Введение к работе
Актуальность. .. Широкое распространение иммунопатологических состояний, в частности, иммунодефицитов среда населения, ставит исследователей перед необходимостью разработки спевдальной методологии раннего выявления заболеваний иммунной системы организма с целью их профилактики и своевременной коррекции болезни (Ковальчук Л.В.; Чередеев А.Н., 1990; Петров Р.В. и др.. 1992).
По данным органов здравоохранения, выявлена взаимосвязь уровней заболеваемости населения с экологической ситуацией в регионах, особое внимание обращается на возникновение вторичных иммунодефицитных состояний в условиях длительного контакта с пестицидами.(Материалы МЗ СССР, подготовленные для Комитета Верховного Совета СССР по вопросам экологии и рационального использования природных ресурсов, по мерам защиты населения СССР от неблагоприятного воздействия нитратов и пестицидов при использовании их в сельском хозяйстве. 199р г.).
- За последнее десятилетие накоплены данные, свидетельствующие о том. что пестициды, загрязняющие окружающую среду,способны нарушать функциональную целостность иммунной системы (Кенигсберг Э.Я. , 1981; РузыСакиев P.M.,1986).
Возникла новая область науки - иммунотоксикология. объектом изучения которой является кгмуниая система как "мишень" воздействия ксенобиотиков.
Эксперты ВОЗ при Формировании в 1989 г. в Лондоне "Международной программы сотрудничества в области иммунотоксиколо-пга" (ICIPV в рамках "Международной программы по безопасности химических веществ" (IPCS) признали актуальность и необходимость исследований по следующим основным направлениям.'
а) исследование иммунологических' характеристик организма
при воздействии пестицидов, включая резистентность организма
хозяина;
б) изучение аутоиммунных реакций организма;
в) поиски иммунохимических методов защиты от отравлений и
иммунокоррекции состояния организма, подвергнутого воздействию
ксенобиотика;
г) внедрение-- аналитических иммунохимических методов в
практику токсикологических исследований .
Возрастающий обьем внедрения пестицидов в сельское хозяйство, изменение ассортимента npenapa.jB требуют определения уровней безопасного и эффективного их применения. При этсм ост-
ро поднимается вопрос о критериях и методологии оценки иммуно-токсичкости пестицидов к применения принципов нммунобиотехноло--гич в организации массовых анализов остаточных количеств химиопрепаратоз.
Цель и задачи исследования.
Целью наших исследований явилось исследование иимунотокси-кологических характеристик пестицидов, определение степени специфичности изменений функций иммунной системы, а также поиски путей и способов специфической защиты и иммунокоррекции организма.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
изучение функционального состояния звеньев иммунной системы организма животных, подвергнутых воздействию пестицидов;
разработка схемы шмуиотоксикологического скрининга пестицидов;
количественная оценка безопасных уровней воздействия пестицидов на иммунную систему организма;
поиски имнунохимических способов запщты жгвотных от отравлений и коррекции иммунодефицигных состояний, вызываемых воздействием пестицидов;
разработка иммунохиммческих методов определения пестицидов. . ".'" .
Научная новизна.
1. Экспериментально изучено влияниеГг, 4-дахлорфеноксиук-
сусной кислоты и карбофоса на функциональные показатели иммун
ной системы организма. Показано, что воздействие данных пести
цидов на организм животных вызывает иымунодефицитное состояние.
Исследование иммунотоксикологических свойств пестицидов позволило разработать схему скрининга, * использование которой сможет исключить применение в сельском хозяйстве пестицидов. токсичных для иммунной системы организма.
Предложенная в работе математическая модель позволяет оп-рзделить.безопасные для функционирования иммунной системы организма уровни используемых пестицидов.
2. Впервые экспериментально доказана возможность образова
ния аномальных антигенов лестицид-белок и антител к ним. Выде
лены и очищены белки печени, связывающие iu. тицид. Показана
возможность использования искусственных антигенов пестицид-бе
лок для раннего доклинического выявлений изменений, вызываемых
пестицидами.
-
Впервые установлена возможность защиты организма от острых отравлений пестицидами F(ab)' - фрагментами антител проти* искусственных антигенов пестицид-белок. Экспериментально показана возможность иммунокоррекщи организма, подверженного воздействию пестицидов, такими иммуностимуляторами как Т-акти-вин. миелолид, спленин. лезамизол.
-
Разраиотаны твердофазные иммупоферментные методы определения пестицидов. . в частности 2.4-Д и производных карбофоса. в биологических жидкостях.
Приоритетность разработок подтверждена авторскими свидетельствами на изобретения:
, N 1345399 "Способ иммунизации кроликов против сибирской язвы" от 15. 06.87 г.
N 1356288 "Способ иммунизации крупного рогатого скота против сибирской язвы" от 01.08.87 г.
N 1501724 "Способ иммобилизации гаптенов" от 15.04.89 г.
N 1545350 "Способ защиты организма от отравления гербицидом" от 22. 09.89 Г.
К 1670Є08 "Способ получения антигенов карбофоса" от 15.04. 91 г.
Практическая значимость работы.
Разработанные подходы я методы, а также результаты исследований по иммунотоксикологическчму скринингу пестицидов использованы 'для подготовки и кадакия методического руководства "Иммуштоксикологнческая оценка' пестицидов", Улан-Удэ, 1993. 103с. утвержденного секцией "Экспериментальная патология химической этиолегии" Проблемной комиссии АМН СССР "Научные основы гигиены н токсикологии пестицидов, полимеров и пластических
4ЯСС".
По результатам работы подготовлены и изданы методические рекомендации и руководства:
"Испольгоьание искусственного антигена карбофос-белок іля раннего выявления воздействия карбофоса пр. иммунологическую «активность организма", Улан-Удэ, 1984г., І5с, утвержденные мз СФСР;
"йммуноферментный метод определена производных карбофо-а".Улан-Удэ, 1989р.. 13с..-утвержденные Ученым Советом Инсти-ута биохимии им. А. н. Баха АН СССР.
Разработанный йммуноферментный анализ 2,4-Д позволяет оп-эделить не только свободную, но и стланную ферму препарата, эторая, по нашим данным, обладает определенным токсическим эФ-
фекгоы.
Иммуноферментный метод определения производных карбофоса" позволяет выявить основные метаболиты карбофоса в организме теплокровных - і:оно -. дималатионовые кислоты.
Предлагаемые методы анализа существенно дополняют используемые в настоящее время методы определения пестицидов и способствуют получению новой информации о биологической активности пестицидов.
'Практикум по иммунологическим методам исследования". Улан-Удэ. \987г. ,80с.
"Иммунотоксиколэгическая оценка пестицидов":Методическое руководство. Улан-Удэ. 1993г.,103с. Руководство утверждено сек- . цией "Экспериментальная патологи? химической этиологии Проблемной комиссии АМН СССР "Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс".
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Анализ иммунотоксикологических своГіств пєстицидое;
установлено влияние пестицидов на функционирование иммунной системы организма;
разработана система скрининга токсичных для иммунной системи организма пестицидов;
показана возможность использования иммунологических критериев для расчета безопасных уровней пестицидов.
-
Продемонстрирована способность пестицидов связываться с белками органов и тканей и изменять их антигенную структуру. Изменение антигенной структуры индуцирует процесс антителообра-зования к ачомальньм антигенам.
-
Предложен новый метод иммунохимической защита организма -от острых Отравлений пестицидами, отличающийся высокой специфичностью. Доказана возможность корревдш иммунодефицигного состояния, вызванного пестицидами.
-
Разработан иммуноферментный метод определения пестицидов и их производных, в частности связанные и свободные формы 2,4-Д и основные метаболиты карбофоса в организме теплокровных.
."Апробация результатов работы.
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на
6, 7, 8 Всесоюзных научных, конференциях " Современные вопросы токсикологии и гигиены применения ПЄС1ЙЦИДОВ и полимерных материалов", Киев,1981г., 1985г., 1990г.;
3, 4, 5 Республиканских научно-практических конференциях врачей Бурятии, Улан-Удэ, 1934г..1987г..1989г.;
1, 2 Региональных научных конференциях " Вклад молодых биологов Сибири в решєі.ие Продовольственной программы и охраны окружающей среды". Улан-Удэ, 1984г., 1987г.;
Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы иммунологии. Иммунодефицита и ишунокоррекшя", Владивосток, 1987 г.;
Всесої-ной научной конференции "Иммунология на Востоке страны",Красноярск. 1388г.:
Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология",Вильнюс, 1988г.;
Всесоюзной научно-технической конференции "Проблемы зко-чопш в ветеринарной медицине". Москва. 1989г.;
Всесоюзном симпозиума "Иммукоферментный анализ регуляторов роста растений: применение в Физиологии растений и эколо-чш",Уфа, 1990г.;
- 3 Международной научной конференции "Экологическая пато-
іогия и ее фарнакокоррекция",Чита. 1991г.;,
--1 съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992г.;
Межгосударственной научной конференции "Комплексная пе-еработка пищевого сырья и основные направления расширения асортименте продуктов питания", Владивосток, 1993г.;
итоговых конференциях научных работ профессорско-препо-авательского состава Восточно-Сибирского технологического инс-итута.
Публикации. .
Основные результаты исследований опубликована в І8 пенатах работах..Зарегистрировано 5 авторских свидетельств.' СОДЕРЖАНИЕ РАБиТЫ 1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ,
Исследования выполнены на мышах икбредньк линий , крысах кроликах, а также на сыворотках крови рабочих, занятых на ;оизводстве ина .лтщида карбофоса.
В работе использованы мыши линий СВА. c^Bl^.F, (G^BI/ іА).крысы линий Вистар , кролики порода Шиншилла весом (3-3,5) ', полученные из питомника лабораторных животных "Столбовая". Состояние иммунной системы организ'т оценивали по числу титзлообразующих клеток (АОК). определяемых методом локально-гемолиза в геле по Jerne и Nordln (1963) и в полунидкой еде no Cunningham (1965) ,а также по татру гемагглютининов, раженности локальной лимфоуздозой . еакции "трансплантат отиз хозяина" и гиперчувствительноста замедленного типа , ак-
тизности Т-специфпческнх супрессоров. Для индукции и изучения Т -супрессоров иммунного ответа мышей in vitro использовали мо--' дель адаптивного перекоса по R.Z. Whlsler и J.D. Stodo(1973).
Анализ функций макрофагов проводили по фагоцитозу латекса, тестируемому по фагоцитарному показатели (процент фагоцитирующих клеток из общего числа подсчитанных клеток) и фагоцитарному числу (среднее количество частиц латекса,поглощенных одной клеткой); включению акридинового оранжевого, спонтанной миграции.
Естественная цитотоксичность оценивалась по активности естественных клеток-киллеров в отношении опухолевых клеток-мишеней УАС-1 (Mantovani A.et.al.,1978). А устойчивость к инфекции-при заражении зшзотных сибиреязвенной культурой.Функциональную активность иммуиокомпетентных клеток In vitrc оценивали по индукции АОК в суспензии спленоцитов, хемилюминесценции макрофагов, розегкообразущей способности макрофагов, фагоцитоза макрофагов.
В работе были использованы гербицид-2,4-Д (2,4-дихлорфено-
оксиуксусная кислота) и инсектицид-карбофос (0,0-диметил-с-(1,2
-бис-дакарбоэгоксиэтил) дигиофосфат) в дозах 1/20, 1/50 1/100.
LQgy что составило для 2,4-Д-4; 8; 20мг/кг веса, а для карбофоса-5:
10;,?5мг/кг. ,
Иммунитоксикологическйе"свойства метаболитов пестицидов изучали при предварительном введении индукторов монооксигеназ-ной системы In vivo или после предварительной инкубации препарата с S-Э.
Наличие аномальных комплексов пестицид-белок и антител к нии определяли с помощью реакции пассивной гекагглютинации по Бойдену и связывания комплемента, реакции иммуноэлектрофореза. Выделение белков печени, связывающих гербицид, проводили методами ионообменной хроматографии, .гель-фильтрации, и диск-электрофореза в полиакриламидном геле.
Синтез коныогата карбофос - человечий сывороточный альбумин проводили по методу Е. R. Centeno et al. (1970) через ангидрид карбофоса. Коньюгат 2,4-Д-белок. получали связыванием хлорангидрида 2,4-Д с человечьим сывороточным альбумином. Концентрацию белка определяли по O.Lovry (1951), а число молекул галтена, связавшихся с одной молекулой белка, по разнице свободных аминогрупп в исходном белке и коныогате галтен-белок, определяемых с помощью 2,4,6- тршштробензолсульфокислоты по А. F.ftibeen (1966).
Антисыворотки к искусственным антигенам получали путем им-..мунизации кроликов породы Шиншилла. С целью увеличения активности иммунных сывороток проводили предварительную иммунизацию "белком-носителем .
При выделении антител к карбофосу и 2.4-Д использовали им-муносорбент.Для этого амнноцеллюлозу,полученную по А.Е.Гурвпч и др. (1961). связывали с ангидридом карбофоса чли хлорангидридом 2.4-Д , очищали от непрсреагировавшего соединения и полученным имнуносорбентом набивали колонку (20*1.5см).
F(ab' \-фрагменты получали гидролизом иммуноглобулинов пепсином (И. Брок,1979). Супернатант пропускали через колонку с им-муносорбентом. Фракции с F(ab') - фрагментами объединяли . рН доводили до 7.4 и концентрировали полиэтиленгликолем до концентрации 5МГ/МЛ.
В каждой экспериментальной группа было не менее 10 животных.
Статистически обработку проводили с заданной надеж-' ностыг (достоверностью) р<0,О5 по разработанным программам (Дьяконов В.П.,1986). Вычисляли среднеарифметическое значение И и стандартную ошибку среднего значения в выборке-га. Оценку значимости показателей по сравнению с показателями, принятыми за норму , производили с помощью критерия Стьюдента и' Уилкоксо-на-Манна-Уитни.
