Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Нейтрофильные гранулоциты – клетки врожденного иммунитета (обзор литературы) 14
1.1 Нейтрофильные гранулоциты и гетерогенность их популяции 14
1.2 Современные методы оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов 20
1.2.1 Внеклеточные ловушки как новый механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов 20
1.2.2 Проточная цитофлюориметрия как современный метод иммунодиагностики 29
Глава 2 Материалы и методы исследования 35
2.1 Характеристика обследуемых лиц 35
2.2 Материал для исследования 35
2.3 Получение лейкоцитарной взвеси 35
2.4 Выделение нейтрофилов из периферической венозной крови 36
2.5 Метод забора материала из вагинального и цервикального секрета репродуктивного тракта женщин 36
2.6 Метод забора слюны 37
2.7 Активация нейтрофильных гранулоцитов иммуностимуляторами 37
2.8 Методы обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек 37
2.8.1 Метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в фиксированных препаратах цельной крови 38
2.8.2 Метод обнаружения внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами, выделенными из периферической крови 38
2.8.3 Метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах 39
2.9 Исследование функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов 40
2.9.1 Метод определения фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с помощью световой микроскопии 40
2.9.2 Определение фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии 40
2.9.3 Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с помощью НСТ-теста 42
2.9.4 Определение внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии 44
2.9.5 Метод определения лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов 46
2.10 Определение рецепторов CD11b и CD95 на нейтрофильных гранулоцитах методом проточной цитофлюориметрии 47
2.11 Методы статистической обработки материала 48
Глава 3 Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов 50
3.1 Оценка соотношения морфологических форм интактных нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, вагинальном и цервикальном секретах 50
3.2 Оценка лизосомальной активности интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах 55
3.3 Оценка фагоцитарной функции интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах 56
3.4 Оценка внутриклеточного кислородзависимого метаболизма интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах 58
Глава 4 Функциональный ответ нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов на стимуляцию пирогеналом и форбол-12-миристат-13-ацетатом 62
4.1 Влияние пирогенала и ФМА на соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, вагинальном и цервикальном секретах 63
4.2 Оценка лизосомальной активности нейтрофилов мукозальных секретов после активации пирогеналом и ФМА 69
4.3 Оценка фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов различных мукозальных секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом и ФМА 71
4.4 Оценка показателей НСТ-теста нейтрофилов слюны, вагинального и цервикального секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом и ФМА 73
Глава 5 Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции до и после активации у здоровых женщин и мужчин 77
5.1 Оценка количества внеклеточных ловушек, присутствующих в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов, до и после активации пирогеналом и ФМА 77
5.2 Оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов методом проточной цитофлюориметрии 82
5.3 Изменение экспрессии рецепторов CD11b и CD95 на нейтрофильных гранулоцитов периферичемкой крови до и после активации ФМА 84
Заключение 95
Выводы 112
Список наиболее часто используемых сокращений 114
Список литературы 115
- Внеклеточные ловушки как новый механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов
- Метод забора материала из вагинального и цервикального секрета репродуктивного тракта женщин
- Оценка соотношения морфологических форм интактных нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, вагинальном и цервикальном секретах
- Оценка фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов различных мукозальных секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом и ФМА
Введение к работе
Актуальность исследования и степень ее разработанности
Нейтрофильные гранулоциты являются ключевыми клетками врожденного иммунитета, их основной функцией является уничтожение патогенных микроорганизмов, таких как бактерии, грибы и паразиты, а так же предотвращение их распространения в организме (Papayannopoulos V., Staab D., Zychlinsky A. PLoS One., 2011. Vol. 6, № 12. P. 125-131.). Это профессиональные охотники за микробами, обладающие самой высокой подвижностью среди всех клеток организма (Шмагель К.В., Черешнев В.А. Клетки врожденного иммунитета. Пермь, 2011. 241 с.). Более века исследователи всего мира изучают строение и физиологию нейтрофильных гранулоцитов, биохимический состав их гранул, структуру синтезируемых ими метаболитов и роль этих клеток в регуляции иммунного ответа (Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. Москва: Наука, 2000. 231 с.; Федотова Г.Г. Морфофункциональное исследование нейтрофилов в условиях эндотоксикоза: автореф. дис. … д-ра биол. наук. Саранск, 2007. 39 с.).
Нейтрофилы оснащены богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды (Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. № 4. С. 93-100.; Hoffmann J.A. The immune response of Drosophila. Nature. 2003. Vol. 426. P. 33-38.) Они первыми приходят в очаг воспаления, где проявляют разнообразные виды активности (Шмагель К.В., Черешнев В.А. Клетки врожденного иммунитета. Пермь, 2011. 241 с.). Подготовленный нейтрофил может оказывать свое действие на объект, вызвавший его активацию, различными способами: фагоцитировать и уничтожать его в фаголизосомах или выделять наружу бактерицидные продукты, которые представляют собой содержимое гранул (Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. Екатеринбург: Изд-во УрОРАН, 2001. 256 с.).
Нейтрофильные гранулоциты являются самыми многочисленными из лейкоцитов. Их количество в периферической крови поддерживается на постоянном уровне благодаря притоку из костного мозга (Nathan C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol., 2006. № 6. P. 173-182.). Большая часть нейтрофильных гранулоцитов функционирует в тканевых депо и в секретах слизистых оболочек: цервикальной и вагинальной слизи, бронхо-альвеолярном секрете, слюне, слизи, покрывающей кишечный эпителий (Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.: Изд-во РАМН, 2009. 208 с.; Bainton D.F. Morphology of neutrophils, eosinophils and basophils. Williams Hematology. 5th ed. 1995. P. 753-765.). При этом на поверхности слизистых оболочек встречается большое количество жизнеспособных и функционально активных нейтрофильных гранулоцитов (Телешева Л.Ф. Иммунологические факторы секретов репродуктивного тракта женщин: дис. д-ра мед. наук. Челябинск, 2000. 41 с.; Савочкина А.Ю. Иммунологические показатели в диагностике хронического цервицита и при его сочетании с хроническим эндометритом: дис. канд. мед. наук. Челябинск, 2006. 148 с.).
Именно слизистые оболочки в силу своего топографического положения первыми подвергаются атаке патогенов. Они обладают комплексом факторов иммунной защиты, являясь надежным барьером на пути проникновения патогенов. В составе секретов нейтрофилы продуцируют различные биологически активные вещества (цитокины, ферменты, свободные радикалы и др.) и осуществляют неспецифическую защиту слизистых оболочек (Плужников М.С., Лавренова Г.В. Иммунология хронического тонзиллита. Санкт-Петербург: Диалог, 2004. 59 с.).
Открытие нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) и установление их антимикробного эффекта как важнейшего звена врожденного иммунитета, безусловно, явилось началом нового этапа в исследовании функций нейтрофильных гранулоцитов (Савочкина А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: механизмы образования, методы обнаружения, биологическая роль : дис. д-ра мед. наук. Челябинск, 2012. 221 с.; Brinkmann V., Zychlinsky V. Beneficial suicide: why neutrophils die to, make NETs. Nature Rev., 2007. Vol. 5. P. 577-582.).
Формирование внеклеточных ловушек может осуществляться только
активированными нейтрофилами. Эффект антимикробных веществ во
внеклеточном пространстве усиливается в структурах внеклеточных ловушек (Brinkmann V., Zychlinsky V. Beneficial suicide: why neutrophils die to, make NETs. Nature Rev., 2007. Vol. 5. P. 577-582.).
Несмотря на многочисленные исследования нейтрофильных гранулоцитов и нейтрофильных внеклеточных ловушек многие вопросы остаются нераскрытыми и по сегодняшний день. До конца не исследована способность нейтрофилов, присутствующих в различных мукозальных секретах, цельной крови и лейкоцитарной взвеси, к экструзии ДНК, неясно, как изменится морфологический состав и функциональная активность популяции нейтрофилов слизистых оболочек после воздействия экзогенных факторов микробной и немикробной природы. Остается также открытым вопрос о гетерогенности популяции нейтрофильных гранулоцитов цельной периферической крови.
Цель исследования
Изучить показатели функциональной активности интактных и
активированных нейтрофильных гранулоцитов цельной периферической крови и мукозальных секретов у здоровых мужчин и женщин.
Задачи исследования
-
Определить соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов и количество внеклеточных ловушек, входящих в состав слюны, цервикального и вагинального секретов.
-
Оценить функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов слюны, цервикального и вагинального секретов.
-
Изучить влияние экзогенных факторов микробной и немикробной природы на соотношение морфологических форм и функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов слюны, цервикального и вагинального секретов.
-
Определить количество внеклеточных ловушек, содержащихся в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов, у здоровых мужчин и женщин до и после воздействия активаторов микробной и немикробной природы.
5. Исследовать экспрессию рецепторов CD11b и CD95 в различных субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов цельной периферической крови у здоровых мужчин и женщин.
Методология и методы исследования
Работа носит характер сравнительного когортного исследования. Методология исследования основывалась на позициях диалектического материализма и данных доказательной медицины (Царегородцев Г.И., Ерохин В.Г. Диалектический материализм и теоретические основы медицины. М.: Медицина, 1986. 288 с.).
В работе использованы лабораторные и статистические методы исследования.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Объем фактического материала, арсенал использованных методов исследования, статистическая обработка полученных результатов адекватны поставленной цели и решаемым задачам. Исследования выполнены на сертифицированном лабораторном оборудовании, а обработка данных проведена с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows (v. 8.0; Statsoft Inc.), что подтверждает достоверность полученных результатов.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2011); IX Российской конференции иммунологов Урала, посвященной памяти профессора Л.Я. Эберта (Челябинск, 2011); на I Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011); на VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012); на III международной (X итоговой) научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2012); на Х Российской конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012); на Региональной научно-технической конференции «Молодежь. Наука. Инновации - 2012» (Челябинск, 2012); на Всероссийской научно-практической конференции «Разработки Российской Федерации по приоритетным направлениям развития науки, технологий и техники» (Челябинск, 2013).
Личный вклад автора состоит в участии на всех этапах выполнения работы: в планировании исследования, самостоятельном проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных данных, их систематизации и интерпретации, подготовке публикаций и докладов, подготовке работы к защите.
Положения, выносимые на защиту
1. Соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов слюны зависит от пола донора. Жизнеспособные нейтрофильные гранулоциты слюны, цервикального и вагинального секретов обладают способностью образовывать внеклеточные ловушки. У женщин в мукозальных секретах наблюдается рост количества внеклеточных ловушек во вторую фазу менструального цикла. Активация нейтрофилов мукозальных секретов
пирогеналом и форбол-миристат-ацетатом приводит к увеличению
количества нейтрофильных внеклеточных ловушек.
-
Нейтрофилы цервикального секрета активнее, чем нейтрофилы слюны и вагинального секрета, проявляют свою лизосомальную активность, в большем количестве и интенсивнее участвуют в процессе фагоцитоза, а также имеют более высокий кислородзависимый потенциал. Пирогенал и форбол-миристат-ацетат усиливают фагоцитарную, лизосомальную и внутриклеточную кислородзависимую бактерицидную активность нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов.
-
В популяции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови можно выделить две субпопуляции клеток с высокими и низкими показателями прямого светорассеивания. Данные субпопуляции нейтрофилов различаются по экспрессии на своей поверхности рецепторов СD11b и CD95.
Научная новизна
В работе впервые определено количество внеклеточных ловушек, присутствующее у здоровых мужчин и женщин в составе слюны, а также у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла в вагинальном и цервикальном секретах. Установлено, что при сравнении мукозальных секретов между собой наибольшее количество внеклеточных ловушек содержится в слюне у женщин. Количество внеклеточных ловушек в мукозальных секретах репродуктивного тракта у женщин зависит от фазы менструального цикла. Показано, что пирогенал и форбол-миристат-ацетат индуцируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, цервикальном секрете, вагинальном секрете и у нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколл-верографина. Установлено, что нейтрофилы цельной крови и лейкоцитарной взвеси не формируют внеклеточные ловушки даже после воздействия экзогенных факторов микробной и немикробной природы.
В работе показано, что факторы микробной и немикробной природы влияют на морфологический состав популяции нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, а так же увеличивают функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов слизистых оболочек независимо от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин.
Впервые проведено разделение популяции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови на субпопуляции по показателям объема и массы, а так же определена экспрессия рецепторов CD11b и CD95 на нейтрофилах в различных субпопуляциях.
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенные исследования позволяют расширить представление о роли нейтрофильных гранулоцитов в антимикробной защите слизистых оболочек, в частности, их способности к фагоцитозу и образованию внеклеточных ловушек. Результаты исследования расширяют знание о физиологии нейтрофилов, их функциональных возможностях, рецепторном аппарате и гетерогенности популяции. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание роли внеклеточных ловушек в реализации врожденного иммунитета.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в лабораторную диагностику НИИ
иммунологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и
используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, вирусологии,
иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Южно
Уральский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации.
Конкурсная поддержка исследования
В 2012 году научно-исследовательская работа по теме диссертационного исследования победила на областном конкурсе научно-исследовательских работ студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений, расположенных на территории Челябинской области.
Публикации
Соискатель имеет 35 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 33 научные работы общим объмом 5,06 печатных листов, в том числе 22 – в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателем опубликованы 9 работ в материалах всероссийских и международных конференций и 2 - в других научных журналах и изданиях.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами, 6 рисунками и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, список литературы. Указатель литературы включает 88 отечественных и 115 зарубежных источников.
Внеклеточные ловушки как новый механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов
Нейтрофилы являются одной из самых многочисленных клеточных популяций в организме, и в крови человека доля этих клеток врожденного иммунитета составляет более 90 %. Нейтрофильные гранулоциты как важнейшие клетки врожденного иммунитета обеспечивают наиболее быстрые защитные реакции в ответ на проникновение в организм микробных патогенов [41, 163]. Нейтрофильные гранулоциты выполняют функцию киллинга патогенных микроорганизмов с помощью нейтрофильных внеклеточных ловушек и фагоцитоза, а также функцию регуляции иммунного ответа организма хозяина путем модуляции экспрессии клеточных рецепторов и активности провоспалительных цитокинов [17, 33].
Впервые нейтрофильные внеклеточные ловушки были зарегистрированы с использованием электронной микроскопии в 2004г. учеными Института инфекционной биологии имени Макса Планка (Берлин, Германия). Нейтрофильные внеклеточные ловушки связывают микроорганизмы, предотвращая их распространение, и создают высокую концентрацию антимикробных веществ, чтобы уничтожить микроорганизмы [106]. Когда патогенные микроорганизмы попадают в организм, макрофаги испускают «сигнал бедствия», который привлекает большое количество нейтрофильных гранулоцитов в очаг инфекции. Достигнув очага инфекции, нейтрофилы активируются, претерпевая характерные морфологические изменения. В течение нескольких минут происходит деконденсация ядерного хроматина и дезинтеграция ядерной оболочки с одновременным нарушением целостности мембран лизосомальных гранул, что следует за обязательной предварительной стимуляцией в клетках «респираторного взрыва» с высвобождением реактивных форм кислорода. Активированный нейтрофил еще сохраняет свою жизнеспособность, когда в нем происходит смешивание ядерного хроматина с содержимым бактерицидных гранул. Позже цитоплазма разрывается для выпуска хроматина в межклеточное пространство. Высвобожденный хроматин представляет собой протяженные нити, которые переплетаются и связываются между собой, формируя сетевидные структуры, в которых задерживаются микроорганизмы. При высвобождении данной структуры активированный («поврежденный») нейтрофил погибает. Поскольку распад ядерной оболочки совпадает с выходом содержимого нейтрофильных гранул в цитоплазму, нити ДНК ассоциируются с множеством бактериальных продуктов, пагубно влияющих на попавшие во внеклеточные ловушки патогенные микроорганизмы [107, 17]. Формирование нейтрофилами внеклеточных ловушек является важным механизмом врожденного иммунитета, когда, погибая, нейтрофил защищает организм от инфекционных патогенов [127, 194]. Морфологически этот процесс, названный «NETosis», отличается от других классических процессов клеточной гибели – апоптоза и некроза, прежде всего, деконденсацией хроматина и дезинтеграцией ядерной оболочки, исчезновением цитоплазматических гранул и смешиванием ядерного содержимого с материалом цитоплазмы. Молекула ДНК высвобождается из клетки без фрагментации ее эндонуклеазами [127]. При некрозе разрушение клетки происходит путем ее лизиса. Когда ядро растворяется, вязкий базофильный хроматин часто отделяется от жидкого оксифильного [165]. При некрозе нарушается целостность самой клетки, она лизируется, но без развития изменений в гранулах и ядерной мембране [127]. Внутриклеточные события в нейтрофиле проявляются в ее набухании вследствие разрушения мембран и переполнения клетки водой. Наряду с компактными фаголизасомами, отмечается появление огромного количества больших пузырькообразных фаголизосом, в них обычно находятся микроорганизмы. При разрушении мембран, содержимое фаголизасом высвобождается в околоклеточное пространство, вызывая значительное повреждение окружающих тканей [3, 87, 20].
Апоптоз – физиологическое, генетически запрограммированное отмирание клеток. Апоптоз является активным процессом самоликвидации, вызванным внутренними или внешними сигналами, требующий затрат энергии [124, 154, 132]. При апоптозе происходят характерные для этого процесса изменения, принципиально отличающиеся от некроза [145, 91]. При апоптозе сохраняется целостность мембран и органелл, клетка сжимается и округляется [79, 4], хроматин конденсируется и происходит его фрагментация без нарушения целостности ядерной оболочки. Сетеподобная структура, состоящая из молекулы ДНК и содержимого цитоплазматических гранул, при некрозе и апоптозе не образуется [127].
Изучение ультратонких поперечных срезов с помощью трансмиссионной электронной микроскопии показало, что фибриллы (структуры из компонентов ярда и гранул) мембраной не окружены. Фибриллы в ловушках весьма ломки, и их лабораторное выявление требует аккуратной отмывки и фиксации препаратов с целью сохранить НВЛ [53].
Так как обработка дезоксирибонуклеазой приводит к разрушению нейтрофильных внеклеточных ловушек, в противоположность протеазам, которые оставляют ловушку интактной, поэтому молекула ДНК считается основным структурным элементом внеклеточных ловушек, формируемых нейтрофильными гранулоцитами. Нити ДНК в составе внеклеточных ловушек имеют диаметр 15–17 нм, а в комплексе с локализованными на них белками – от 25 до 50 нм. Катионные белки внеклеточных ловушек (сериновые лейкоцитарные протеазы, гистоны и антибактериальные пептиды – АБП) определяют способность данных структур к эффективному киллингу патогенных бактерий [148, 192].
Важнейшим компонентом нейтрофильных ловушек считается лейкоцитарная эластаза (ЛЭ) [148], расщепляющая при дегрануляции ядерные гистоны (Н1, Н4) и запускающая, таким образом, процесс деконденсации хроматина активированных нейтрофилов, необходимый для формирования НВЛ [168]. ЛЭ является протеазой, ответственной за избирательное расщепление бактериальных факторов вирулентности [197], за деградацию микробных антигенов, обладающих провоспалительными и иммуностимулирующими свойствами [151], а также за образование АБП из лизосомальных (небактерицидных) белков предшественников [115]. Этот катионный белок играет решающую роль в обезвреживании некоторых грамотрицательных микроорганизмов (нaпример Pseudomonas aeruginosa [135], Escherichia coli [122]) и считается ключевым белком врожденной антибактериальной защиты [197]. За счет адсорбции на молекуле ДНК достигается высокая концентрация ЛЭ в месте внедрения инфекционного агента. С другой стороны, адсорбция предотвращает повреждающий эффект этой самой опасной лейкоцитарной протеазы на белки плазмы крови и других тканей организма хозяина [148].
Кроме лейкоцитарной эластазы, в состав нейтрофильных внеклеточных ловушек также входят белки из первичных гранул нейтрофила миелопероксидаза и катепсин G, а из содержимого вторичных и третичных гранул лактоферрин и желатиназа. Кроме этого, также в состав внеклеточной ловушки входят гуморальный паттернраспознающий рецептор пентраксин 3 и белки, распознающие пептидогликан [191]. Отрицательно заряженная молекула ДНК служит также основой для адсорбции участвующих в коагуляции плазменных сериновых протеаз, которые вместе c высокомолекулярным кининогеном входят в контактную систему. Образование нейтрофильных внеклеточных ловушек активирует контактную систему, что приводит к резкому повышению уровня секреции антибактериальных пептидов и к усилению врожденного иммунного ответа [166]. Недавно полученные экспериментальные данные наглядно иллюстрируют, что НВЛ – это основа для адгезии тромбоцитов и эритроцитов, ранее неизвестное связующее звено между инфекцией, воспалением и тромбозом. Важно, что внеклеточные ловушки стимулируют внутрисосудистое свертывание крови, а препятствующий тромбообразованию гепарин предотвращает формирование внеклеточных ловушек в образцах крови человека и животных [128]. На сегодняшний день известно, что нейтрофильные внеклеточные ловушки связывают грамотрицательные и грамположительные бактерии, грибы и некоторые вирусы [189]. Однако и микроорганизмы имеют в своем вооружении факторы патогенности, такие как ферменты, деградирующие нуклеиновые кислоты [188, 96, 141]. Анализ литературных данных показал, что внеклеточные ловушки формируют активированные нейтрофилы крови человека [166]. Запускать этот процесс могут различные провоспалительные стимулы, включая перекись водорода (Н2О2), бактериальный липополисахарид (ЛПС), форбол 12-миристат-13-ацетат (ФМА) и интерлейкин-8 (ИЛ-8). Стимулировать процесс образования НВЛ может также продукт расщепления 5-го компонента комплемента во время его активации в сыворотке крови (С5а), но только после премирования зрелых нейтрофилов интерферонами или фактором, стимулирующим образование колоний гранулоцитов и макрофагов (ГМ-КСФ) [156].
Метод забора материала из вагинального и цервикального секрета репродуктивного тракта женщин
Для получения чистой фракции нейтрофилов использовали кровь, взятую из локтевой вены в вакуумную пробирку с гепарином в качестве антикоагулянта (12–30 МЕ гепарина на 1мл крови). 4 мл гепаринизированной крови смешивали с 6 мл стерильного физиологического раствора, полученную смесь наслаивали на градиент плотности растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя составляла 1,075-1,077, нижнего – 1,093-1,095 [199]. Объем каждого слоя градиента составлял 2 мл. После центрифугирования в течение 40 мин при 1500 оборотах в минуту на границе градиентов образовывалось кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%, мононуклеары составляли 2% или отсутствовали. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирали стерильной пипеткой и переносили в стерильную пробирку. Клетки дважды отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 7 минут. Затем клетки доводили до концентрации 5х106 клеток/мл и использовали в исследовании [15].
Забор цервикальной и вагинальной слизи осуществляли с помощью специальной градуированной пипетки на 7-10 и 21-23 дни менструального цикла. Полученный материал помещали в 1,0 мл раствора Хенкса и тщательно суспензировали. Материал доставляли в лабораторию в течение 2-х часов с момента забора. Забор слюны проводили через 1 час после еды (после предварительного полоскания полости рта физиологическим раствором) в одноразовые пробирки в объеме 3 мл, с добавлением 1 мл физиологического раствора в течение 5 минут. После этого материал в течение 1 часа доставляли в лабораторию.
Для оценки влияния различных иммуностимуляторов исследуемый материал инкубировали в течение 30 минут при температуре 37С в присутствии растворов активаторов. Для контроля исследуемый материал инкубировали в тех же условиях, но без активатора.
В качестве иммуностимулятора микробной природы применяли лекарственный препарат пирогенал (Филиал «Медгамал» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва, Россия). Данный препарат использовали в концентрации, соответствующей разовой терапевтической дозе для человека в перерасчете на 1 мл взвеси нейтрофилов.
В качестве иммуностимулятора немикробной природы применяли препарат форбол-12-миристат-13-ацетат (Пика, США) в концентрации 7,5 иМ/мл.
Изучение образования нейтрофильных внеклеточных ловушек проводили как в нативном материале, так и после активации нейтрофильных гранулоцитов факторами микробной и немикробной природы. Определение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, содержащихся в цельной крови доноров, проводили следующим образом. На сухое обезжиренное предметное стекло наносили каплю цельной гепаринизированной венозной крови, затем с помощью чистого шлифовального стекла распределяли кровь по поверхности предметного стекла. Мазки высушивали на воздухе, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Результаты оценивали при помощи световой микроскопии, в мазках подсчитывали процентное содержание внеклеточных ловушек от общего числа нейтрофильных гранулоцитов [62].
Нейтрофильные гранулоциты, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколл-верографина, интактные и активированные пирогеналом и ФМА, наносили на чистое обезжиренное предметное стекло и добавляли каплю 0,04% раствора акридинового оранжевого, накрывали сверху покровным стеклом и удаляли избытки жидкости фильтровальной бумагой. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа Nikon eclipse 50i, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм. В препаратах оценивали процентное содержание нейтрофилов с сегментированным ядром, нейтрофилов с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек. Подсчет проводили на 100 клетках [51].
Оценка соотношения морфологических форм интактных нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, вагинальном и цервикальном секретах
Известно, что нейтрофильные гранулоциты, выходя на поверхность слизистых оболочек и встречаясь с представителями нормальной микрофлоры и другими компонентами секрета, активируются и погибают. В этой связи, одной из задач нашего исследования была сравнительная оценка процентного соотношения морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав различных биологических секретов, между собой, а также определение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, содержащихся в мукозальных секретах. Использование в работе сложного метода окрашивания с применением двух красителей: синьки Эванса и Sytox Green, позволило не только выявить процентное содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах, но и определить соотношение различных морфологических форм нейтрофилов в них. При сравнении показателей количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, присутствующих в слюне у мужчин и у женщин в разные фазы менструального цикла, было обнаружено, что у мужчин в слюне достоверно выше количество НВЛ по сравнению с этим показателем у женщин в первую фазу и значимо ниже по отношению к женщинам во вторую фазу менструального цикла (таблица 3.1.1). У женщин во всех биологических секретах во вторую фазу менструального цикла наблюдалось достоверное увеличение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек по сравнению с этим показателем в первую фазу.
При изучении количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, присутствующих в различных биологических секретах, установлено, что максимальное количество внеклеточной ДНК входит в состав секрета слюны.
Во вторую фазу менструального цикла у женщин в цервикальном секрете было выявлено достоверно более высокое количество внеклеточных ловушек, чем в вагинальном секрете, при этом в первую фазу менструального цикла у женщин количество нейтрофильных внеклеточных ловушек в секретах урогенитального тракта примерно одинаковое.
У мужчин в слюне значимо выше содержание жизнеспособных нейтрофилов по сравнению с этим показателем у женщин как в первую, так и во вторую фазы менструального цикла (таблица 3.1.2).
Достоверных различий по показателю количества жизнеспособных нейтрофильных гранулоцитов, присутствующих в различных биологических секретах, между женщинами в первую и женщинами во вторую фазы менструального цикла выявлено не было ни в одном из исследуемых материалов.
Проведенное исследование установило, что наибольшее количество жизнеспособных клеток входит в состав цервикального секрета независимо от фазы менструального цикла.
В ходе выполения исследования было выявлено, что в слюне у мужчин достоверно ниже содержание нейтрофильных гранулоцитов в состоянии апоптоза по сравнению с этим показателем у женщин, как в первую, так и во вторую фазу менструального цикла (таблица 3.1.3). У женщин количество нейтрофильных гранулоцитов в состоянии апоптоза во вторую фазу менструального цикла было ниже, чем в первую во всех исследованных мукозальных секретах.
При оценке количества нейтрофильных гранулоцитов, находившихся в состоянии апоптоза в различных биологических секретах, было установлено, что минимальное значение данный показатель принимал у нейтрофильных гранулоцитов цервикального секрета, а максимальное у нейтрофилов слюны.
Из данных приведенных в таблице 3.1.4 видно, что в слюне у мужчин содержалось достоверно большее количество мертвых нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с этим показателем у женщин, как в первую, так и во вторую фазы менструального цикла.
Ни в одном из исследуемых мукозальных секретов значимых отличий между показателями количества мертвых клеток, входящих в их состав у женщин в разные фазы менструального цикла, выявлено не было.
У женщин в состав цервикального и вагинального секретов входит достоверно большее количество мертвых клеток при сравнении со слюной. Таким образом, при изучении секрета слюны было установлено, что процентное соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов зависит от пола донора и фазы менструального цикла у женщин. У женщин во вторую фазу менструального цикла во всех исследуемых мукозальных секретах происходит достоверное увеличение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек и снижается количество нейтрофильных гранулоцитов в состоянии апоптоза. При сравнении морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов слюны, цервикального и вагинального секретов у женщин было установлено, что наибольшее количество нейтрофильных внеклеточных ловушек и апоптозных клеток входит в состав секрета слюны, при этом в цервикальном секрете достоверно выше количество жизнеспособных клеток относительно двух других секретов.
Оценка фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов различных мукозальных секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом и ФМА
У мужчин, а так же у женщин в обе фазы менструального цикла после активации пирогеналом и ФМА в популяции нейтрофилов, входящих в состав секретов слюны, влагалища и шейки матки, увеличивалось число клеток активно захватывающих латексные частицы по сравнению с контролем, а так же возрастал такой показатель фагоцитоза как интенсивность (таблица 4.3.1).
У женщин в первую фазу менструального цикла во всех исследуемых мукозальных секретах разницы в действии пирогеналом и ФМА выявлено не было. У женщин во вторую фазу менструального цикла активация ФМА слюны и вагинального секрета приводила к усилению активности и интенсивности фагоцитоза относительно показателей нейтрофилов активированных пирогеналом. Изучение показателей местного иммунитета слюны показало, что в неактивированном состоянии фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов слюны у мужчин превышала эти же показатели у женщин на протяжении всего менструального цикла. После активации пирогеналом и ФМА различий в показателях активности и интенсивности фагоцитоза, а так же фагоцитарного числа выявлено не было. В среднем в слюне и у мужчин, и у женщин после действия активаторами 60% нейтрофилов активно захватывали частицы латекса. У женщин в течение менструального цикла в цервикальном и вагинальном секретах не происходило изменений показателей фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов, как в контроле, так и после действия активаторов. После активации нейтрофилов вагинального и цервикального секрета пирогеналом и ФМА число активно фагоцитирующих клеток составляло около 60%, так же как и в слюне.
Таким образом, воздействие иммуностимуляторов микробной и немикробной природы на клетки, входящие в состав мукозальных секретов, приводило к усилению фагоцитарной активности. Не все нейтрофильные гранулоциты слизистых оболочек, даже после активации, способны к внутриклеточному уничтожению микроорганизмов. Процент нейтрофилов, активно захватывающих чужеродные объекты в слюне, вагинальном и цервикальном секретах, составлял около 60% от общего числа клеток и не зависил от пола донора и фазы менструального цикла.
Оценка показателей НСТ-теста нейтрофилов слюны, вагинального и цервикального секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом и ФМА
Из данных приведенных в таблице 4.4.1 следует, что действие пирогенала у женщин в слюне, вагинальном и цервикальном секретах, независимо от фазы менструального цикла, не приводит к значимым изменениям кислородзависимого метаболизма. При этом воздействие ФМА на нейтрофилы мукозальных секретов вызывало усиление кислородзависимого метаболизма, что выражалось в росте показателей активности и интенсивности НСТ-теста. В слюне у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла активация ФМА приводила к росту показателей как спонтанного, так и индуцированного НСТ-теста относительно неактивированных клеток. Как и в контроле, после действия активаторов различной природы разницы между показателями у женщин в различные фазы менструального цикла не установлено. У мужчин и в контроле, и после активации секрета слюны пирогеналом и ФМА показатели и спонтанного, и индуцированного НСТ теста не отличались от показателей у женщин. У мужчин в слюне, в отличие от женщин, активация пирогеналом приводила к усилению кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Активация ФМА нейтрофильных гранулоцитов вагинального и цервикального секретов приводила к увеличению кислородзависимого метаболизма, при этом полученные значения спонтанного и индуцированного НСТ-теста достоверно превышали не только контрольные значения, но и показатели клеток после активации пирогеналом.
И у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла, и у мужчин во всех исследованных мукозальных секретах после активации пирогеналом и ФМА наблюдалось снижение показателей функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов, входивших в состав секрета, по сравнению с контролем.
После активации нейтрофильных гранулоцитов биологических секретов ФМА были отмечены такие же закономерности, как и при активации секретов пирогеналом, а именно: минимальные значения спонтанного НСТ-теста имели нейтрофилы вагинального секрета, а максимальные значения индуцированного НСТ-теста – нейтрофильные гранулоциты цервикального секрета.
Таким образом, активация мукозальных секретов и у мужчин, и у женщин пирогеналом и ФМА усиливала функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, что выражалось в росте показателей количества внеклеточных ловушек, усилении лизосомальной активности, увеличении показателей фагоцитарной активности и НСТ-теста. Однако, по всей видимости, не все нейтрофильные гранулоциты подвергались активации, на что косвенно указывал тот факт, что не зависимо от выбранного активатора количество внеклеточных ловушек в биологических секретах не превышало 40%, а так же не более 60% клеток способны активно захватывать чужеродные частицы.
В ходе выполнения работы так же было установлено, что после воздействия пирогеналом и ФМА на исследуемые мукозальные секреты происходило уменьшение функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с неактивированными клетками. Причиной этого могло служить как уменьшение количества жизнеспособных нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав секретов после активации, так и неоднородность популяции нейтрофилов, а именно тот факт, что, по-видимому, не все нейтрофилы способны продуцировать активные формы кислорода в ответ на стимуляцию.
