Введение к работе
Актуальность проблемы. Обеспечение лекарственной безопасности России, как одной из важнейших составляющих её независимости, обозначено первостепенной задачей на ближайшее десятилетие. Действительно, в настоящее время объем потребления лекарственных препаратов, производимых в Российской Федерации, составляет не более 20 процентов рынка в денежном выражении и не более 65 процентов в натуральном. Отечественные производители лекарственных средств проигрывают в рыночной конкуренции не только крупнейшим мировым фармацевтическим корпорациям, разрабатывающим инновационные препараты, но и производителям воспроизведенных лекарственных средств (ФЦП "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу", утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 17 февраля 2011 г. N 91). В ходе реализации Программы планируется, в том числе, решить следующую задачу: ускоренное формирование научно-технологического потенциала для разработки импортозамещающих и инновационных лекарственных средств, медицинской техники и изделий медицинского назначения на основе выполнения масштабных научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ (стр.6 ФЦП «Фарма 2020»).
Решение этой проблемы видится в развитии отечественных фармпредприятий, ориентированных на выпуск импортзамещающих и оригинальных лекарственных средств, что настоятельно диктует необходимость разработки и освоения новых технологических решений по синтезу или модификации лекарственных препаратов обладающих высокой безопасностью и эффективностью. Особенно это актуально для фармакологических средств белковой природы.
В клинической практике лекарственные препараты этой группы применяются достаточно широко в силу высокой эффективности и специфичности. При этом белковые фармакологические средства не всегда имеют выгодный фармакокинетический профиль, а при энтеральном приёме их биодоступность не превышает 1,5 % (Ram I. Mahato, Ajit S. Narang, Laura Thoma, 2003). Кроме того, общеизвестно, что белковые молекулы аллергогенны и иммунотоксичны.
Таким образом, главное противоречие использования белковых фармакологических средств заключается в их высокой клинической эффективности и ограничениях применения - парентерально ввиду токсичности, а энтерально - ввиду низкой биодоступности.
Возможность устранения обозначенного противоречия видится в создании их модифицированных лекарственных форм: полимер-белковых конъюгатов для парентерального и энтерального введения, микрокапсулирования, и т.д. (И. Г. Никитин, Т.Н. Сторожаков,2002.)
Работы в этом направлении ведутся с 1970-х годов, когда предпринимались попытки применять ковалентное присоединение полимеров для повышения безопасности и эффективности различных протеинов (патент США № 4179337). Использовалось связывание полиэтиленоксида с аденозиндезаминазой для лечения иммунодефицитных состояний (Дэвис С.,1981; Хершфилд, М. С.,1987), связывание полиэтиленоксида с супероксиддисмутазой для лечения хронических воспалительных заболеваний (патенты США № 5006333, 5080891).
Действительно, наибольшую привлекательность в повышении эффективности, снижении аллергогенности и токсичности лекарственных препаратов белковой природы представляет их модификация, состоящая не в изменении структуры, что, несомненно, сказывается на специфичности и эффективности, а в физико-химической трансформации, достигаемой соединением белковой молекулы с полимерным носителем. В настоящее время известно достаточно большое количество модифицирующих полимеров как природного, так и синтетического происхождения.
Особое значение в этом плане отводится полиэтиленгликолям различной молекулярной массы, сополимерам этиленоксида и пропиленоксида, а так же некоторым полисахаридам. При этом полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид (ПЭГ/ПЭО) и его сополимеры используются чаще всего (Caliceti P., Veronese F.M., 2003). Феномен присоединения молекулы полиэтиленгликоля к другой молекуле носит название пегиляция или пегилирование (Duncan R., Spreafico F., 1994, Harris J.M., Martin N.E., Modi M., 2001).
Первые работы по успешному пегилированию лекарственных препаратов опубликованы в прошлом веке (Duncan R., Spreafico F.,1994). В начале нынешнего столетия число исследований, посвященных этой проблеме, постоянно росло, что демонстрирует большой интерес к данной технологии (Takagi A., Yamashita N., Yoshioka T. е.a., 2007; Bailon P., Won C.Y., 2009; Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2009; 2010; 2011; El-Komy M.H., Widness J.A., Veng-Pedersen P., 2011).
Синтез ПЭГ-белок, ПЭГ-пептид, ПЭГ-олигонуклеотид в последнее десятилетие стал часто использоваться для улучшения фармакокинетических свойств и токсикологических характеристик известных лекарственных препаратов. Для этих целей в подавляющем большинстве случаев используется химический синтез, позволяющий пегилировать различные антигены, антитела, факторы роста, клеточные рецепторы, ферменты, олигонуклеотиды и др. Некоторые из полученных указанным способом препаратов одобрены для использования в клинической практике во многих странах мира («Neulasta», «Mircera», «Pegasys» и др.) (Heathcote E.J., Shiffman M.L., Cooksley W.G. e.a., 2000; Curran M.P., Goa K.L., 2002; Hamidi M., Azadi A., Rafiei P., 2006; Kobbe G., Bruns I., Fenk R. е.а., 2009; Mallorqu J., Gutirrez-Gallego R., Segura J. е.а., 2010).
При этом химический синтез «полимер-лекарство» является весьма сложным многоступенчатым и дорогостоящим технологическим процессом, с применением высокотоксичных реагентов, требующих использования многочисленных стадий очистки с целью получения гомогенной популяции модифицированных молекул (Patent № LU91006, 2003; Piedmonte D.M., Treuheit M.J., 2008). Тем не менее, результатом синтеза белка и полимера является изменение фармакокинетических и фармакодинамических параметров соединения за счет повышения его стабильности, увеличения времени жизни в организме. И, как показала уже клиническая практика, появляется возможность энтерального использования лекарственного средства. На этом фоне имеет место снижение токсичности и увеличение избирательности действия синтезированного продукта (Nucci M.L., Olejarczyk J., Abuchowski A., 1986; Delgado C., Francis G.E., Fisher D., 1992; Francis G.E., Fisher D., Delgado C. е.a., 1998; Chinol M., Casalini P., Maggiolo M., 1998; Bruce A., 2001; Avgoustakis K., 2004; Maullu C., Raimondo D., Caboi F. e.a., 2009; Huang Z., Ni C., Chu Y., Wang S. е.а., 2009).
Таким образом синтез «полимер-лекарство» по крайней мере в отношении пегилированных белковых молекул, обеспечивает неоспоримые преимущества лекарственных средств белковой природы. Единственным ограничением создания инновационных продуктов этого направления выступает сложность технологии химического синтеза и, следовательно, кратное повышение стоимости лекарственных средств подобного плана.
Однако существует альтернатива многоступенчатому процессу химической пегиляции – электронно-лучевой синтез. Изучение и понимание общих принципов образования и свойств соединений «полимер-лекарство», полученных при помощи ионизирующего излучения, представляет большой интерес для фармакологии в рамках улучшения фармакокинетических свойств лекарственных препаратов белковой природы и уменьшения их токсических эффектов. (Vereschagin E.I., Khan D.H., Troitsky A.W. e. a., 2001; Патент RU № 2406528, 2010; Патент RU № 2405822, 2010; Патент RU № 2414926, 2011). В качестве источника воздействия наиболее предпочтительным является использование потока ускоренных электронов, а в качестве носителя – низкомолекулярного ПЭГа (Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2009; 2010; 2011; Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др., 2009; 2011).
В связи с вышеизложенным, разработка новой технологии электронно-лучевого синтеза «полимер-лекарство» представляется актуальной и своевременной, открывающей новые перспективы совершенствования лекарственных средств белковой природы.
Цель исследования. Изучить возможности электронно-лучевого синтеза белковых молекул с полиэтиленгликолем для создания новых фармакологических средств с оценкой их токсичности, переносимости, специфической активности и фармакокинетики.
Задачи исследования:
-
На примере двух различающихся по химическим и фармакологическим свойствам белковых молекул показать возможности электронно-лучевого синтеза с полиэтиленгликолем для создания пегилированных фармакологически активных лекарственных средств;
-
Изучить физико-химические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;
-
Изучить фармакодинамические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;
-
Изучить параметры фармакокинетики созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;
-
Оценить токсические эффекты созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;
-
На примере лекарственного средства - пегилированного субтилизина, созданного посредством электронно-лучевого синтеза, показать терапевтические возможности по соотношению клиническая эффективность/безопасность;
-
Обосновать возможности технологии электронно-лучевого синтеза для создания новых, инновационных лекарственных препаратов, обладающих оптимальным соотношением польза/риск.
Научная новизна.
В результате изучения возможностей использования пучка ускоренных электронов для синтеза белково-полимерных лекарственных средств были получены уникальные данные по возможности создания новых, оригинальных фармакологически активных молекул. Исследования не ограничились фармакологическими свойствами и клиническими эффектами, а имели расширенный характер за счёт изучения межмолекулярных взаимодействий под воздействием пучка ускоренных электронов. Были установлены механизмы воздействия радиационного облучения на молекулу ПЭГ, зависимость дозы, концентрации, температуры и др.. Установлено различие в механизмах взаимодействия молекул ПЭГ с молекулами белка в водных растворах при облучении. Для низкомолекулярных ПЭГ возможно присоединение только по концевой группе полимера, тогда как для высокомолекулярных ПЭГ данное взаимодействие возможно с образованием более сложных структур посредством водородных связей. В молекуле ПЭГ под пучком ускоренных электронов происходит дозозависимое накопление карбонильных группировок. После облучения у высокомолекулярных ПЭГов наблюдается эффект перехода в состояние предгелирования (образование ассоциатов, обладающих сверхвысокими молекулярными массами), что может быть обусловлено процессом кросслинкинга. В растворах низкомолекулярных ПЭГ протекают процессы связывания между отдельными короткими цепями полимера по радикальному механизму. Облучение ПЭГ свободными электронами инициирует переход от линейной структуры к сетчатой вне зависимости от молекулярной массы облучаемого полимера. Результаты исследований был подтверждён ковалентный характер связей, возникающий между белком и молекулами после облучения потоком ускоренных электронов. Установлено, что прочность образовавшейся связи зависит преимущественно от дозы облучения, например, 0,5Мрад и 0,75Мрад в определённых соотношениях концентрации белка и ПЭГ не обеспечивают достаточно прочной связи.
На этапе изучения фармакологических свойств было показано, что белок-полимерный комплекс вне зависимости от пути введения достаточно быстро достигает системного кровотока. На примере комплекса ПЭГ-ГКСФ, показано, что время достижения максимальных концентраций при подкожном и ректальном введении составило 1 час, а при внутрижелудочном введении 10 мин. Значения максимальных концентраций достигнутых при этом лежат в диапазоне 1700-2500 пг. При определении токсичности достигнутые дозы комплекса ПЭГ-ГКСФ многократно превышают терапевтические, применяемые в клинической практике - от 300 до 1500 раз. При этом специфичность действия, присущая нативной молекуле ГКСФ, сохранялась прежней. При исследовании лекарственного средства на основе пегилированного, посредством электронно-лучевого синтеза, фермента-субтилизина молекулярной массой 30 кДа, установлены ещё более показательные фармакологические эффекты. Фермент-полимерный комплекс оказывал выраженный фибринолитический и тромболитический эффект, присущий нативному ферменту. Наряду с сохранённой специфичностью действия пегилированный препарат всасывался из кишечника с биодоступностью 16-18 %, а при парентеральном введении не оказывал токсических эффектов. В настоящее время по сумме данных качеств на фармацевтическом рынке подобного препарата нет.
Практическая значимость.
Представленная технология электронно-лучевого пегилирования белковых препаратов формулирует конкретные практические предложения для фармацевтической промышленности и здравоохранения. Метод электронно-лучевой пегиляции позволяет синтезировать различные конструкции целевого белка с полимером. В зависимости от необходимых фармакокинетических, фармакодинамических и токсикологических характеристик перспективного лекарственного препарата можно воспользоваться той или иной технологической схемой. Электронно-лучевое пегилирование белковой молекулы способно изменить фармакокинетические показатели, особенно в части повышения энтеральной биодоступности, снизить токсичность, обеспечить невысокую стоимость конечного продукта. Лекарственные препараты на основе пегилированных белков, созданные по технологии ЭЛП комплаентны для пациентов за счёт возможности использовать твёрдые лекарственные формы (капсулы, таблетки, суппозитории), безопасны с точки зрения иммунотоксичности и аллергогенности. Эти лекарственные препараты могут использоваться человеком достаточно долгое время и несколькими курсами для лечения тяжёлых хронических дегенеративных заболеваний.
Положения, выносимые на защиту:
-
Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем позволяет создавать соединения ПЭГ-Белок со стабильными физико-химическими свойствами, обладающие фармакодинамикой, присущей нативному белку;
-
Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем различной молекулярной массы позволяет модифицировать фармакокинетические характеристики соединения ПЭГ-Белок. Позволяет создавать лекарственные препараты белковой природы с высокой терапевтической активностью и низкой токсичностью.
Апробация работы
Основные положения работы представлены на 3-м Съезде токсикологов России (Москва, 2008), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009), на Объединенном съезде по кардиологии и кардиохирургии СФО (Томск, 2009), на IV Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2009), на XVI Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), на научно-практической конференции ЦФО РФ с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник» (Тверь, 2010), на 2-й всероссийской научно-практической конференции «Учёные Урала и Сибири – развитию отечественной фармации» (Новосибирск, 2011), на Всероссийской научной конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2011), на Всероссийской научной конференции «Современная лекарственная токсикология» (Томск, 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 2 монографии, 40 печатных работ, в том числе 22 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и библиографического указателя использованной литературы, который включает 140 отечественных и 105 иностранных источников. Работа иллюстрирована 128 таблицами и 64 рисунками.
