с соавт., 1994).
Кора березы состоит из наружной части (береста) и внутренней (луб). Береста содержит в основном органические вещества (рис. 1), которые
Процентное содержание веществ в коре березы бородавчатой можно подразделить на структурные компоненты и экстрактивные вещества. К структурным компонентам относят углеводную и ароматическую части древесины.
Ароматическая часть древесины, или лигнин, представляет собой смесь ароматических полимеров родственного строения. Доля лигнина составляет около 20%. К углеводной части относят комплекс полисахаридов, называемый холоцеллюлозой (Кислицын А.Н., 1994). Общая доля полисахаридов составляет около 10%. Суберин (от лат. suber — пробковое дерево) — название, данное Бусиньолем в 1836 г. веществам, извлеченным спиртовой щелочью из коры пробкового дерева (Quercus suber). Он представляет собой полиэфир, состоящий из высокомолекулярных жирных кислот и гидроксикислот с образованием сетчатой полимерной структуры -полиэстолида. Содержание суберина бересте березы бородавчатой порядка 30% -40% (Ekman, 1983). Оставшиеся 30-40% занимают экстрактивные вещества.
Среди экстрактивных веществ у большинства видов берез преобладают пентациклические тритерпеноиды лупанового ряда, реже олеананового, хотя могут присутствовать и представители урсанового ряда. Отличия этих тритерпеноидов лишь в скелете кольца Е. Основным представителем лупанов является бетулин, содержание которого в зависимости от вида березы, ее возраста, места и условий ее произрастания в пределах 10-35% (Похило Н.Д., Уварова Н.И., 1988).
Бетулин был впервые получен из березовой коры путем сублимации в 1788 году Т. Ловицем. В 1831 году Мэзон дал полученному веществу название «бетулин». Позднее бетулин стали получать путем экстракции. На сегодняшний день известны способы получения бересты экстракта сухого (БЭС) с содержанием бетулина не менее 70% (Кузнецов Б.Н. с соавт., 1997; Кузнецова С.А. с соавт., 2005; Левданский В.А. с соавт., 2008).
Химический состав БЭС зависит от используемого сырья и способа получения. В экстрактах коры этих берез помимо бетулина содержатся его окисленные производные: бетулиновая кислота, бетулиновый альдегид, метиловый эфир бетулиновой кислоты, бетулоновый альдегид, бетулоновая кислота (Ekman, 1983). Постоянным спутником бетулина является лупеол, составляюший около 10% от общего количества бетулина. Наряду с производными лупана, кора березы содержит тритерпены ряда олеонана и урсана (рис. 2).
Биологические свойства БЭС обусловлены действием компонентов, входящих в его состав. При этом следует отметить, что спектр свойств БЭС шире, а активность выше, чем у субстанции бетулина, поскольку в составе БЭС содержатся компоненты со сходными с бетулином эффектами.
Имеющиеся экспериментальные данные показывают, что лупеол обладает противовоспалительной (de Souza et al., 2012) и противоопухолевой (Zhang et al., 2009; Saleem et al., 2009) активностью. Также известны противоаллергические, иммуномодулирующие (Vasconcelos et al., 2008; Maurya et al., 2012) и ранозаживляющие эффекты лупеола (Harish et al., 2008). Известна способность лупеола снижать риск формирования камней в почках путем предотвращения повреждения тканей почек, а также влиять на процесс растворения мочекаменных конкрементов (Malini et al., 2000). Олеаноловая и урсоловая кислоты способны оказывать противовоспалительное (Huang et al., 2010; Maurya et al., 2012), противоопухолевое (Yan et al., 2010), антимикробное (Wolska et al., 2010), гепатопротекторное (Nakahara et al., 2011; Wu et al., 2011) и противодиабетическое действия (Kuroda et al., 2012). Кроме того, известны гиполипидемическая (Liu et al., 2011) и анти-ВИЧ активность олеаноловой кислоты (Kashiwada et al., 1998).
Среди окисленных производных бетулина представляет интерес бетулоновая и бетулиновая кислоты. Изучение свойств бетулоновой кислоты выявило наличие противоопухолевой (Liu et al., 2012), протиововоспалительной (Lee et al., 2012) и умеренной анти-ВИЧ активности (Gu et al., 2007). Бетулиновая кислота действует сочетанно с бетулином, однако в ряде случаев её активность превышает таковую у бетулина. Несмотря на все многообразие свойств, основное внимание исследователей посвящено изучению противовирусной (особенно анти-ВИЧ) и противоопухолевой (преимущественно антимеланомной) активности бетулиновой кислоты. Известно, что бетулиновая кислота и ее производные ингибируют ВИЧ-1. С помощью производного IC9564 выяснилось, что бетулиновая кислота взаимодействует с гликопротеидами оболочки ВИЧ-1, то есть gpl20 и gp41 (Sun et al., 2002). Противоопухолевая активность бетулиновой кислоты и ее производных обусловлена действием на митохондрии, вызывающим избирательный апоптоз раковых клеток (Fulda et al., 1998). Бетулиновая кислота и ее производные являются меланома-специфическими токсическими агентами (Suresh et al., 2012).
Бетулин является средством поливалентного действия. В настоящее время известны: противовоспалительная (Lee et al., 2012; de Moraes et al., 2012), противовирусная (Weckesser et al., 2010), желчегонная и гепатопротекторная (Дьячук Г.И. с соавт., 2004, Юрченко И.В., 2005), антиоксидантная и антифибротическая (Szuster-Ciesielska et al., 2010), анальгетическая (Lin et al., 2008), противогрибковая и антибактериальная (Радькова Е.А., 2007), ранозаживляющая (Иванова С.А. с соавт., 2004), гипогликемическая и гиполипидемическая (Tang et al., 2011), эстрогенная (Mellanen et al., 1996), противоопухолевая и антиангиогенная (Dehelean et al., 2012), антиоксалатная (Malini et al., 2000) и противоязвенная (Барнаулов О.Д., 1986) активность бетулина. Детальная характеристика всех эффектов бетулина выходит за рамки данного обзора.
Противовоспалительная активность бетулина, а также бетулиновой кислоты обусловлена их стероидоподобной структурой. Механизм действия этих соединений сходен с глюкокортикоидами, то есть связан с блокадой фосфолипазы А2, играющей ключевую роль в синтезе таких провоспалительных агентов, как простагландины (Bernard et al., 2001). Согласно данным Рецио с соавт. (1995), бетулиновая кислота проявляет более выраженную противовоспалительную активность, чем бетулин (Recio etal., 1995).
В работе Миуры с соавт. (1999), оценивалось защитное действие бетулина и бетулиновой кислоты в отношении токсического гепатита, вызванного дихлоридом кадмия. При этом было выяснено, что бетулин способен очень сильно снижать цитотоксично сть кадмия в таких минимальных концентрациях как 0,1 цг/мл (Miura et al. 1999).
В исследовании И.В. Юрченко (2005), посвященном изучению гепатопротекторного действия бетулина на 4-х моделях гепатита (парацетамоловая, алкогольная, тетрахлорметановая и D-галактозаминовая) удалось выявить, что бетулин в дозах 1-10 мг/кг предупреждал развитие цитолитического, холестатического и мезенхимально — воспалительного синдромов на моделях острого гепатита.
Клиническая оценка противовоспалительной активности бетулина у больных хроническим гепатитом С
Настоящее исследование проведено в период с 2009 по 2011 гг., на базе ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России (директор - доктор биологических наук академик РАМН О.И. Киселев) в отделении экспериментальной терапии хронических вирусных гепатитов (заведующая отделением - доктор медицинских наук, профессор Е.В. Эсауленко) .
Все обследованные больные - 18 мужчин (43%) и 24 женщины (57%) в возрасте от 20 до 71 года (средний возраст 38±14 лет), проживают в Санкт-Петербурге и Ленинградской области.
Больных отбирали в случае соответствия следующим критериям:
- наличие серологических признаков хронического гепатита С (выявление HCVAb)
- наличие цитолитического синдрома (повышение активности АЛТ в сыворотке крови в 1,5-2 и более раз)
- наличие репликативной активности HCV, определяемое посредством качественного теста на содержание в сыворотке крови генетического материала вируса (РНК ВГС) методом полимеразно-цепной реакции (ПНР).
Исключение составили пациенты с наличием антител к вирусу иммунодефицита человека, вирусам гепатита В и D, а также активные потребители внутривенных наркотических средств в последние 6 месяцев.
Также больных исключали из группы исследования при отсутствии возможности динамического наблюдения за клиническими и лабораторными показателями, пропуске более трех приемов препарата за время всего курса лечения и в случае развития серьезных нежелательных явлений, связанных с приемом препарата.
Отбор и включение пациентов в группу исследования, а также проведение первичных клинических и диагностических процедур осуществлялось за один месяц до начала приема бетулина. За всеми больными проводили клиническое наблюдение, включавшее в себя опрос жалоб, выяснение анамнеза заболевания, эпидемиологических данных, наличие сопутствующих заболеваний и осложнений. Далее проводили осмотр по органам и системам. В ходе обследования уточняли возраст, определяли индекс массы тела (ИМТ), оцениваемый как отношение массы тела в кг к квадрату роста в м (кг/м ) и выявляли клиническую симптоматику ХГС:
- астеновегетативный синдром (общая слабость, утомляемость, снижение работоспособности, головокружение, нарушение сна, эмоциональные нарушения и другое);
- геморрагический синдром (кровоточивость десен, носовые, кожные, внутренние кровотечения);
- нарушение пигментного обмена (характерное изменение цвета мочи и\или стула, иктеричность склер и\или кожных покровов);
- гепатомегалию;
- спленомегалию;
- отечно-асцитический синдром (асцит, венозные коллатерали, периферические отеки).
Для уточнения наличия сопутствующей патологии определяли симптомы и симптомокомплексы, характеризующие состояние органов и систем.
Лабораторные методы, использованные для оценки течения ХГС и уточнения функционального состояния печени, включали в себя общеклинические, биохимические, серологические и молекулярно-биологические методы. Клинический анализ крови с определением количества эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов, лейкоцитов с лейкоцитарной формулой и СОЭ проводили на гематологическом анализаторе РСЕ-90 (ERMAINC Япония).
Биохимический анализ крови включал в себя определение активности АЛТ, ACT, уровня общего билирубина, общего холестерина, глюкозы, щелочной фосфатазы (ЩФ) и у-глутамилтранспептидазы (ГГТП). Уровень этих показателей определяли тест-системами Thermo Electron на автоматическом анализаторе Konelab 20i (фирма "ThermoFisher Scientific", США). Границы нормы АЛТ составляют для женщин менее 31 Ед/л, для мужчин менее 40 Ед/л, ACT - менее 31 Ед/л для женщин и менее 37 Ед/л для мужчин. Для общего билирубина границы нормы составляют 3,4-20,5 мкмоль/л, общего холестерина - 3,0-6,0 ммоль/л, глюкозы - 3,3-5,5 ммоль/л, щелочной фосфатазы - до 240 Ед/л для женщин и до 270 Ед/л для мужчин и ГГТП - 8,8-22,0 Ед/л для женщин и 10,4-33,8 Ед/л для мужчин (Назаренко Г.И., Кишкун А.А., 2007).
Суммарные антитела (HCVAb) к HCV определяли на анализаторе для проведения иммуноферментного анализа STAT-FAX 3200 (фирма STAT-FAX, США).
Всем пациентам проводили молекулярно-биологическое исследование РНК вируса гепатита С в плазме крови для оценки фазы-стадии вирусного цикла с последующим определением генотипа вируса. Качественное определение РНК и генотипирование вируса проводили методом ПЦР с электрофоретической детекцией 1а, 1в, 2 и За генотипов с помощью амплификатора «Терцик» и тест-систем «Амплисенс» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзор (Москва, Россия). Восемнадцати больным группы исследования проводили количественную оценку РНК вируса в 1 мл крови (вирусную нагрузку) с учетом результата в режиме real time тест-системами «Амплисенс HCV FRT» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзор (г. Москва, Россия).
У 23 больных исследуемой группы, у 22 больных группы сравнения и у 17 здоровых добровольцев в лизате отмытых эритроцитов с помощью полуавтоматического биохимического анализатора Microlab-300 ROKI-2002 (Vital Scientific, Голландия) определяли ферменты антиоксидантной системы - супероксиддисмутазу (СОД) и глутатионпероксидазу (ГПО).
Глутатионпероксидаза с помощью гидроперикиси кумина катализирует окисление глутатиона. В присутствии глутатионредуктазы и NADPH окисленный глутатион сразу же восстанавливается с соответствующим окислением NADPH в NADP+. Отражающее этот процесс уменьшение абсорбции измеряют при 340 нм. Полученную активность ГПО затем приводят к 1 г гемоглобина (НЬ) и этот показатель (К) выражают в Ед/г НЬ (Моин В.М., 1986).
Метод определения активности супероксиддисмутазы предполагает, что ксантин в присутствии ксантиноксидазы генерирует супероксидные радикалы, которые, взаимодействуя с реактивом INT (2-(-иодофенил)-3(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия хлорид), формируют прокрашивание красным формазаном. Таким образом, активность СОД определяется по степени ингибирования этой реакции (Ко et al., 2005). Нормальные значения: для ГПО 29,6-82,9 Ед/г НЬ, для СОД 1092-1817 Ед/г НЬ.
В комплекс обязательных исследований для всех пациентов входило ультразвуковое исследование органов брюшной полости с целью уточнения степени поражения печени, а также выявления сопутствующей патологии. С целью определения основных размеров печени пользовались следующими ориентирами: среднеключичная линия справа, линия, проходящая через седьмое ребро справа налево в горизонтальной плоскости. При поиске нижней полой вены ориентировались на линию параллельную срединной и отстоящую от нее на 3 см. В обязательном порядке визуализировалась поджелудочная железа, воротная и селезеночные вены. Селезенку исследовали в поперечном срезе в области левого подреберья по линии, отстоящей на 6 см от мечевидного отростка. Исследование желчного пузыря проводилось по линии, отстоящей примерно на 5-6 см от срединной. Исследования проводили на аппарате Logiq а200. Перед процедурой все больные проходили соответствующую подготовку. Клинический осмотр и лабораторное обследование проводили раз в 4 недели.
Сравнительное изучение влияния бетулинсодержащих мазевых композиций на морфофункциональное состояние кожи в условиях термотравмы
Также изучали гистоморфологическую картину ожогового процесса на 3, 8 и 13 сутки ожогового процесса. При сравнительной микроскопической оценке динамики заживления ожоговых ран (термотравм) в опытной группе (0,5% бетулин), группах контроля (мазевая основа) и сравнения («Пантенол») установлено, что процессы репарации в каждой из групп несмотря некоторые общие тенденции заметно отличаются как по длительности, так и по качеству.
На 3 сутки во всех группах некроз ожоговой поверхности ещё не достиг своего максимума, и большая часть ткани ушной раковины в месте ожога под погибшим эпителием находится в состоянии некробиоза. Очаг термического повреждения представлен центральным участком и зонами реактивных изменений, идущими с краев. В центре имеется тотальный некроз эпителия и части субэпителиальной ткани с лейкоцитарной инфильтрацией, кровоизлияниями (рис. 21 а, б, в).
В группе контроля в краевых участках граница с зоной некроза не четкая, имеется умеренно выраженная гиперемия, отек, очаговая лейкоцитарная и слабо выраженная плазмоцитарная инфильтрация (рис. 21 а).
В группе сравнения («Пантенол») в краевых участках диффузная слабо выраженная лейкоцитарная инфильтрация с фокусами созревающей грануляционной ткани, за которой следует слабо выраженная зона гиперемии и отека со слабо и умеренно выраженной лейкоцитарной инфильтрацией (рис. 21 б).
В опытной группе с нанесением на ожоговую поверхность 0,5% бетулиновой мази чётко очерчены краевые зоны некроза с фибрином и лейкоцитарной инфильтрацией, в смежных с некрозом участках умеренно выраженная зона гиперемии, отек, ангиоматоз со слабо выраженной лейкоцитарной и плазмоцитарной инфильтрацией, разрастание грануляционной ткани небольшими участками по границе некроза (рис. 21 в).
В период с 3 по 8 сутки активность воспалительного процесса нарастает, коррелируя с увеличением площади ожоговой поверхности при макроскопическом исследовании, что связано с изменением реактивности повреждённых ожогом тканей и переходом их в большинстве случаев из состояния некробиоза в некроз (рис. 22 а, б, в).
На 8 сутки в центральной зоне повреждения некроз захватывает эпителий и субэпителиальный слой до хрящевой пластинки (0,5% бетулин и «Пантенол») и частично хрящевую пластинку (мазевая основа). Некроз рыхло связан с краевыми участками (мазевая основа, «Пантенол»). В краевых участках наблюдается умеренная гиперемия, отек (мазевая основа), слабо выраженная лейкоцитарная и лимфоплазмоцитарная инфильтрация, за которой следует грануляционная ткань с разными этапами созревания, в глубоких отделах признаки коллагенообразования. В смежных участках с гранулирующими структурами выраженная продолженная зона гиперемии («Пантенол»).
В группе контроля (мазевая основа) поверхность с начальными проявлениями эпителизации и неравномерной незавершенной дифференцировкой под струпом (рис. 22 а).
К 13 суткам активность воспалительного процесса снижается. В группе контроля (мазевая основа) и сравнения («Пантенол»), процесс некробиоза завершается некрозом части хрящевой пластинки - повреждение доходит до хряща и проникает в его толщу (рис. 23 а, б).
Хрящевая пластинка, являющаяся опорным каркасом для всех остальных тканей в результате повреждения не способна удержать некротические массы, что приводит к её разрыву и полному отторжению некротизированных тканей на всю толщу ушной раковины. В результате этого процесса эпителизация ожоговой поверхности в этих группах сводится к смыканию эпителиальных пластов с верхней и нижней части ушной раковины. Эпителизация на 13 сутки тотальная в обеих исследуемых группах (мазевая основа, «Пантенол») с выраженной («Пантенол») или неравномерно завершённой (мазевая основа) дифференцировкой эпителия. Под эпителием молодая соединительная ткань с беспорядочным ходом и различным соотношением клеточных и волокнистых структур (мазевая основа, «Пантенол»).
В опытной группе с обработкой ожоговых ран 0,5% бетулином процесс некробиоза постепенно разрешается восстановлением целостности хряща (в части хрящевых клеток вновь заметны ядра, надхрящница вновь воспринимает кислые красители). Сосуды надхрящницы, прорастая в некротизированные ткани, способствуют очищению повреждённых ожогом тканей от некротических масс благодаря миграции лейкоцитов в очаг некроза, а также развитию постепенно созревающей грануляционной ткани с наползающим на неё в виде клина эпителием. На 13 сутки под струпом субтотальная эпителизация поверхности в виде тонкого длинного клина с незавершенной дифференцировкой, зона некроза резко уменьшена (рис. 23 в).
Во всех исследуемых группах в смежных с ожогом участках умеренно выраженная гиперемия и отек с очаговой лейкоцитарной и лимфогистиоцитарной инфильтрацией.
В нашем исследовании снижение достоверности полученных результатов также могло быть обусловлено выбором модели исследования. Это связано с тем, что на данной модели невозможно дозировать силу прижатия раскаленного металлического стержня к уху, что обусловливает некоторые различия в глубине ожога у каждого отдельно взятого животного.
Учитывая выявленный противовоспалительный эффект 0,5% бетулиновой мази на модели кожно-плоскостных и ожоговых ран как макроскопически, так и при гистоморфологическом исследовании, нами проведено сравнительное изучение противовоспалительной активности этой мази на специфической модели воспалительного процесса - "ватная гранулёма", которая является высокоинформативной и позволяет оценить антиэкссудативный и антипролиферативный эффекты изучаемой мазевой композиции.
В качестве препарата сравнения использовали известное противовоспалительное средство - 0,5 % преднизолоновую мазь.
На 8 сутки эксперимента после извлечения гранулем сначала была определена масса влажных гранулем у каждой группы животных, а после инкубирования в термостате и масса сухих гранулем (табл. 3).
Динамика клинических и лабораторных показателей на фоне лечения бетулином у больных хроническим гепатитом С
Все обследованные больные были разделены на 2 группы. Группе из 42 больных в дальнейшем был назначен бетулин (исследуемая группа), оставшимся 22 пациентам — «Хофитол» (группа сравнения).
Сравнительная характеристика основных параметров обеих групп приведена в табл. 20.
Через месяц после приема бетулина, больные стали отмечать улучшение самочувствия. Жалобы астенического характера поступали гораздо реже - только 8 больных (20%) продолжали испытывать слабость и ощущали снижение работоспособности. Симптоматика диспептического и депрессивного синдромов встречалась в два раза реже. Так дискомфорт в области правого подреберья встречался лишь у 13 человек, тогда как жалобы на плохой аппетит, утреннюю тошноту и запоры отмечали 4 пациента. На подавленность, плохое настроение продолжали жаловаться четверо больных ХГС (рис. 28).
Терапию бетулином продолжали до трех месяцев. После окончания лечения больные практически не предъявляли жалобы на самочувствие. Симптоматика астено-вегетативного характера выявлялась лишь у 8 человек (10%). При этом динамика диспептических проявлений также оказалась более благоприятной для пациентов. В частности, дискомфорт в правом подреберье стал встречаться в три раза реже по сравнению с первоначальным уровнем, и полностью исчезли другие проявления диспептического синдрома. К тому же, только в 10% случаев у больных оставались незначительные периодические жалобы депрессивного характера (рис. 29).
Больные из группы сравнения, принимавшие в течение 30 дней препарат «Хофитол» также были опрошены и их жалобы оценены суммой баллов. При этом как в группе исследования, так и в группе сравнения были получены статистически значимые различия до и после лечения (табл. 21).
Влияние бетулина и «Хофитола» на цитолитический синдром оценивали по изменению активности АЛТ и ACT (табл. 22). Тенденция к снижению активности данного синдрома наблюдалась у обеих групп больных уже через месяц после начала терапии, но в каждом случае имела свои особенности. В группе исследования (бетулин) средняя активность АЛТ снизилась на 10% и составила 92±63 Ед/л, активность ACT - на 16%, в среднем - 60±30 Ед/л, однако в обоих случаях снижение не было статистически значимым. В группе сравнения («Хофитол») до начала терапии активность АЛТ составила в среднем 131=1=69 Ед/л, через месяц терапии имелась тенденция к снижению АЛТ на 9% (119±97 Ед/л). При этом снижение активности ACT на 38% было статистически значимым.
Поскольку согласно инструкции курс приема «Хофитола» составляет 2 - 3 недели, то после месячного курса терапии прием препарата был прекращен. Терапию бетулином решено было продлить до трех месяцев, поскольку для оценки противовирусного действия препарата необходим ранний вирусологический ответ (Gallegos-Orozco et al., 2003; Martinot-Peignoux et al., 2009). После окончания третьего месяца терапии бетулином (рис. 30) в 71% случаев активность АЛТ снизилась практически в 2 раза от своего первоначального уровня - до 56±23 Ед/л (р=0,046), приблизившись к нормальным значениям. Также нами отмечена тенденция к снижению активности ACT - до 47±9 Ед/л (р =0,669). Снижение АЛТ и ACT составило 54% и 48% соответственно.
Отчетливое снижение вирусной нагрузки после окончания терапии бетулином отмечалось у 12 больных, однако у 6 пациентов ее уровень не изменился. Медиана уровня РНК ВГС в плазме крови пациентов составила 5,7х105 [25313-lxlO6] копий/мл, то есть произошло снижение вирусной нагрузки в 10 раз от первоначального уровня (р=0,016) (рис. 31).
В результате удалось выявить статистически значимое (р=0,001) повышение активности СОД. Через месяц от начала терапии активность СОД выросла незначительно, тем не менее, после 3 месяцев приема бетулина активность СОД у больных увеличилась в среднем в 1,7 раза.
Активность ГПО после приема бетулина в течение месяца несколько снизилась (в 1,2 раза), однако к 3 месяцу вновь повысилась. Следует отметить, что по сравнению со стартовыми значениями средняя активность ГПО к 3 месяцу приема препарата практически не изменилась, но при этом уровень ГПО стабилизировал свои значения (уменьшилось стандартное отклонение). В то же время все изменения активности ГПО имели только характер тенденции, поскольку статистическую значимость выявленных изменений подтвердить не удалось (р=0,792).
На фоне терапии «Хофитолом» наблюдалась тенденция к повышению активности СОД и статистически значимое возрастание активности ГПО (табл. 24).
Следует особо отметить, что на протяжении всего курса лечения больные не отмечали ухудшения самочувствия или каких-либо других нежелательных явлений, которые могли быть связаны с приемом бетулина, что говорит о хорошей его переносимости.
