Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о структуре бактериальных липополисахаридов и особенностях их взаимодействия с чувствительными клетками 11
1.1. Современные представления о химической структуре и молекулярной организации бактериальных липополисахаридов 11
1.2. Молекулярно-клеточные механизмы реализации биологических эффектов бактериальных липополисахаридов 23
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Общая характеристика использованного биоматериала 54
2.2. Способы лазерного облучения бактериального липополисахарида .55
2.3. Изучение спонтанного структурообразования бактериального липополисахарида в модельных системах 57
2.4. Качественное описание и количественная обработка картин фаций, получаемых при клиновидной дегидратации суспензии бактериального липополисахарида в различных средах 59
2.5. Изучение адгезивно-агрегационных свойств тромбоцитов (СРА-анализ) 66
2.6. Исследование влияния бактериального липополисахарида на микроциркуляцию 68
2.7. Методы статистической обработки результатов 69
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Влияние лазерного излучения красной области спектра с различным типом поляризации на структурообразование бактериального липополисахарида в водной суспензии 72
3.2. Влияние лазерного излучения фиолетовой области спектра с различным типом поляризации на структурообразование бактериального липополисахарида в водной суспензии 82
3.3. Характеристика спонтанного структурообразования бактериального липополисахарида в физиологическом растворе натрия хлорида 90
3.4. Влияние лазерного излучения красной области спектра с различным типом поляризации на структурообразование бактериального липополисахарида в физиологическом растворе 95
3.5. Влияние лазерного излучения фиолетовой области спектра с различным типом поляризации на структурообразование бактериального липополисахарида в физиологическом растворе 106
3.6. Влияние характера поляризации лазерного излучения на адгезию и агрегацию тромбоцитов на полистирене 119
3.7. Влияние излучения красного и фиолетового лазеров с различным типом поляризации на индуцированные ЛПС изменения функции тромбоцитов 123
3.8. Сравнительный анализ изменений микроциркуляции, вызываемых нативным и облучённым красным лазером бактериальным липополисахаридом 129
Заключение 144
Выводы 167
Практические рекомендации 168
Литература 169
- Молекулярно-клеточные механизмы реализации биологических эффектов бактериальных липополисахаридов
- Способы лазерного облучения бактериального липополисахарида
- Влияние лазерного излучения фиолетовой области спектра с различным типом поляризации на структурообразование бактериального липополисахарида в водной суспензии
- Влияние лазерного излучения красной области спектра с различным типом поляризации на структурообразование бактериального липополисахарида в физиологическом растворе
Введение к работе
Актуальность проблемы
Инфекционные заболевания на сегодняшний день остаются серьёзной проблемой здравоохранения во всех странах мира. По данным ВОЗ (WHO, 2004), ежегодно в мире от инфекционных болезней погибает около 15 млн. человек. Наиболее высокая смертность отмечается при бактериальном сепсисе. В США ежегодное количество больных с сепсисом достигает 750 000, в Европе - 500 000 человек [Macdonald J. et al., 2003; Ma A.C., 2008]. Сепсис является главной причиной смерти пациентов в отделениях интенсивной терапии, что в абсолютных значениях составляет порядка 215 000 случаев в год [Angus D.C.etal., 2001].
Наиболее частыми возбудителями сепсиса являются грамотрицательные микроорганизмы, содержащие в своей мембране липополисахаридный токсический комплекс (эндотоксин) [Николаев А. Ю., Милованов Ю. С, 1999]. Самой тяжелой формой бактериального эндотоксикоза является бактериально-токсический (септический, эндотоксиновый) шок (БТШ) [Llewelyn М.,Cohen J., 2001]. Летальность при БТШ превышает таковую при всех других видах шока и составляет, по данным разных авторов, от 50 до 82% [Salvo I. et al., 1995; Bernard G.R. et al., 2001]. Ежегодно от септического шока в США погибает около 175 000 человек [Stone R., 1994; Ulevitch R.J., Tobias P.S., 1995].
Летальность при БТШ остается высокой, несмотря на широкое применение современного арсенала лекарственных средств, включающего антибиотики, сульфаниламидные препараты, нитрофураны и другие препараты [Lynn W.A., 1998; Jaeschke R., Angus D.C., 2009]. Недостаточная эффективность антимикробных средств в значительной мере обусловлена тем, что все они являются элементами этиотропного лечения, направленного на уничтожение возбудителя, хотя известно, что при разрушении грамотрицательных микробов из их наружной мембраны освобождается липополисахарид (ЛПС, эндотоксин), являющийся главным фактором, определяющим развитие эндотоксинового шока у пациентов с сепсисом. ЛПС обладает способностью стимулировать клетки крови, эндотелий сосудов и тканевые макрофаги, инициируя продукцию ими провоспалительных цитокинов и других биологически активных субстанций, оказывающих влияние на клетки тканей и сосуды и приводящих к расстройствам микроциркуляции [Grandel U., Grimminger F., 2003; Dauphinee S.M., Karsan A., 2006]. До настоящего времени не разработаны эффективные методы терапии, ориентированные на уменьшение патогенных эффектов бактериального ЛПС путем модификации его молекулярной структуры.
Известно, что амфифильные молекулы ЛПС в жидких средах могут подвергаться самоорганизации, образуя агрегаты, обладающие термотропными и лиотропными свойствами, присущими жидким кристаллам [Dumoulin F. et al., 2002; Lecollinet G. et al., 2002]. Объединяясь в надмолекулярные комплексы, ЛПС может существовать в нескольких структурных формах - мицеллярной, ламеллярной, инвертированной, кубической, цилиндрической, а также в виде агрегатов различного размера [Israelachvili J.N., 1991; Gutsmann Т., Schromm А.В., Brandenburg К., 2007]. В зависимости от сочетания гидрофобных и гидрофильных мотивов могут формироваться различные типы агрегатов, и патогенные свойства бактериального ЛПС непосредственно связаны со структурой полидисперсных систем, образуемых им в водных растворах [Ермак И.М., Давыдова В.Н., 2008; Brandenburg К., Wiese А., 2004; Mueller М. et al., 2004, 2005]. Сам процесс спонтанной структуризации ЛПС и возможности модификации этого процесса пока исследованы недостаточно. Поиск возможностей ослабления патогенных свойств бактериального ЛПС при воздействии различных факторов может явиться перспективным направлением в разработке новых эффективных методов патогенетической терапии инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами. Принимая во внимание то, что подобный подход к проблеме может позволить получить новые научные факты, представляющие интерес для фундаментальной науки и медицинской практики, в настоящей работе предпринята попытка модификации структурообразовательных свойств и патогенных эффектов бактериального ЛПС, реализуемых на клеточном и системном уровнях, с помощью воздействия физического фактора — низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ).
В последние годы лазеротерапия широко применяется при лечении различных заболеваний, в том числе вызываемых бактериальными эндотоксинами [Брилль Г.Е. и соавт., 2001]. Вместе с тем, в отношении молекулярно-клеточных механизмов влияния НИЛИ на биологические системы ещё остается много дискуссионных вопросов. В частности, не ясно значение отдельных физических параметров лазерного излучения в определении характера отклика биотканей. Очевидно, что длина волны лазерного излучения является важнейшим фактором, поскольку первичная фотореакция связана с акцепцией квантов света фоточувствительными молекулами (хромофорами), и эти молекулы могут различаться или быть по-разному количественно и пространственно распределены в различных тканях [Брилль Г.Е., Брилль А.Г., 1997]. В то же время роль пространственной когерентности и поляризации лазерного излучения в реализации биоэффектов фотовоздействия до настоящего времени является предметом научных дискуссий. В связи с этим, одной из задач настоящего исследования явилось изучение влияния на процесс спонтанного структурообразования ЛПС и его биологические эффекты низкоинтенсивного лазерного излучения с различным характером поляризации при константных длине волны и мощности излучения.
Цель работы
Выявить модифицирующее влияние низкоинтенсивного лазерного излучения с различной длиной волны и типом поляризации на процесс спонтанного структурообразования бактериального липополисахарида и установить возможность ослабления патогенного действия эндотоксина на тромбоциты и систему микроциркуляции при воздействии на него лазерного излучения.
Задачи исследования
1. Изучить спонтанное структурообразование бактериального липополисахарида в водной суспензии и в физиологическом растворе натрия хлорида, а также возможность модификации этого процесса с помощью низкоинтенсивного лазерного излучения красной и фиолетовой областей спектра.
Провести сравнительный анализ модифицирующего влияния низкоинтенсивного лазерного излучения с различной длиной волны и характером поляризации на процесс структурообразования бактериального липополисахарида в модельных системах.
Исследовать характер и особенности лазерной модификации патогенного влияния бактериального липополисахарида на функцию тромбоцитов в зависимости от длины волны и характера поляризации излучения.
4. Определить возможность ослабления патогенного влияния бактериального липополисахарида на систему микроциркуляции с помощью его облучения светом низкоинтенсивного лазера.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Низкоинтенсивное лазерное излучение красной и фиолетовой областей спектра способно оказывать модифицирующее влияние на процесс спонтанного структурообразования бактериального липополисахарида в водной суспензии и в физиологическом растворе натрия хлорида.
2. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процесс спонтанного структурообразования бактериального липополисахарида в водной суспензии и в физиологическом растворе натрия хлорида зависит от длины волны и характера поляризации лазерного излучения.
3. Лазерное облучение крови in vitro светом красной и фиолетовой областей спектра уменьшает индуцированную бактериальным липополисахаридом адгезию тромбоцитов при высокой скорости сдвига, и этот эффект зависит от длины волны и характера поляризации лазерного луча.
4. Лазерное облучение бактериального липополисахарида оказывает протективный эффект, уменьшая степень выраженности патогенного влияния эндотоксина на клетки крови, сосудистый эндотелий и систему микроциркуляции.
Научная новизна исследования
В работе впервые установлена возможность модификации процесса спонтанного структурообразования бактериального ЛПС в водной суспензии и в физиологическом растворе натрия хлорида с помощью низкоинтенсивного лазерного излучения красной и фиолетовой областей спектра. Доказано, что влияние света на структурообразование ЛПС может реализоваться в средах, не содержащих классических хромофоров для использованных длин волн излучения. Показана зависимость характера лазерного эффекта от длины волны излучения и типа его поляризации. Выявлены особенности действия на процесс структурообразования ЛПС лазерного излучения с линейной, а также циркулярной левой и правой поляризацией. Установлена возможность ослабления с помощью фотовоздействия патогенных эффектов бактериального ЛПС на сосудистый эндотелий, тромбоциты и лейкоциты периферической крови, а также уменьшения выраженности патологических изменений микроциркуляции в условиях экспериментального бактериального эндотоксикоза.
Практическая значимость
Впервые установлена возможность ослабления патогенных свойств бактериального липополисахарида (эндотоксина) с помощью его облучения светом низкоинтенсивного лазера красной и фиолетовой областей спектра, что является теоретическим обоснованием возможности использования лазеротерапии, в частности внутривенного, транскутанного лазерного облучения или экстракорпорального облучения крови, в комплексном лечении эндотоксикоза различной степени тяжести, а также бактериально-токсического шока. Предложены алгоритм и способ компьютерной обработки картин фаций, образующихся при клиновидной дегидратации сложнокомпонентных жидкостей. Выявленная зависимость результата фотовоздействия от характера поляризации лазерного излучения может явиться ориентиром для разработчиков лазерной терапевтической аппаратуры, в которой следовало бы предусмотреть возможность применения различных поляризационных насадок с целью получения наиболее отчетливого биологического эффекта.
Апробация работы и внедрение в практику её результатов
Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на научных конференциях кафедры патологической физиологии (2008-2009 гг.), а также на совместном заседании кафедр патологической физиологии и нормальной физиологии ГОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Росздрава (2009). Фрагменты работьг представлялись на XXX, XXXI и XXXII Международных научно-практических конференциях «Применение лазеров в медицине и биологии» (Ялта, Украина, 2008; Харьков, Украина, 2009; Гурзуф, Украина, 2009), Российской научной конференции с международным участием «Фундаментальные исследования в уронефрологии» (Саратов, 2009), Международной конференции «Низкоинтенсивное лазерное и светодиодное излучения в медицине и биологии» (Санкт-Петербург, 2009). Получен диплом I степени на конкурсе работ молодых учёных, проведённом на Международной научной конференции (Харьков, Украина, 2009).
По материалам диссертации внедрены 6 рационализаторских предложений, принятых ГОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Росздрава (свидетельства: № 2762 от 28.04.2008; № 2796 от 24.04.09; № 2797 от 24.04.09; № 2795 от 24.04.09; № 2794 от 24.04.09; № 2793 от 24.04.09); подана заявка на изобретение (приоритетная справка № 2010107763 от 4 марта 2010 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 12 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки Российской Федерации, и 1 — в Международном журнале.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 210 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, восьми разделов с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 31 отечественный и 380 иностранных источников, иллюстрирована 13 таблицами и 33 рисунками.
Молекулярно-клеточные механизмы реализации биологических эффектов бактериальных липополисахаридов
Известно, что бактериальный липополисахарид, будучи структурной составляющей клеточной стенки грамотрицательных бактерий, является мощным индуктором воспалительного процесса в организме хозяина. Воспаление — это стандартный ответ организма на внедрение инфекции или тканевое повреждение. Воспаление играет ключевую роль как защитный процесс, направленный на отграничение и уничтожение патогенных агентов. Воспалительный ответ - строго контролируемая реакция, обеспечивающая элиминацию микроорганизмов без возникновения серьёзных клинических симптомов. Однако при определённых условиях этот процесс приобретает патологический характер, и его кульминацией могут стать возникновение полиорганной патологии, септических состояний, шока и летальный исход [van Deventer S., 1992; Bone R.C., 1995]. Воспалительный ответ есть результат сочетанной работы клеточных и гуморальных компонентов иммунной системы. Иммунная система позвоночных, в том числе человека, представлена двумя составляющими: системой врождённого и приобретённого иммунитета.
При этом защита организма хозяина от различного рода грамотрицательных бактерий зависит прежде всего от врождённого иммунитета. Микроорганизмы, или составляющие их элементы, будучи распознанными как чужеродные для организма хозяина, взаимодействуют с различными гуморальными факторами и эффекторными клетками, вызывая продукцию широкого спектра медиаторов, цитокинов и специфических хемокинов. Так, в макрофагах ЛПС инициирует транскрипцию более 1000 различных генов [Bjorkbacka Н. et al., 2004; Calvano S.E. et al., 2005]. Все эти биологически активные субстанции способствуют развитию комплекса событий, включая увеличение проницаемости сосудистой стенки, выход жидкой части крови и эмиграцию лейкоцитов в очаг воспаления, фагоцитоз и гибель патогенных агентов. Ключевым моментом в работе системы врождённого иммунитета является детекция, то есть обнаружение и распознавание компонентов бактериального, а также вирусного, грибкового, протозойного, происхождения [Heumann D., Roger Т., 2002; Bosshart Н., Heinzelmann М., 2007]. Система врождённого иммунитета эволюционно консервативна и является «первой линией обороны» макроорганизма от внедрившихся патогенов.
В основе работы врождённого иммунитета лежат молекулярные механизмы, направленные на распознавание высокоспецифичных и уникальных по химической структуре составляющих элементов обширного числа микроорганизмов. У многих млекопитающих, включая человека, распознавание бактериального ЛПС, или эндотоксина, есть базовая стратегия, направленная на борьбу со многими грамотрицательными бактериями, реализующаяся через индукцию воспаления, повреждение бактерий и их элиминацию, а также детоксикацию самого ЛПС [Ulevitch R.J., Tobias P.S., 1999; Alexander С, Rietschel Е.Т., 2001; Heumann D., Roger Т., 2002; Beutler В., Rietschel E.T., 2003; Miyake K., 2004; Munford R.S., 2005]. Эндотоксины способны индуцировать защитный ответ организма хозяина даже на внедрение сотни грамнегативных бактериальных клеток [Gioannini T.L. et al., 2005]. Высокая чувствительность к ЛПС способствует мобилизации защитных механизмов макроорганизма задолго до того, как микробные агенты начнут размножаться и диссеминировать. Хотя многие бактериальные компоненты, в том числе ЛПС, способны, персистируя в высоких концентрациях, непосредственно взаимодействовать с мембранами различных клеток, в физиологических условиях (при низких концентрациях) они соединяются и активируют специфические рецепторы на клетках-мишенях. Освобождающиеся из внешнего листка наружной мембраны грамотрицательной бактериальной клетки молекулы ЛПС пространственно организованы таким образом, что их гидрофобный компонент - липид А -отграничен от водной окружающей среды. Поэтому молекулы эндотоксина образуют агрегаты [Giardina Р.С. et al., 2001; Gioannini T.L. et al., 2003]. Несмотря на подобную секвестрацию, липид А первично обладает провоспалительной активностью, свойственной эндотоксину [Alexander С, Rietschel Е.Т., 2001; Gioannini T.L. et al., 2003; Brandenburg K., Wiese A., 2004; Dixon D.R., Darveau R.P., 2005]. Различия в структуре липида А разных видов бактерий, о которых подробно говорилось в предыдущем разделе, могут предопределять особенности индукции воспалительной реакции организма на эндотоксины [Darveau R.P.,1998; Miyake К., 2004; Munford R.S., 2005; Miller S.I. et al., 2005], а изменчивость коровой части и О-антигена ЛПС, в свою очередь, способна значительно влиять на эти реакции путём активации того или иного пути передачи сигнала об эндотоксине клеткам-эффекторам [Jiang Z. et al., 2005; Zughaier S.M. et al., 2005].
В течение многих лет изучаются механизмы распознавания бактериального эндотоксина клетками организма [Schumann Т. et al., 1990; Wright S.D. et al., 1990]. Открыты и описаны так называемые Toll-подобные рецепторы (TLRs), которые являются неотъемлемой частью ЛПС-воспринимающего аппарата и посредством которых осуществляется активация клеток, приводящая к продукции провоспалительных цитокинов и экспрессии костимуляторных молекул [Medzhitov R. et al., 1997]. В настоящее время установлено, что обнаружение ЛПС и ЛПС-индуцированная активация ряда клеток - моноцитов, макрофагов, эндотелиоцитов, нейтрофилов, тромбоцитов - осуществляются за счёт работы комплекса белков, таких как липополисахарид-связывающий белок (LBP), CD 14 (моноцитарный дифференцировочный антиген, существующий в двух формах), MD2 и Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), трансмембранный (интегральный) белок, передающий сигнал. Известно, что умеренная стимуляция TLR4 способствует элиминации внедрившихся микроорганизмов. Более значительная их стимуляция, однако, запускает каскад потенциально опасных реакций в макроорганизме, часто влекущих за собой развитие полиорганной патологии и приводящих к гибели [Weighardt Н., Holzmann В., 2008]. Рассмотрим подробнее молекулярные механизмы ЛПС-индуцированных ответных реакций клеток макроорганизма. Группа поверхностных клеточных Toll-подобных рецепторов играет «партию первой скрипки» в ходе процесса распознавания различных элементов патогенных чужеродных агентов.
Способы лазерного облучения бактериального липополисахарида
Для облучения бактериального ЛПС была использована полупроводниковая лазерная установка фирмы «EMRED Оу» (Финляндия) с заменяемыми головками, генерирующими излучение в красной (А, = 660 нм, 19 мВт) или фиолетовой (А. = 405 нм, 15 мВт) областях спектра. Облучение модельных систем и биоматериала осуществляли в пластиковых пробирках, обёрнутых чёрной бумагой. Доза лазерного облучения зависела от продолжительности фотовоздействия.
Три различные состояния поляризации лазерного пучка получали с помощью четвертьволновой пластинки (X = 660 или 405 нм), изготовленной из слюды. Исходя из величины двулучепреломления (пе - п0) одноосного кристалла слюды для каждой длины волны, рассчитали толщину пластинки, которая составила для красного света - 35 мкм, для фиолетового - 26 мкм. Был изготовлен ряд пластинок, из которых были отобраны те, которые давали в условиях получения циркулярно-поляризованного света минимальную эллиптичность. Величина эллиптичности позволяет рассчитать вклад в суммарную интенсивность пучка, прошедшего через четвертьволновую пластинку, «целевой» и «не целевой» циркулярно-поляризованных компонент (в идеальном случае имеет место 100% конверсия интенсивности линейно-поляризованного света в «целевую» компоненту); в нашем случае фазовая пластинка позволяла получить пучок с содержанием «целевой» компоненты не менее 99%.
Четвертьволновая пластинка была установлена в специальную насадку, монтирующуюся на корпусе полупроводникового лазера и имеющую возможность вращаться вокруг оси пучка. На выходе лазера была установлена коллимирующая линза, которая уменьшала расходимость пучка таким образом, что световое пятно полностью покрывало площадь полистиреновой кюветы, находящейся на расстоянии « 15 см от выходного отверстия насадки. Так как было обнаружено, что исходный лазерный пучок частично деполяризован, в схему был дополнительно введён плёночный поляроид, который делал соотношение пц : nj_ (в линейно поляризованном пучке, падающем на поворотную фазовую пластинку) не хуже, чем 500 : 1.
При таком положении четвертьволновой пластинки, когда направление оптической оси в ней параллельно плоскости поляризации лазерного пучка (или перпендикулярно ему), выходящий из насадки луч имеет линейную поляризацию. При повороте пластинки на 45 выходящий луч циркулярно поляризован, при повороте на 45 в противоположную (относительно положения, соответствующего линейной поляризации) сторону выходящий пучок также циркулярно поляризован, но с противоположным направлением вращения вектора Е. Точное состояние циркулярной поляризации (лево- или правополяризованный луч) для двух различных «повёрнутых» положений фазовой пластинки было определено с помощью стандартной четвертьволновой пластины с нанесёнными направлениями Np и Ng. Таким образом, на лимб поворотной насадки были нанесены три деления, при установке на которые выходящий луч был поляризован: влево по кругу, линейно, вправо по кругу. Изменения интенсивности пучка при смене состояния поляризации не превышали 1%.
При исследовании процессов спонтанного структурообразования ЛПС в модельных системах непосредственно перед приготовлением препаратов для дегидратации суспензия ЛПС (1 мл) помещалась в пробирку Эппендорфа и подвергалась лазерному облучению в течение 5 мин светом полупроводникового красного (к - 660 нм, мощность - 19 мВт) или фиолетового (к - 405 нм, мощность - 15 мВт) лазера.
В опытах с изучением лазерной модификации влияния ЛПС на функцию кровяных пластинок образец крови (130 мкл) через 5 мин после добавления токсина помещался на дно полистиреновой ячейки и подвергался облучению либо светом полупроводникового красного лазера (А, - 660 нм, мощность — мВт, экспозиция - 5 мин), либо фиолетового лазера (к — 405 нм, мощность -15 мВт, экспозиция — 5 мин).
При изучении влияния бактериального ЛПС на систему микроциркуляции в условиях in vivo облучение ЛПС проводили светом полупроводникового красного лазера в пластиковой пробирке. Доза облучения составила 17 Дж/мл.
Для изучения процесса спонтанного структурообразования ЛПС использовали метод клиновидной дегидратации [Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001]. Непосредственно перед проведением опытов готовили разведения ЛПС в бидистиллированной воде (20 мг/мл) или в физиологическом растворе натрия хлорида (10 и 20 мг/мл). Особое внимание уделяли стандартизации условий экспериментов, что является необходимым условием получения воспроизводимых результатов [Кидалов В.Н. и соавт., 2008]. Общая схема постановки экспериментов показана на рисунке 1. При комнатной температуре 7 мкл суспензии ЛПС в воде или в физиологическом растворе микропипеткой наносили на чистое, сухое, обезжиренное спиртом предметное стекло, которое в строго горизонтальном положении помещали в термостат (37С) на 30 мин. При высыхании исследуемых препаратов формировался структурный след, представляющий собой разнообразные картины (фации). Сразу после завершения высыхания препараты просматривались под микроскопом, регистрировались цифровой камерой и сохранялись в базе данных компьютера. Далее проводился анализ фаций, включающий их качественную характеристику, а также расчет количественных показателей (см. раздел 2.4.) с их последующей статистической обработкой. В отдельных сериях опытов непосредственно перед приготовлением препаратов для дегидратации суспензия ЛПС (1 мл) помещалась в пластиковую пробирку Эппендорфа и подвергалась лазерному облучению в течение 5 мин светом полупроводникового красного (X - 660 нм, мощность - 19 мВт) или фиолетового (к - 405 нм, мощность - 15 мВт) лазера. На излучающую головку надевалась поляризационная насадка, содержащая четвертьволновую пластинку (специальную для каждой длины волны), позволяющую получать излучение с линейной или циркулярной (правого и левого вращения) поляризацией при постоянной мощности.
Влияние лазерного излучения фиолетовой области спектра с различным типом поляризации на структурообразование бактериального липополисахарида в водной суспензии
Для выполнения данных серий экспериментов ex tempore готовились водные суспензии, содержащие 20 мг/мл бактериального ЛПС. Протокол экспериментов был идентичен таковому в предыдущей серии опытов. Для облучения водной суспензии ЛПС использовался лазер, генерирующий излучение в фиолетовой части спектра (А, - 405 нм, выходная мощность -15 мВт), с поляризационной насадкой, позволяющей получать линейно-поляризованный свет или циркулярно-поляризованное излучение с левым или правым направлением вращения относительно движения светового луча при постоянной мощности светового потока на выходе излучателя.
Проведённые исследования показали, что при облучении водной суспензии бактериального ЛПС, фиолетовым лазером также наблюдаются изменения картины фаций, формирующихся в процессе клиновидной дегидратации. Так, при использовании лазерного излучения с любым типом поляризации отмечалось уменьшение размера периферического приподнятого ободка, наблюдаемого в контрольных препаратах. Для фаций, полученных после воздействия на суспензию ЛПС линейно- и левополяризованного лазерного света, было характерно равномерное распределение по поверхности фации крупноглыбчатых структур. Тонкие слоисто-глыбчатые образования, напротив, концентрировались в различных секторах периферической зоны, которая становилась шире, по сравнению с таковой в контрольных образцах (рис. 12). Сами слоисто-глыбчатые структуры при этих видах фотовоздействия оказывались крупнее, чем в контроле. При фотовоздействии правополяризованным лазером обнаруживалась следующая модификация структурообразования водной суспензии ЛПС: крупноглыбчатые структуры занимали всю площадь фации, тогда как слоисто-глыбчатые образования распределялись практически по всей периферической зоне.
Результаты количественного анализа фаций данной серии опытов представлены в таблице 3. Как можно видеть, при воздействии левополяризованного света на порядок увеличивалось количество объектов в центральной зоне фации (р 0,01), тогда как их средние размеры достоверно не отличались от контроля. При этом уменьшалась структурированность периферической зоны (р 0,01). Облучение водной суспензии ЛПС правополяризованным светом, также как и при воздействии левополяризованного излучения, не вызывало существенных изменений размеров центральных и периферических зон фаций, однако увеличивалось (более чем в 5 раз) количество объектов в центральной зоне (р 0,02), причём почти в 10 раз уменьшался размер этих объектов (р 0,01). Остальные параметры при действии правополяризованного света достоверно не отличались от контроля.
Сравнительный анализ эффектов циркулярно-поляризованного света с левым и правым направлением вращения выявил достоверные различия. Они касались влияния лазерного излучения на показатель, характеризующий смещение центров ободковой и центральной части фации: значения этого параметра при действии правополяризованного света были в 2 раза выше, чем левополяризованного (pi 0,01). Другое различие эффектов касалось влияния на средний размер объектов в центральной зоне: значения этого параметра при воздействии правополяризованного света были на порядок ниже, чем в контроле и при воздействии излучения с левой поляризацией (pi 0,02). Весьма существенные различия в действии лево- и правополяризованного света выявлялись и при анализе изменений в периферической зоне фаций. Если под влиянием левополяризованного света имела место тенденция к увеличению числа объектов в периферической зоне, то правополяризованный свет оказывал противоположный эффект, то есть наблюдалась тенденция к уменьшению этого показателя. И хотя облучение циркулярно-поляризованным светом любого направления поляризации не приводило к достоверным изменениям показателя N ob. р по сравнению с контролем, различия между значениями этого параметра при действии лево- и правополяризованного света были статистически достоверны (pi 0,05). Аналогичная противоположная направленность влияния лево- и правополяризованного света на структурообразование ЛПС в водной суспензии отмечалась и в отношении двух других показателей, отражающих структурные изменения в периферической зоне фации - AS р и Dcorr р (соответственно pi 0,001 и pi 0,05).
Линейно-поляризованное излучение вызывало уменьшение размера периферической и увеличение размера центральной зоны фации по сравению с контролем (р 0,05), наиболее значительному (в 45 раз!) увеличению числа объектов в центральной зоне (р 0,001) при значительном уменьшении размера этих объектов (р 0,001). Примечательно, что эффекты линейно-поляризованного лазерного излучения отличались от влияния как лево-, так и правополяризованного света: для левой поляризации достоверными были различия по трём параметрам - N оЪ. с (р2 0,01), AS с (р2 0,02) и N ob. р (р2 0,05); для правой поляризации различия касались только N оЪ. с (Р2 0,01).
Следовательно, облучение водной суспензии бактериального ЛПС светом фиолетового лазера с длиной волны 405 нм оказывает влияние на процесс спонтанного структурообразования, выявляемого в данной модельной системе методом клиновидной дегидратации. Как и в случае с воздействием лазерного излучения красной области спектра, здесь выявлена отчетливая зависимость результата фотовоздействия от характера поляризации лазерного излучения (рис. 13).
Совершенно очевидно, что водная суспензия бактериального ЛПС представляет собой самую простую модельную систему для исследования процесса спонтанного структурообразования. В живом организме, попадая в ткани и биологические жидкости, ЛПС взаимодействует со множеством высокомолекулярных соединений (в частности, белков), низкомолекулярных веществ, а также различных простых молекул и ионов.
Влияние лазерного излучения красной области спектра с различным типом поляризации на структурообразование бактериального липополисахарида в физиологическом растворе
Прежде всего были проведены исследования фаций, получаемых при дегидратации суспензии, содержащей малую концентрацию ЛПС - 10 мг/мл. При этом в контрольных (необлучённых) препаратах наблюдалось формирование фаций округлой формы с тонким периферическим ободком и многообразием ветвистых структурных образований по всей поверхности фации (детальное описание см. в предыдущем разделе).
Облучение суспензии ЛПС светом красного лазера (X — 660 нм) приводило к заметному изменению процесса спонтанного структурообразования. При облучении левополяризованным лазерным светом в картине фаций отмечались следующие типичные изменения: расширение периферической (ободковой) зоны с появлением в ней слоистых участков, деструктуризация центральной части при сохранении структуры промежуточной зоны. Деструктуризация центральной зоны фации заключалась в изменении плотности пространственного распределения составляющих её элементов и утрате ими структурной чёткости.
Результаты количественной обработки фаций этой серии опытов представлены в таблице 5. Как следует из таблицы, облучение суспензии ЛПС левополяризованным светом приводит к увеличению относительной площади ободковой и центральной зон, при уменьшении площади промежуточной зоны (р 0,001). При этом уменьшается неоднородность центральной и ободковой зоны (соответственно, р 0,02 и р 0,01). Облучение правополяризованным светом ведёт к уменьшению относительного размера промежуточной зоны (р 0,001) и увеличению размера центральной зоны (р 0,001), тогда как размер ободковой зоны остаётся неизменным (р 0,5). В то же время в промежуточной зоне отмечается достоверное снижение структурированности фации, о чём свидетельствует уменьшение показателя Dcorrp (р 0,05).
Сравнительный анализ эффектов лазерного излучения с правой и левой циркулярной поляризацией позволяет выявить достоверные межгрупповые различия, заключающиеся во влиянии на размер ободковой зоны фации (pi 0,001) и размер центральной зоны (р 0,05).
Линейно-поляризованный красный свет вызывал уменьшение относительного размера промежуточной зоны фации (р 0,001) при увеличении размера центральной зоны (р 0,001) по сравнению с контролем. На этом фоне происходило увеличение среднего размера гребешковых объектов в центральной зоне (р 0,01) и уменьшалась неоднородность структуры этой зоны фации (р 0,01). Ещё одно достоверное различие с контролем касалось уменьшения при фотовоздействии структурированности промежуточной зоны (р 0,05).
Сопоставление эффектов линейно-поляризованного красного лазерного излучения с действием циркулярно-поляризованного излучения правого и левого направления позволило выявить достоверные межгрупповые различия (рис. 16). Так, левополяризованный свет, в отличие от линейно-поляризованного, вызывал заметное увеличение относительного размера периферической зоны фации (р2 0,001) и в то же время вызывал большее уменьшение размера промежуточной зоны (р2 0,02) и менее значительное увеличение относительного размера центральной зоны фации (р2 0,05). Кроме того, левополяризованный свет, в отличие от линейно-поляризованного, вызывал достоверное смещение центра промежуточной зоны относительно центра ободка фации (р2 0,02), а также уменьшение степени неоднородности промежуточной зоны фации (р2 0,05).
Правополяризованный красный свет, в отличие от линейно-поляризованного лазерного излучения, приводил к достоверному увеличению количества гребешковых объектов в промежуточной зоне фации (р2 0,05), а также вызывал уменьшение среднего размера объектов в этой зоне (р2 0,05).
Таким образом, облучение суспензии бактериального ЛПС в концентрации 10 мг/мл в физиологическом растворе натрия хлорида светом красного лазера сопровождается изменением процесса спонтанного структурообразования и ведёт к изменению картины формирующихся фаций. При этом эффект лазерного излучения отчётливо зависит от характера поляризации: каждый из трёх апробированных видов поляризации оказывает особое специфичное для него влияние на процесс спонтанного структурообразования ЛПС в данной модельной системе.
При использовании более высокой концентрации ЛПС (20 мг/мл) в физиологическом растворе в ходе клиновидной дегидратации наблюдалось образование фаций, сходных по форме и структуре с типичными для малой концентрации препарата фациями. После облучения растворов ЛПС левополяризованным лазерным светом обнаруживались следующие изменения структуры фаций (таблица 6): расширялись периферическая (ободковая) и центральная зоны (соответственно р 0,01 и р 0,02) и уменьшалась относительная площадь промежуточной зоны фации (р 0,01) (рис. 17). Правополяризованное излучение практически не оказывало эффекта на процесс структурообразования - различия всех параметров с контролем были статистически недостоверны. Естественно, сравнительный анализ эффектов лево- и правополяризованного света выявил достоверные межгрупповые различия - для Sj и S3 р\ было 0,05, а для S2 - pi 0,01.
