Содержание к диссертации
Введение 5
1. Литературный обзор 9
Введение 9
1.1. Иммунный ответ против ВИЧ 17
Гуморальный ответ 17
Основные нейтрализующие эпитопы 17
Клеточный ответ 20
1.2. Вакцины против ВИЧ/СПИД 24
Вакцины на основе рекомбинантных векторов 24
Вакцины на основе живого аттенуированного вируса 27
ДНК вакцины и стратегия прайм/буст 28
Вакцины на основе рекомбинантных белков и субъединичных 29 антигенов
Модели ВИЧ - инфекции/СПИД 33
Клинические испытания кандидатных вакцин против вич/спид 35
Гуморальный ответ на вакцинацию людей против ВИЧ/СПИД 35
Основные результаты клинических испытаний: 36
Клеточный ответ на вакцинацию людей против ВИЧ/СПИД 38
Основные результаты клинических испытаний: 38
2. Материалы и методы 40
Рекомбинантные белки и их конъюгаты с Полиоксидонием. 40
Методика изучения иммуногенных свойств 46 рекомбинантных белков ВИЧ1.
Иммунизация мышей. 46
Твердофазный непрямой иммунофементный анализ. 46
Иммунометрический ( «сэндвич») метод ИФА. 47
Иммунизация кроликов. 48
Постановка твердофазного иммуноферментного анализа. 48
Постановка иммунометрического «сэндвич» метода ИФА. 49
2.3. Методика изучения иммуногенности белка гес(24-41) при введении 49
высоких и низких доз препарата.
2.4. Методика изучения иммуногенности конъюгата химерного 49
рекомбинантного белка гее (24-41) с полиоксидонием гее (24-41) -
ПО.
Проведение иммуноблота с сыворотками животных, 50 иммунизированных гес(24-41).
Проведение ИФА с сыворотками животных, иммунизированных 51 гес(24-41) с использованием антигенов коммерческих тест-систем.
Проведение теста нейтрализации. 52
Иммунизация животных. 52
Постановка реакции нейтрализации. 52
Проведение реакции бластной трансформации лимфоцитов. 53
Проведение ИФА и иммуноблота для изучения специфической 54 активности гес(24-41).
Проведение ИФА с сыворотками людей, инфицированных ВИЧ 1. 54
Проведение ИФА с поликлональными антителами барана против 55 вирусного белка р24 из коммерческого набора GENETIC SYSTEMS HIV-1 AGEIA.
Проведение иммуноблота с сыворотками людей инфицированных 56 ВИЧ1.
Проведение электрофореза в полиакриламидном геле. 56
Постановка иммуноблота. 57 3. Результаты и обсуждение 59
Изучение иммуногенных свойств рекомбинантных белков ВИЧ 1. 59
Изучение специфической активности гес(24-41). 63
Изучение специфической активности гес(24-41) в ИФА. 64
Изучение специфической активности гес(24-41) в иммуноблоте. 69
Изучение специфической активности сывороток мышей, 71 иммунизированных гее (24-41).
Изучение иммунногенности рекомбинантных белков ВИЧ при 73 введении высоких и низких доз антигенов.
Изучение иммуногенных свойств конъюгата рекомбинантного белка 75 гее (24-41) с полиоксидонием.
Исследование нейтрализующей активности сывороток мышей, 78 иммунизированных гее (24-41).
Изучение пролиферативной активности клеток, животных 80 иммунизированных гее (24-41).
Заключение 82
Выводы 84
Список сокращений 85
Список литературы 86
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Эпидемия синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), который является заключительной фазой инфекции ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), приняла характер пандемии. К настоящему времени от СПИДа умерло более 20 миллионов человек, а инфицировано более 60 миллионов. Россия занимает одно из лидирующих мест по темпам роста инфицирования. Вирус поражает молодое трудоспособное население. Инфекция ВИЧ предается половым путем, с кровью или ее препараты, от инфицированной матери к ребенку во время родов, при грудном вскармливании или во время беременности. В борьбе с ВИЧ-инфекцией достигнут определенный прогресс, связанный с разработкой эффективной лабораторной диагностики, позволяющей в большинстве случаев определять инфекцию уже через месяц после заражения и, таким образом, предотвращать распространение вируса через банки крови и своевременно начинать антиретровирусную терапию. Исследованы молекулярная структура вируса, его жизненный цикл, используемые им клеточные рецепторы и корецепторы. Однако, не смотря на все принимаемые меры, эпидемия продолжает распространяться. В России это связано, прежде всего, с тем, что в настоящее время распространение вируса идет среди внутривенных наркоманов и их половых партнеров. Терапия не способна излечивать инфицированных людей, т.е. удалять вирус из организма, а стоимость годового курса лечения достигает 10 000 и больше долларов. Кроме того, показано образование штаммов вируса, устойчивых к лекарственным препаратам.
В связи с этим особое значение приобретает комплекс превентивных мер, частью которых является безопасная и эффективная вакцина.
Более 30 кандидатных вакцин проходят или прошли I или II фазу клинических испытаний. В ходе этой работы исследуется широкий спектр вакцинирующих препаратов (профилактических и терапевтических), различные схемы иммунизации и адъюванты. В последнее время возрос интерес к терапевтическим вакцинам в связи с внедрением в клиническую практику активной многокомпонентной специфической антиретровирусной терапии (НАART) [156]. Предполагается, что при перерыве в HAART следует назначать терапевтическую вакцину, чтобы иммунная система оставалась активной и сдерживала всплеск размножения вируса. Другой причиной
активизации интереса к терапевтической вакцине является возможность с ее помощью смягчить остроту инфекционного процесса, снизить концентрацию вируса в организме и биологических жидкостях и тем самым снизить риск заражения людей, контактирующих с ВИЧ - инфицированными. Разработка вакцины особенно важна для нашей страны, где темпы ежегодного прироста числа новых случаев одни из самых высоких в мире. По данным Российского Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбы со СПИДом, в России в 2002 году зарегистрировано 200 000 ВИЧ - инфицированных.
Характерной особенностью ВИЧ является его высокая вариабельность. В связи с этим одним из исследуемых подходов является разработка так называемых «региональных» вакцин, в которых используются антигены, соответствующие субтипу ВИЧ, циркулирующему в данном географическом регионе. Прежде всего, это относится к вакцинам, основанным на белках оболочки ВИЧ, кодируемых геном env. Однако внутренние белки ВИЧ, в частности антигены, кодируемые геном gag, значительно более консервативны, следовательно, можно ожидать, что иммунный ответ против них может быть направлен против различных субтипов ВИЧ [35]. Поэтому в настоящее время особое внимание уделяется разработке вакцин на основе целых внутренних белков ВИЧ или их фрагментов.
Одними из перспективных являются вакцинные препараты на основе рекомбинантных белков. Они безопасны, имеют невысокую себестоимость, методика их получения и очистки хорошо отработана. В результате иммунизации рекомбинантными белками можно вызвать образование нейтрализующих антител и активацию CD4 клеток, играющих важную роль в контролировании ВИЧ [7,139,187,188,189,21].
В связи с этим целью работы было исследование иммунореактивности рекомбинантных белков, содержащих копии фрагментов и полноразмерных белков сердцевины и/или оболочки ВИЧ1 для их последующего применения в составе кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных белков, повторяющие антигенные детерминанты ВИЧ1.
Провести сравнительный анализ сходства антигенных детерминант рекомбинантных белков с таковыми вирусного прототипа.
Провести сравнительный анализ иммунного ответа, вызываемого рекомбинантными белками, повторяющими антигенные детерминанты ВИЧ1, с иммунным ответом на вирус.
Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных белков при введении высоких и низких доз препарата.
Исследовать иммуногенные свойства конъюгата рекомбинантных белков с Полиоксидонием.
Провести анализ нейтрализующей активности сывороток животных, иммунизированных рекомбинантными белками, повторяющими антигенные детерминанты ВИЧ 1.
Исследовать лимфопролиферативный ответ, вызываемый рекомбинантными белками, повторяющие антигенные детерминанты ВИЧ1.
Научная новизна работы.
Впервые исследованы иммуногенные свойства нового экспрессируемого в E.coli химерного рекомбинантного белка гес(24-41), повторяющего последовательность консервативного полноразмерного внутреннего белка ВИЧ1 -р24 и фрагмента трансмембранного белка ВИЧ1 - gp41.
Впервые показано, что иммунизация лабораторных животных рекомбинантным химерным белком приводит к образованию высоких титров антител на обе его составляющие - р24 и gp41- у разных видов животных (мышей и кроликов).
Впервые показано, что рекомбинантный химерный белок вызывает сильный лимфопролиферативный ответ клеток селезенки и лимфатических узлов мыши.
Впервые показано, что рекомбинантный химерный белок индуцирует у животных образование вирус - нейтрализующих антител.
Впервые исследованы иммуногенные свойства конъюгата белка гес(24-41) с иммуномодулятором Полиоксидонием. Показано, что конъюгация белка с Полиоксидонием позволяет достичь высокого иммунного ответа при введении низких доз антигена, и не приводит к изменению его антигенных детерминант.
Научно-практичесое значение работы.
На основании полученных данных создан кандидатный вакцинный препарат «ВИЧРЕПОЛ», представляющий собой конъюгат химерного рекомбинантного белка гес(24-41) с Полиоксидонием. В настоящее время препарат проходит доклиническое исследование в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Положения, выносимые на защиту.
1. Химерный рекомбинантный белок гес(24-41) является высокоактивным
иммуногеном: он вызывает образование антител на оба своих участка - р24 и gp41
при иммунизации как высокими, так и низкими дозами препарата и антиген-
специфическую пролиферацию клеток лимфатических узлов и селезенки у
лабораторных животных.
Антигенные детерминанты рекомбинантного химерного белка гес(24-41), повторяющего внутренний белок р24 и часть трансмембранного белка gp41 ВИЧ1, схожи с антигенными детерминантами вирусного прототипа.
Химерный рекомбинантный белок гес(24-41) индуцирует у лабораторных животных иммунный ответ, специфичность которого схожа со специфичностью иммунного ответа на вирус.
Конъюгация рекомбинантного химерного белка с Полиоксидонием увеличивает иммуногенность гес(24-41) при иммунизации низкими дозами.
Иммунизация лабораторных животных рекомбинантным вирусным белком гес(24-41) вызывает образование антител, нейтрализующих лабораторный штамм ВИЧ1.
1. литературный обзор
ВВЕДЕНИЕ
Вакцина является одним из средств, которые могли бы остановить эпидемию ВИЧ. Желательно, чтобы полученная вакцина соответствовала следующим критериям:
Вызывала образование антител, способных нейтрализовать все субтипы вируса.
Активировала вирус - специфические ЦТЛ.
Индуцировала сильный ответ на слизистых.
Разрабатываемые вакцины против ВИЧ/СПИД могут быть как терапевтическими, так и профилактическими, т.е. вызывать иммунный ответ, который полностью или частично контролировать ВИЧ-инфекцию [76]:
1. Стерильный Заражение не происходит, т.е. клетки не содержат
иммунитет интегрированного провируса (вирус не обнаруживается
(наиболее в крови, в лимфатических узлах или в месте
предпочтительный), инфицирования при использовании самых
(профилактические чувствительных методов ПЦР). Отсутствие
вакцины) сероконверсии к белкам ВИЧ, которые не представлены
в вакцине. Не детектируются ЦТЛ к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине.
2. Временная Низкий уровень вируса, определяющийся только в
инфекция. первое время после заражения (вирус не обнаруживается
(профилактические в крови, в лимфатических узлах или в месте
вакцины) инфицирования при использовании самых
чувствительных методов ПЦР через 6 месяцев и все последующее время). Отсутствие или временная сероконверсия к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине. Временно или не детектируются ЦТЛ к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине.
3. Контролируемая Снижается уровень вируса и остается низким (< 1000
инфекция. копий РНК/мл). Сероконверсия к белкам ВИЧ, которые
(терапевтические не представлены в вакцине. ЦТЛ к белкам, не
вакцины) представленных в вакцинном препарате.
4.Отсутствие Уровень вируса в крови и секретах недостаточно
инфицирования высокий для инфицирования,
других.
(терапевтические вакцины)
При разработке вакцины против ВИЧ/СПИД исследователи столкнулись с серьезными трудностями:
Отсутствие случаев самопроизвольного выздоравливания инфицированных;
Не установлено, какие механизмы определяют иммунную защиту против вируса;
Вирус встраивается в геном хозяина;
Желание достигнуть стерильного иммунитета;
Генетическая вариабельность вируса;
Нет адекватной животной модели;
Передача вируса посредством клеток;
Однако в настоящее время накоплены факты, позволяющие надеяться на создание эффективной вакцины:
Иммунная система некоторое время (достаточно долго) способна контролировать ВИЧ-инфекцию после заражения.
Показан ВИЧ - специфический иммунный ответ у людей, имеющих частые половые контакты с ВИЧ инфицированными, но остающимися незараженными.
У приматов удается индуцировать вакцинами иммунный ответ против родственного ВИЧ вируса иммунодефицита обезьян.
ВИЧ2 обеспечивает частичную защиту против ВИЧ1 инфекции [89].
ВИЧ1 малоинфекционный.
В последнее время разработаны новые подходы к созданию вакцинных препаратов (например, вакцины на основе рекомбинантных векторов, ДНК-вакцины, стратегия прайм-буст).
Геном ВИЧ отличается сложностью, на ряду с генами кодирующими структурные белки, в него входят гены регуляторных элементов. Ниже перечислены структурные элементы ВИЧ их функции, а также гены и их продукты [91].
Генные структурные элементы ВИЧ
LTR Длинный концевой повтор. Последовательность ДНК, фланкирующая геном интегрированного провируса. Содержит важные регуляторные области для начала транскрипции и полиаденилирования.
TAR Участок связывания для белка tat и клеточных белков. Состоит приблизительно из первых 45 нуклеотидов вирусной мРНК у ВИЧ1 (или первых 100 нуклеотидов ВИЧ2 и ВИО). РНК tar образует шпильку с боковой петлей, для связывания и функционирования белка tat.
RRE Элемент РНК, кодирующийся в области env. Состоит приблизительно из 200 нуклеотидов (7327-7530 от начала транскрипции ВИЧ1, соединяет края gpl20 и gp41). Необходим для действия гена rev. Содержит высоко аффинный сайт для белка rev. rre образует комплекс вторичных структур, необходимых для специфического связывания белка.
CRS Ингибирует экспрессию структурных белков в отсутствие rev.
INS Находится среди структурных генов ВИЧ1. Ингибирует посттранскрипционную экспрессию. Мутации в этой области приводят к инактивации INS и повышенной экспрессии генов.
Гены и их продукты
GAG Область гена, кодирующая капсидные белки (антигены групповой
специфичности). Предшественником является миристилирированный
белок р55, который процессируется (нарезается) вирусной протеазой
на белки: р17 (Матриксный), р24 (Капсидный), р7
(НуклеоКапсидный) и рб. gag соединяется с цитоплазматической
—
н^ мембраной, где происходит сборка вирусного вириона.
Й Предшественник gag 55 kDa белок называется ассемблин, что
отражает его роль в сборке вириона (assembly).
A POL Область гена, кодирующая ферменты протеазу, обратную
^ транскриптазу и интегразу. Продукт экспрессируется как
ь^ предшественник gag-pol полипротеин, который затем процессируется
Рн вирусными протеазами.
^ ENV Продукт гена - гликопротеин gpl60, который процессируется на два
нековалентно связанных белка: наружный gpl20 и трансмембранный
gp41. Зрелые gpl20- gp41 образуют тримеры на поверхности вируса.
На gpl20 находится сайт связывания с CD4 и хемокиновыми
рецепторами (корецепторами ВИЧ1).
ТАТ Трансактиватор экспрессии генов ВИЧ. Известно две его формы: tat 1
Н ехоп (минорная форма, состоит из 72 аминокислот) и Tat 2 exon
2 (мажорная форма, состоит из 86 аминокислот). Его действие
основано на связывании с TAR элементом РНК, что приводит к
hQ активации начала и элонгации транскриппции от LTR промотора.
—
Рн REV Регуляторный фактор вирусной экспрессии. Фосфопротеин с
Е молекулярной массой 19 kD, находится в ядреклетки, связываясь с
^ RRE, обеспечивает переход репликации вируса из ранней стадии
И экспрессии регуляторных генов в стадию крупномасштабной
экспрессии структурных генов ВИЧ.
VIF Фактор вирусной инфекционности. Основный протеин, 23 kD. Способствует инфекционности вируса, но не продукции вирусных частиц. В отсутствие vif образуются неполноценные вирусные частицы, но путь передачи вируса через клетку не нарушается, vif -цитоплазматический белок, существующий как в растворимой, так и в связанной с мембраной форме.
VPR Вирусный белок R, состоит из 96 аминокислот (14 kD), располагается в ядре клетки. Взаимодействует с белком gag рб. Основная функция -трансактивация клеточных генов, импорт преинтегрированных
Н комплексов и активация дифференцировки клетки.
|jq VPU Вирусный белок U, состоит из 81 аминокислоты (16 kD), встроен в
мембрану. Разрушает CD4 в эндоплазматическом ретикулеме и усиливает высвобождение вирионов из плазматической мембраны
pq ВИЧ - инфицированных клеток. Vpu способствует созреванию белка
LQ env.
Ч^ NEF Многофункциональный миристилированный белок 27 kD. В
основном располагается в цитоплазме и связан с цитоплазматической
мембраной. Это один из первых вирусных белков, который
продуцируется в инфицированной ВИЧ клетке. Высоко иммуногенен.
Необходим для распространения вируса и развития болезни, nef
снижает уровень CD4 и МНС1 молекул на поверхности клетки.
Взаимодействие nef с компонентами пути сигнальной клеточной
трансдукции, приводит к увеличению инфекционность вируса.
VPX Белок ВИЧ2, 12 kD. Является гомологом vpr ВИЧ1.
Белки ВИЧ
БЕЛОК
РАЗМЕР
ФУНКЦИЯ
РАСПОЛОЖЕНИЕ
GAG MA р17
вирион
связывание с мембраной; взаимодействие с env; транспорт сердцевины вируса в ядро
р 10-15 способствует локализации в ядре преинтегрального комплекса, ингибирует клеточное деление, задерживает инфекционные клетки в фазе G2/M
вирион, ядро
Рисунок 1.1. Строение вириона ВИЧ1.
Tat1
Tat2
Rev1
Rev2
5'LTR
3'LTR
Рисунок 1.2. Строение генома ВИЧ1
