Содержание к диссертации
Введение
1 Кардиопротективные средства (обзор литературы) 11
1.1 Средства метаболической защиты миокарда при ишемии и реперфузии 11
1.2 Пространственно затрудненные фенолы и их фармакологические свойства 24
2 Материал и методы исследования 38
2.1 Объект исследования 38
2.2 Методы исследования 39
2.3 Техника проведения эксперимента 45
2.4 Статистическая обработка результатов 49
3 Результаты собственных исследований 50
3.1 Влияние 4-метил-2,5-диизоборнилфенола на процессы перекисного окисления липидов в тканях сердца у крыс после ишемии/реперфузии миокарда 50
3.2 Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на гемо-реологические показатели у крыс после ишемии/реперфузии миокарда 53
3.3 Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на агрегацию тромбоцитов у крыс после ишемии/реперфузии миокарда 60
3.4 Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на функциональное состояние эндотелия сосудов у крыс после ишемии/реперфузии миокарда 61
3.5 Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на частоту и характер аритмий у крыс после ишемии/реперфузии миокарда 65
3.6 Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на величину зоны инфаркта и зоны риска у крыс после ишемии/реперфузии миокарда 70
3.7 Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на сократительную функцию сердца в отдаленный период после ишемии/реперфузии миокарда 76
Заключение 80
Выводы 99
Список сокращений 101
Список использованной литературы 102
- Средства метаболической защиты миокарда при ишемии и реперфузии
- Пространственно затрудненные фенолы и их фармакологические свойства
- Техника проведения эксперимента
- Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на функциональное состояние эндотелия сосудов у крыс после ишемии/реперфузии миокарда
Средства метаболической защиты миокарда при ишемии и реперфузии
Проблема распространенности сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в настоящее время имеет особо важную роль для мировой и отечественной медицинской науки. Смертность от патологии сердечно-сосудистой системы в мире, по самым последним оценкам, составляет 30% от всех случаев летальных исходов, а в России – 56,5% [ 131, 160, 200]. На долю ИБС в ряду всех известных ССЗ в развитых странах мира приходится более половины случаев смертельных исходов [174, 211]. В Российской Федерации отмечается один из наиболее высоких в Европе показателей распространенности ИБС – около 10 млн. трудоспособного населения страдают от этого заболевания. Смертность от ИБС среди женщин в возрасте от 35 до 64 лет составляет 40,7% общего количества смертей от ССЗ, а у мужчин того же возраста этот показатель превышает 57,0% [15, 63]. В связи с этим ИБС занимает ведущее место среди важнейших отечественных медицинских проблем, требующих разностороннего изучения и определения приоритетных направлений оказания медико-фармацевтической помощи [15, 90].
Причина возникновения ИБС до сих пор достоверно не установлена. В качестве морфологической основы ИБС более чем в 90% случаев диагностируется атеросклероз коронарных артерий. И лишь примерно у 10% больных с типичной клинической картиной ИБС и верифицируемыми объективными признаками преходящей ишемии миокарда явного атеросклеротического сужения крупных проксимальных коронарных артерий не обнаруживают. Последний вариант течения ИБС получил название “синдром Х”. Его возникновение часто связывают с поражением мелких сосудов сердца, сужение которых невозможно визуализировать [63].
ИБС – системное заболевание, связанное с гипоксическим поражением сердечной мышцы. В наиболее общем виде гипоксию можно определить как несоответствие между энергопотребностью и энергопродукцией клетки в ходе ведущего клеточного энергопродуцирующего процесса – митохондриального окислительного фосфорилирования [66, 198]. Непосредственной причиной этого несоответствия является снижение поступления кислорода в митохондрии, в результате которого развивается угнетение митохондриального окисления. В первую очередь подавляется активность НАД-зависимых оксидаз (дегидрогеназ) цикла Кребса при начальном сохранении активности ФАД-зависимой сукцинатоксидазы, ингибирование которой сопровождается выраженной гипоксией. Нарушение митохондриального окисления приводит к угнетению сопряженного с ним фосфорилирования и, следовательно, вызывает прогрессирующий дефицит аденозинтрифосфата (АТФ) – универсального источника энергии в клетке. Уменьшение концентрации АТФ в клетке обусловливает ослабление ее ингибирующего влияния на один из ключевых ферментов гликолиза – фосфофруктокиназу. Активирующийся при гипоксии гликолиз частично компенсирует недостаток АТФ, однако быстро вызывает накопление лактата и развитие ацидоза с последующим аутоингибированием гликолиза [214].
Энергодефицит при гипоксии способствует накоплению Са2+ в цитоплазме клетки, поскольку блокируются энергозависимые насосы, выкачивающие ионы Са2+ из клетки или депонирующие его в цистерны эндоплазматического ретикулума. Накопление Са2+ активирует Са2+-зависимые фосфолипазы, повреждающие биомембраны [37]. Распад фосфолипидов и ингибирование их синтеза ведут к повышению концентрации ненасыщенных жирных кислот, усилению их перекисного окисления, при этом нарушаются главные функции мембран: барьерная, рецепторная, каталитическая [55, 159].
Ограниченные компенсаторные возможности миокарда, обусловленные сравнительно небольшим резервом макроэргических соединений, а также субстратных запасов, не обеспечивают функционально-метаболический гомеостаз кардиомиоцитов при гипоксии [187, 213]. Клинически это выражается развитием участков ишемического повреждения, некрозов и рубцовых полей, нередко наблюдается нарушение систолической и/или диастолической функции сердца
Следовательно, последствиями гипоксии сердечной мышцы являются: угнетение тканевого дыхания, снижение процесса окислительного фосфорилирования и активация анаэробного обмена, вызывающая еще большее подавление интенсивности обмена тканевых макроэргов, лактоацидоз, дисбаланс ионного гомеостаза и изменение клеточного редокс-потенциала, активацию свободнорадикального окисления липидов [71, 97]. В определенный момент времени последствия становятся необратимыми, что приводит к гибели кардиомиоцитов. Последующая реперфузия вызывает парадоксальную реакцию – восстановление кровотока не только не возвращает утраченных функций, но и стремительно увеличивает повреждение миокарда [28]. Подобное явление, прежде всего, объясняется резкой активацией свободнорадикального окисления липидов, замыкающей порочный круг патологии [26, 84].
Несмотря на заметный прогресс в фармакотерапии ИБС, весьма актуальной остается проблема разработки новых лекарственных средств, способных эффективно защитить кардиомиоциты от ишемического повреждения, а также позитивно влиять на течение самого заболевания и улучшать качество жизни пациентов [116].
За последние годы во всем мире проведено большое количество экспериментальных и клинических исследований, доказавших эффективность фармакологической защиты миокарда при синдроме ишемии/реперфузии [44, 98, 162, 170]. Основой лечения ИБС являются классические антиангинальные средства – органические нитраты, блокаторы кальциевых каналов и -адреноблокаторы, статины, действие которых, в основном, направлено на изменение условий гемодинамики [29, 78, 216]. При плохой переносимости перечисленных препаратов или неэффективности терапии, назначают ингибиторы If–ионного тока f-каналов синусового узла – ивабрадин, снижающий частоту сердечных сокращений и, как следствие, кислородный запрос миокарда [139, 210]. Антиангинальные средства, к сожалению, не всегда устраняют симптомы болезни, многие из них могут вызывать неблагоприятные гемодинамические и метаболические эффекты. В связи с этим весьма актуальна проблема разработки кардиопротективных средств, способных защищать кардиомиоциты от ишемических повреждений, не вызывая изменений системных гемодинамических параметров. В этом русле находится концепция метаболического подхода к терапии ИБС, согласно которой были разработаны следующие группы кардиопротективных средств: препараты, повышающие устойчивость миокарда к гипоксии, антиоксидантные средства, электроноакцепторы, анаболические стероидные и нестероидные средства, имеющие разную степень доказанной клинической эффективности [25, 88, 111].
Пространственно затрудненные фенолы и их фармакологические свойства
Модель ишемии/реперфузии миокарда воспроизводили на аутбредных крысах-самцах сток Вистар с массой тела 250-300 г. Для этого крыс наркотизировали тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно), интубировали стальным зондом-воздуховодом и подключали к аппарату искусственной вентиляции легких Rodent Ventilator 7025 (Италия). После торакотомии в 4-м межреберье, проводили перикардотомию и окклюзию левой коронарной артерии на уровне нижнего края auricula sinistra без нарушения топографии сердца в грудной клетке по методу А.Х. Когана [56]. Для верификации окклюзии коронарной артерии проводили мониторирование ЭКГ во II стандартном отведении, используя компьютерный электрокардиограф Поли–Спектр-8/Л. О качестве воспроизведения модели судили по появлению на ЭКГ изменений комплекса QRS: уменьшение амплитуды зубца R, элевация зубца T, а также визуально по побледнению левого желудочка.
В опытах по изучению противоаритмической активности крысы получали 100 мг/кг 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в 2%-й крахмальной слизи за 1 сутки и за 10 минут до оперативного вмешательства (профилактическая схема введения препарата). Длительность окклюзии левой коронарной артерии составляла 10 мин, после чего лигатуру отпускали и проводили реперфузию (10 мин). Животные из контрольной группы получали эквиобъемное количество 2%-й крахмальной слизи. Выжившие после ишемии/реперфузии миокарда крысы выводились из эксперимента передозировкой эфира для наркоза.
Эксперименты по изучению антиоксидантного, гемореологического, антиагрегантного эффектов, а также определение влияния препарата на величину зоны инфаркта и зоны риска миокарда, действия на антиагрегантную активность сосудистой стенки и вазодилятаторную функцию эндотелия проводились в условиях модели ишемии/реперфузии, выполненной по аналогичной методике. Однако длительность окклюзии левой коронарной артерии составляла 45 мин с последующей рециркуляцией, после чего рана послойно ушивалась и обрабатывалась антисептическим средством. В указанных сериях опытов животные получали 4-метил-2,6-диизоборнилфенол в дозе 100 мг/кг в течение 3 дней и за 15 мин до операции и далее в течение 5 дней после нее (лечебно профилактическая схема введения препарата), после чего осуществлялась оценка вышеперечисленных показателей. Животные, у которых проводили аналогичное оперативное вмешательство без наложения лигатур на левую коронарную артерию, составили группу ложнооперированных. Ложнооперированные животные и крысы из контрольной группы получали эквиобъемное количество 2%-й крахмальной слизи по аналогичной схеме.
Для изучения гемореологических показателей и агрегацию тромбоцитов забор проб цельной крови проводили из общей сонной артерии у наркотизированных крыс спустя 5 суток после создания модели острой ишемии миокарда с реперфузией. Для этого у животных под эфирным наркозом выделяли общую сонную артерию, сосуд перевязывали и проксимально вводили тефлоновый катетер. Кровь стабилизировали 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1.
Эксперименты по изучению влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на сократительную функцию сердца и артериальное давление были выполнены на крысах с моделью ишемии/реперфузии. Длительность окклюзии левой коронарной артерии составляла 45 мин, после чего лигатуру развязывали и проводили реперфузию. В данной серии экспериментов крысам вводили суспензию с 4-метил-2,6-диизоборнилфенолом лечебно-профилактически в течение 3 суток до и 5 суток после создания модели. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество 2% крахмальной слизи по аналогичной схеме. Во всех группах препарат вводили 1 раз в сутки.
В опытах по изучению влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на величину зоны инфаркта и зоны риска миокарда у крыс после ишемии/реперфузии эффект исследуемого препарата сравнивали с действием референтного лекарственного средства мексидола. С этой целью 4-метил-2,6-диизоборнилфенол и мексидол вводили по лечебно-профилактической схеме в дозе 100 мг/кг.
Через 1 месяц после воспроизведения инфаркта миокарда в условиях сформировавшейся сердечной недостаточности крыс наркотизировали тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно), отпрепаровывали правую общую сонную артерию и через надрез в сосуде в полость левого желудочка вводили микродатчик (TSD104A для Biopac MP150, США). Осуществляли регистрацию исследуемых параметров сократительной активности левого желудочка, а также систолического и диастолического давления.
При проведении исследований с моделями хронических патологий операционную рану послойно ушивали и обрабатывали антисептическим раствором для предупреждения инфекционного воспаления.
Ишемия 10 мин с последующей 10-и мин рециркуляцией (исследования через 1 сутки после ишемии/реперфузии) Антиаритмическая активность / выживаемость животных - +/+ (n=26) +/+ (n=25) - Ишемия 45 мин с последующей рециркуляцией (исследования через 5 суток после ишемии/реперфузии) Антиоксидантная активность + (n=5) + (n=10) - + (n=10) Гемореологическая активность + (n=7) + (n =7) - + (n=7) Антиагрегантная активность + (n=6) + (n=7) - + (n=7) Эндотелийпротек-тивная активность Антиагрегантная активность сосудистой стенки + (n=5) + (n=6) - + (n=6) Коэффициентэндотелиальнойдисфункции + (n=5) + (n=6) - + (n=5) Влияние на величину зоны инфаркта и зоны риска миокарда / выживаемость животных в эксперименте - +/+ (n=33) - + (n=16) + (n=7)
Ишемия 45 мин с последующей рециркуляцией (исследования через 30 суток после ишемии/реперфузии) Влияние на сократительную функцию сердца в отдаленный период после ишемии/реперфузии миокарда + (n=6) + (n=9) - + (n=10) 49
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 9.0» для Windows. В таблицах результаты представлены как средние значения показателей (М) ± стандартные отклонения среднего значения (m). Нормальность распределения оценивали с помощью показателей асимметрии и эксцесса; достоверность различий (р 0,05) между сериями определяли с помощью t-критерия Стьюдента, теста Манна-Уитни и 2-критерия.
Техника проведения эксперимента
На сегодняшний день существует достаточно большой массив клинических данных, показывающих, что нарушения реологических свойств крови представляют собой один из важных элементов в каскаде нарушений, происходящих при различных сердечно-сосудистых заболеваниях [122]. При терапии ряда кардиологических заболеваний, в том числе и при остром коронарном синдроме, показано назначение препаратов, приводящих к снижению вязкости крови [1].
Эксперименты по изучению гемореологической активности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола были выполнены на аутбредных крысах-самцах, разделенных случайным образом на три группы – ложнооперированные животные, контрольная и опытная группы.
В группе контрольных животных к 5-м суткам после создания модели ишемия миокарда с последующей реперфузией отмечено возрастание вязкости крови относительно значений у ложнооперированных животных на всех исследованных скоростях сдвига, наиболее выраженное в области низких скоростей сдвига (на 23–36%) (Таблица 3, Рисунок 2). Увеличение вязкости крови в области низких скоростей сдвига свидетельствует о нарушении агрегационной функции эритроцитов [147], что подтверждается данными прямого измерения значений этого показателя. Уменьшение полупериода агрегации эритроцитов в контрольной группе относительно показателя у ложнооперированных крыс составило 33%. У крыс контрольной группы значимо на 18% возрастала вязкость плазмы, вероятно, за счет увеличения содержания в ней фибриногена почти в 2 раза (Таблица 4).
У крыс контрольной группы, перенесших ишемию миокарда с реперфузией, отмечалось ухудшение деформируемости эритроцитов. Индекс деформируемости эритроцитов у животных контрольной группы во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига был ниже на 13–36% относительно показателя группы ложнооперированных крыс (Таблица 4). Ухудшение деформируемости и повышение способности эритроцитов к спонтанной агрегации негативно влияют как на вязкостные свойства крови, так и на основную функцию эритроцитов – обеспечение тканей кислородом [204]. У крыс к 5-м суткам после эпизода ишемии и реперфузии миокарда значения расчетного показателя, характеризующего доступность кислорода для тканей, были достоверно ниже по сравнению с таковым у ложнооперированных животных (на 8–15%) (Таблица 5, Рисунок 2).
Следовательно, в условиях модели острой ишемии миокарда с реперфузией происходит повышение вязкости крови в широком диапазоне скоростей сдвига, возрастает вязкость плазмы, уменьшается время полупериода агрегации эритроцитов и ухудшается их деформационная способность. Отмеченные изменения гемореологического статуса у животных контрольной группы снижают эффективность доставки кислорода тканям.
Лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола крысам с ишемией и реперфузией миокарда предупреждало развитие реологических нарушений крови: показатель вязкости крови во всем исследованном диапазоне скоростей сдвига не отличался от значений группы ложнооперированных животных и был достоверно на 9–25% ниже значений в контроле (Таблица 3, Рисунок 2). У крыс, получавших препарат, значимо снижалось содержание фибриногена в плазме крови по сравнению со значением у животных контрольной группы. Это, вероятно, приводило к снижению вязкости плазмы до величины, близкой к величине показателя ложнооперированных животных, что было на 10% ниже значения у крыс контрольной группы (Таблица 4).
Под влиянием 4-метил-2,6-диизоборнилфенола происходило отчетливое улучшение показателей микрореологии, о чем свидетельствует не только снижение агрегационной активности эритроцитов, но и улучшение их деформируемости. Полупериод агрегации эритроцитов относительно значения контрольной группы возрастал на 42% (Таблица 4). Индекс деформируемости эритроцитов у животных данной группы возрастал на 15–60% по сравнению с показателем в контрольной группе (Таблица 4). Лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола крысам, перенесшим ишемию миокарда с реперфузией, улучшало кислородтранспортную функцию эритроцитов: коэффициент доступности кислорода для тканей возрастал на 9–18% по сравнению со значением в контроле (Рисунок 2).
Таким образом, лечебно-профилактическое введение 4-метил-2,6 диизоборнилфенола в условиях модели ишемии/реперфузии миокарда уменьшает повышенную вязкость крови в широком диапазоне скоростей сдвига за счет ограничения агрегационной активности эритроцитов, улучшения их деформируемости и снижения вязкости плазмы. Введение крысам 4-метил-2,6-диизоборнилфенола способствует повышению доступности кислорода для тканей в условиях постишемических изменений реологических свойств крови.
Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на функциональное состояние эндотелия сосудов у крыс после ишемии/реперфузии миокарда
В России сердечно-сосудистые заболевания занимают лидирующую позицию в качестве причин смертности, составляя в 2006 г. 56,5% от всех смертельных исходов и демонстрируя устойчивую тенденцию к росту этого показателя [217].
В связи с этим разработка нового лекарственного средства, обладающего кардиопротективным действием, находится в русле современного направления поиска препаратов для повышения эффективности терапии сердечно-сосудистых заболеваний.
Полного аналога, разрабатываемого на основе 4-метил-2,6 диизоборнилфенола лекарственного средства в России и за рубежом нет.
Ближайшим аналогом можно считать триметазидин, обладающий противоишемической и цитопротективной активностью, но в спектре действия этого препарата отсутствуют эндотелийпротективный и гемореологический эффекты, которые могут быть основой для кардиопротективной активности препарата.
4-Метил-2,6-диизоборнилфенол (диборнол) – соединение, являющееся производным о-изоборнилфенола, синтезированное в ФГБУН Институт химии Коми НЦ УрО РАН. К настоящему времени установлено, что 4-метил-2,6-диизоборнилфенол обладает мощными антиоксидантными свойствами [43, 102].
Наличие у 4-метил-2,6-диизоборнилфенола антиоксидантной активности, приводящей к снижению накопления ПОЛ в тканях головного мозга при модели неполной церебральной ишемии, было показано ранее [49, 102]. В условиях модели неполной ишемии головного мозга, сопровождающейся оксидантным стрессом, курсовое применение препарата статистически достоверно ограничивало накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ – диеновых и триеновых конъюгатов, оснований Шиффа. Это говорит о возможности препарата ограничивать окисление липидов еще на фазе ее инициации. Известно, что антиоксидантные свойства молекулы 4-метил-2,6-диизоборнилфенола обусловлены наличием в ее структуре ОН-групп, которые образуют сопряженную систему со связями ароматического кольца. Смещение неподеленной пары электронов атома кислорода в сторону бензольного кольца приводит к увеличению полярности О–Н-связи, поэтому такие соединения активно вступают в окислительно-восстановительные реакции со свободными радикалами [18, 99].
Использованная нами модель острой ишемии миокарда с реперфузией характеризуется сохранением в сердце во время ишемии редуцированного кровообращения и, следовательно, притока субстратов и кислорода, что способствует активации процессов ПОЛ [212]. С другой стороны, сохранение венозного оттока снижает степень ацидоза и уменьшает аккумуляцию продуктов ПОЛ в органе [82, 132]. Особенностью этой модели является также усиление процессов ПОЛ в миокарде и вследствие выброса катехоламинов в результате реоксигенации сердца после возобновления кровотока [185, 194, 202].
Полученные нами данные о повышении содержания диеновых и триеновых конъюгатов в тканях миокарда после ишемии/реперфузии миокарда согласуются с результатами клинических исследований, в которых также отмечена активация процессов свободнорадикального окисления у больных с ИБС [84, 115].
Введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в этих условиях достоверно ограничивало интенсивность процессов ПОЛ в тканях левого желудочка. Наблюдалось достоверное ограничение накопления как первичных (диеновые и триеновые конъюгаты), так и вторичных (основания Шиффа) продуктов ПОЛ и, как следствие, снижение индекса окисленности липидов, что наглядно демонстрирует смягчение последствий оксидативного стресса. Кроме того, к 5-м суткам после создания модели ишемии/реперфузии отмечалось статистически значимое повышение содержание -токоферола в тканях миокарда под действием препарата относительно значений контрольной группы. Молекула 4-метил-2,6-диизоборнилфенол по своей природе является эффективным синергистом высокоактивного природного антиоксиданта – токоферола [102]. Механизм синергизма -токоферола и пространственно затрудненного антиоксиданта фенольной природы, которым является 4-метил-2,6 диизоборнилфенол, хорошо известен и заключается в способности экранированных фенолов вступать в реакции с токофероксильными радикалами, которые образуются при окислении -токоферола. Таким образом, под действием экранированных фенолов происходит регенерация активной формы -токоферола, который вновь приобретает способность обрывать цепи свободнорадикального окисления [99]. В наших экспериментах подтверждена способность 4-метил-2,6 диизоборнилфенола регенерировать активную форму -токоферола, поскольку препарат повышал в 1,7 раза его уровень у крыс после ишемии/реперфузии миокарда по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, антиоксидантная активность 4-метил-2,6 диизоборнилфенола, как современного представителя ПЗФ, в условиях ишемии/реперфузии миокарда реализуется как за счет его прямого антирадикального действия, так и за счет способности вступать в синергетические взаимодействия с эндогенной антиоксидантной системой организма.
За последнее время проведены многочисленные исследования, показывающие, что изменения реологических параметров крови являются не только независимым фактором риска для возникновения различных патологических состояний, но и одним из ключевых процессов, сопровождающих и отягощающих развитие многих кардиологических заболеваний [107, 109, 117].
Выраженная активация процессов свободнорадикального окисления и следующая за ним реакция тканей и систем организма приводят к формированию оксидативного стресса и имеют большое значение в патогенезе ишемической болезни сердца и острого инфаркта миокарда [30, 113].
![Исследование антиаритмической активности производного 4-нитро-n-[1-фенил-5-(диэтиламино) пентил] бензамида (экспериментальное исследование)](/i/i/5047/650993.png "Исследование антиаритмической активности производного 4-нитро-n-[1-фенил-5-(диэтиламино) пентил] бензамида (экспериментальное исследование) Сингх Лариса Николаевна")
