Введение к работе
Актуальность темы. Проблема ВИЧ/СПИД на нашей планете с каждым годом становится все острее. Официальная статистика утверждает, что сейчас в мире от ВИЧ/СПИДа погибло более 25 млн. человек, 65 млн. инфицировано и количество инфицированных с каждым днем возрастает. Все ранние применяемые классические методы защиты от ВИЧ/СПИД не привели к каким-либо значимым результатам, лишь с внедрением в клиническую практику высокоактивной многокомпонентной специфической антиретровирусной терапии стало возможным на некоторое время продлить жить ВИЧ-инфицированным. Но несмотря ни на что, гибель ВИЧ-инфированных на сегодняшний день неизбежна. Связанно это с некоторыми особенностями ВИЧ:
Не зафиксировано ни одного случая выздоровления от СПИДа. Итог заболевания - смерть.
ВИЧ обладает крайне высокой вариабельностью (субтипы + рекомбинантные формы).
Отсутствует адекватная модели ВИЧ-инфекции/СПИДа на животных
Т.о. классические пастеровские подходы для создания вакцины не применимы. Мы не можем вводить в организм человека, ослабленный или убитый вирус, т.к. есть возможность инфицировать человека, что затем приведет и к гибели. Нельзя вводить и разрушенный ВИЧ, а так же некоторые его части, полученные из нативного вируса, т.к. существует вероятность того, что в полученном препарате может присутствовать вирус неповрежденный, что в конечном итоге приведет к заражению и гибели человека. Единственным направлением, признанным на данный момент наиболее безопасным и перспективным, является вакцина созданная на основе генно-инжинерных белков, копирующих иммунореактивные участки белков ВИЧ.
В мире существует великое множество кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИДа, многие проходят клинические испытания. К сожалению, ни одна до сих пор не достигла главного результата - защиты от ВИЧ-инфекции.
На основе полученного мирового опыта можно предположить, что при подборе последовательности рекомбинантного белка необходимо опираться как на наиболее консервативные части белков ВИЧ-1, так и на наиболее иммуногенные, при этом различные эпитопы белков ВИЧ могут группироваться друг с другом, т.е. рекомбииантная молекула должна быть химерной. Также необходимо учитывать сложную пространственную структуру белков ВИЧ, т.е. эпитопы могут быть не линейными, а пространственными (конформационными).
Но, помимо создания рекомбинантных белков - основ кандидатных вакцин, также очень остро стоит вопрос масштабного производства тех из них, которые прошли доклинические испытания. Связанно это, прежде всего с тем, что те количества белка, которые получают в обычной биотехнологической лаборатории, не могут покрыть потребностей при проведении клинических испытаний. Процесс получения больших количеств рекомбинантных белков отличается от получения их в аналитических количествах и, помимо высокого качества получаемого препарата необходима и воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантных белков. Не стоит забывать, что любая информация, полученная в момент испытаний, может повлечь за собой изменение состава или структуры рекомбинантного белка, что приведет к перенастройке всей производственной линии. Т.о. весь процесс получения рекомбинантных белков, копирующих иммунореактивные участки белков ВИЧ-1, от аналитических количеств до макроколичеств должен находится в одних руках - в руках коллектива авторов.
Все это говорит о том, что создание вакцины против ВИЧ/СПИДа на сегодняшний день является не прикладной, а фундаментальной задачей. Мировая общественность признает, что до появления вакцины, способной противостоять ВИЧ/СПИДу, должно пройти 15-20 лет. Поэтому любая информация, полученная во время проведения испытаний кандидатных вакцин, будет способствовать модернизации новых серий кандидатных вакцин. Подобная модернизация, в свою очередь приведет к скорейшей победе над страшным заболеванием и сохранению жизни и здоровья миллионам людей на планете.
Цель работы: наработать в количествах, достаточных для проведения второй фазы клинических испытаний рекомбинантный белок гее (24-41), прошедшего доклинические и первую фазу клинических испытаний как основа анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ», создание новой серии рекомбинантных белков - основ вакцин против ВИЧ/СПИД.
Задачи исследования.
Подобрать условия для наработки рекомбинантного белка гее (24-41) в ферментере.
Добиться воспроизводимости получения новых партий рекомбинантного белка гее (24-41) и наработать данный белок.
Произвести хроматографическую очистку полученных партий рекомбинантного белка гее (24-41).
Оценить структуру и иммунологические свойства полученного рекомбинантного белка гее (24-41).
Разработать рекомбинантную химерную белковую молекулу, состоящую из эпитопов 2F5 и 4Е10 белка gp41 ВИЧ-1, и носителя - нетоксичного мутантного
TNF, способного тримеризоваться, для представления эпитопов ВИЧ-1 в форме, соответствующей таковой у нативного вируса.
Создать плазмиду, несущую ген, кодирующий белок тес (TNF-2F54E10).
Произвести ферментативную наработку и хроматографическую очистку рекомбинантного белка rec (TNF-2F5-4E10).
Оценить структуру и иммунологические свойства полученного рекомбинантного белка rec (TNF-2F5-4E10), доказать его способность к тримеризации.
Научная новизна работы.
Впервые проведена масштабная наработка рекомбинантного белка гес(24-41). Показана воспроизводимость наработки партий рекомбинантного белка гес(24-41). Создан штамм-продуцент ВЦ24-41) способный продуцировать белок гее (24-41) в условиях ферментации. Проведена работа по подбору оптимальных условий для экспрессии белка гее (24-41) в условиях ферментации. Подобраны условия очистки и рефолдинга макроколичеств рекомбинантного белка гее (24-41).
Впервые получен тример 2F5-4E10 на основе белка TNF. Создан ген, кодирующий белок rec (TNF-2F5-4E10). Получена плазмида, несущая данный ген. На основе плазмиды создан штамм-продуцент BL21(TNF-2F5-4E10). Наработан и очищен гее (TNF-2F5-4E10). Была доказана мономерная и тримерная структуры молекулы. Показана возможность тримеризоваться в различных растворах. Получены доказательства специфического взаимодействия rec (TNF-2F5-4E10) с сыворотками ВИЧ-позитивных людей.
Практическая значимость.
Полученный рекомбинантный белок гее (24-41) станет основой вакцины «ВИЧРЕПОЛ» в дальнейших клинических испытаниях.
Рекомбинантный химерный белок rec (TNF-2F5-4E10) является первым из новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД. Он пригоден для дальнейших исследований и представления к доклиническим испытаниям. На данной серии возможно изучение всех комбинаций тримерных белков ВИЧ-1.
Созданная база по масштабированию в лаборатории биотехнологии и СПИДа Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства станет местом для наработки новых кандидатных вакцин на основе рекомбинантнуых белков.
Апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисных работ.
Основные результаты исследования докладывались на Международной научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и вирусных парентеральных гепатитов (29 сентября-1 октября 2004г, Суздаль), XVI Международная конференция по СПИДу (13-18 августа 2006г., Торонто, Канада), IV Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (12-16 марта 2007г., Москва).
Объем и структура диссертации: