Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Одной из важнейших задач клинической иммунологии является всесторонняя оценка иммунного статуса. Она включает в себя следующий комплекс основных тестов: оценка фагоцитоза, гуморального иммунитета и системы комплемента, иммунофенотипирование лимфоцитов, функциональнальная активность лимфоцитов и оценка интерферонового статуса. [Петров Р. В.,'1984; 1997, Ковальчук Л. В., Чередеев А. Н., 1990, Хаитов Р. М., Пинёгин Б. В., 2001].' При многих заболеваниях и вторичных иммунодефицитах наблюдается нормальное количественное содержание лимфоцитов, ни их функции зачастую изменены в значительной степени, и это может являться'определяющим звеном в патогенезе того или иного заболевания. Изменения функциональной активности лимфоцитов происходят при первичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, вторичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, которые развиваются вследствие'воздействия на организм какого-либо повреждающего фактора (ВИЧ-инфекция, острые и хронические вирусные инфекции, злокачественные заболевания и др.), при физиологических иммунодефицитах, например, при старении. Оценка клеточного звена иммунитета с целью диагностики, лечения, профилактики и прогнозирования этих заболеваний является актуальной задачей общей и клинической иммунологии. Для этих целей клинический иммунолог имеет достаточно большой спектр методов иммунологического' исследования. Но в связи с непрерывным движением иммунологической науки вперед задача разработки и внедрения в медицинскую практику информативных и адекватных тестов определения различных параметров иммунной системы продолжает оставаться важной задачей.
Результаты пролиферативного ответа лимфоцитов оцениваются чаще всего с помощью микроскопического метода (морфологическая идентификация и подсчет процента бластов), либо с помощью включения радиоактивной метки, либо с помощью МТТ-теста, основанного на изменении цвета связывающегося с клетками красителя из синего в желтый. Функциональную активность естественных (натуральных) киллерных клеток (NK) чаще всего оценивают так же в радиоактивных цитотоксических тестах, используя в качестве мишеней меченые 3Н- уридином или 51 Сг клетки различных NK-чувствительных линий.[
Neville M. E., Oshimi К., 1981,Саидов М. 3. и соавт., 1986, Кулаков В. В., Пинегин Б. В., 1995]. NK-клетки лизируют клетки- мишени, такие, как, например, линия К-562, и мишени выделяют в среду культивирования радионуклид. По количеству высвободившейся из мишеней радиоактивной метки и определяют NK-активность. Традиционные методики имеют ряд недостатков, в случае микроскопического метода - это высокая субъективность оценки результата, в случае радиоактивных методов - использование радиоактивного излучателя.
С появлением проточной лазерной цитометрии (ПЛЦ) более 20-ти лет назад значительно расширились возможности изучения всех показателей иммунного статуса. Методы изучения клеточного звена иммунной системы с помощью проточной цитометрии имеют ряд неоценимых преимуществ: объективность, высокая скорость и точность анализа, простота постановки реакции, быстрое получение результата, безопасность.
В связи с этим целью работы явилась разработка цитометрических методов оценки цитотоксической активности NK-клеток и пролиферативной активности лимфоцитов крови человека пригодных для рутинных исследований, в лаборатории клинической иммунологии.
Для проверки эффективности разработанных методов с перспективой их дальнейшего внедрения в лабораторную практику мы использовали три подхода: во-первых, сравнение новых методик с хорошо себя зарекомендовавшими старыми методами, во-вторых, применение новых методик для детекции изменений функций лимфоцитов под воздействием имунотропных веществ, в-третьих, определение с помощью разработанных методов нарушения функциональной активности лимфоцитов у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.
Задачи исследования.
-
Разработать микрометод оценки цитотоксической активности NK-клеток с использованием проточной лазерной цитометрии.
-
Разработать метод оценки функциональной активности лимфоцитов - их способности к пролиферации и бласттрансформации под влиянием Т-клеточного митогена с использованием проточной лазерной цитометрии.
3. Провести корреляционный анализ между цитометрическими и классическими методами определения функциональной активности лимфоцитов. . 4. Показать возможность изучения функциональной активности лимфоцитов с помощью цитометрической методики для оценки действия иммунотропных лекарственных препаратов на клетки иммунной системы.
5. Апробировать разработанные методики на больных с нарушениями этого звена иммунной системы.
Научная новизна. Разработана оригинальная методика, позволяющая оценивать цитотоксическую активность NK клеток периферической крови человека на клетки-мишени эритромиелобластоидной линии К-562. Оригинальность метода заключается в том, что впервые для данных целей применен флюоресцентный краситель -5- и 6-карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфир, ковалентно связывающийся с белками клетки и обеспечивающий ей тем самым стойкое флюоресцентное окрашивание. Все это позволяет выделить клетки-мишени из общей массы реагирующих клеток, а дальнейшее применение пропидиума иодида (РІ) позволяет определить убитые киллерами мишени. Показана высокая степень корреляции данного метода с классическим радиоактивным тестом (коэффициент корреляции составил 0,75 при р<0,05).
С помощью цитометрического метода установлено достоверное повышение цитотоксической активности NK-клеток здоровых доноров под воздействием Аллоферона - олигопептида с цитокиноподобной активностью.
Эффективность разработанной методики подтверждает её клиническая значимость: достоверное снижение функций NK-клеток у обследованных больных ВИЧ-инфекцией и у ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси.
Модифицирован и адаптирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов - их бласттрансформации и пролиферации с помощью проточной лазерной цитометрии. Предложены три параметра измерения активности вместо одного в радиоактивном методе: процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления, которые позволяют более подробно оценить функциональное состояние лимфоцитов. Новая методика имеет высокую степень корреляции с радиоактивным методом.
Коэффиценты корреляции по всем трем параметрам были высокими (0,72, 0,75 и 0,73)при р<0,05.
С помощью цитометрической методики установлено значительное угнетение как бласгтрансформации, так и дальнейшей пролиферации лимфоцитов здоровых доноров под влиянием циклоспорина А - ингибитора синтеза ИЛ2. Цитометрический метод прзволил более детально изучить влияние этого иммуносупрессора на поведение лимфоцитов: установлено, что его влияние является дозозависимым.
При помощи разработанной методики подтверждено достоверное снижение функций лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией - их способности отвечать активацией и пролиферацией на поликлональный Т-митоген-фитогемагглютинин.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Двойная метка (КФСЭ/PI) для клеток-мишеней К-562 является оптимальной в цитометрической методике оценки функциональной активности NK-клеток - их способности убивать мишени в 4-х часовом цитотоксическом тесте.
-
Использование меченых 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром клеток линии К-562 позволяет более точно, быстро и эффективно оценивать цитотоксическую активность NK клеток, фиксировать эффекты влияния иммунотропных веществ на изучаемый параметр и подробно изучать его при различных патологиях.
-
Использование меченых 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром мононуклеаров периферической крови позволяет точно и эффективно исследовать их способность отвечать бласттрансформацией и пролиферацией на митоген.
-
Применение проточной лазерной цитометрии позволяет всесторонне оценивать, во-первых степень влияния различных иммунотропных веществ на функциональную активность лимфоцитов, во-вторых изучать более тонкие механизмы функционирования лимфоцитов при различных иммунопатологиях.
Практическая значимость работы. Методы оценки функциональной активности лимфоцитов разработаны в микроварианте, подтверждены
классическими радиоактивными методами, набраны нормативные показатели, поэтому их можно использовать в рутинных исследованиях в любой иммунологической лаборатории при наличии проточного цитометра. Разработанные методы включены в методическоее пособие для врачей-лаборантов «Применение лазерной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ в центральных отечественных журналах и издано методическое пособие для врачей-лаборантов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 90 источников. Работа содержит 9 таблиц, 18 рисунков и 6 приложений.
