Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема аналгезии привлекает особое внимание исследователей и клиницистов. Несмотря на наличие в арсенале современной медицины широкого круга лекарственных препаратов, обладающих аналгетичсскими свойствами, изучение фундаментальных механизмов, лежащих в основе кодирования и восприятия ноцицептивных сигналов с целью создания принципиально новых лекарственных средств, остается по-прежнему актуальным.
Большинство субстанций, претендующих на роль лекарственных препаратов, выявляют с помощью одного из трех подходов: 1) химическая модификация известных молекул; 2) скрининг биологической активности большого количества натуральных продуктов, ряда ранее открытых химических структур, больших «библиотек» пептидов или нуклеиновых кислот; 3) направленный синтез (рациональный дизайн лекарств), основанный на понимании биологических механизмов реализации их эффектов и химической структуры мишеней (Катцунг Б.Г, 1998).
Создание полусинтстичсских и синтетических агонистов и антагонистов опиатов является примером первого подхода. Второй подход можно проиллюстрировать созданием препаратов, представляющих собой пептидные биорегуляторы. Пример реализации третьего подхода - создание ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, которое стало возможным благодаря изучению связи между строением и действием блокаторов активного сайта фермента и компьютерному конструированию гипотетической химической структуры лекарства.
Для создания нового лекарственного препарата, относящегося к группе аналгетиков, наряду с общепринятыми способами может использоваться и принципиально иной подход. В его основе лежит исследование возможности фармакологической модуляции сигнальной функции Na\K+-AT
Модуляторы активности медленных натриевых каналов являются субстанциями, применение которых представляется перспективным с точки
зрения разработки новых аналгетических лекарственных препаратов, поскольку анальгезирующие агенты, независимо от первичной мишени воздействия, избирательно снижают их функциональную активность (Brau М.Е., et al., 2001; OgataN., Ohishi Y., 2002).
Механизм болеутоляющего действия наркотических аналгетиков (наиболее эффективных соединений) обусловлен влиянием препаратов на разных уровнях прохождения ноцицсптивного сигнала. Аналгезия на спинальном уровне осуществляется за счет взаимодействия опиоидного соединения с ц-, <5- или - рецепторами. Опиоидные рецепторы вовлечены в однотипный механизм сигнализации, включающий в себя опиоидный рецептор - G белок - кальциевый или калиевый канал (Катцунг Б.Г., 1998). G белок в этом механизме выполняет функцию трансдуктора, усиливая величину сигнала при передаче ноцицептивной информации от рецептора к ионному каналу, а также передавая его на геном. При этом изменяются системы вторичных посредников, связанных с током кальция, ингибированием аденилатциклазы и стимуляцией синтеза G белков (Катцунг Б.Г., 1998). Повышение уровня экспрессии G белков стимулирует синтез опиоидных рецепторов и увеличение числа ионных каналов.
Модуляция ноцицептивного сигнала может оцениваться по снижению потенциалочувствительности активационного воротного устройства медленных натриевых каналов сенсорных нейронов спинального ганглия, которое возникает вследствие уменьшения величины эффективного заряда. Исследование механизма кодирования ноцицептивного сигнала в системе опиоидоподобный рецептор - Ка*,К+-АТФаза - Мау1,8-канал (Крылов Б.В. и др., 1999) с помощью метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp метод) показало, что не только наркотические аналгетики оказывают влияние на этот процесс. Эффективность гидрохлорида морфина (Крылов Б.В. и др., 1999) была сопоставима с эффективностью производных гамма-пирона (Derbenev A.V., ct al., 2000; Рогачевский И.В. и др., 2006, Плахова В.Б. и др., 2006). При этом оказалось, что на фоне блокаторов G белков эффекты исследуемых соединений сохранялись. Приложение налтрексона или оуабаина к наружной стороне мембраны сенсорного нейрона устраняло влияние изученных соединений на эффективный заряд воротного устройства медленного натриевого канала (Крылов Б.В. и др., 1999; Derbenev A.V. et al., 2000). Были получены экспериментальные доказательства участия Na+,K+-АТФазы в модуляции ноцицептивного сигнала (Крылов Б.В. и др., 1999; Derbenev А. V. et al., 2000).
Фармакологическая модуляция сигнальной (транедукторной) функции №+,К+-АТФазы при помощи производных гамма-пирона может позволить направленно регулировать ноцицептивные сигналы и зарегистрировать обезболивающий эффект соединения in vivo. Последнее открывает перспективы для создания аналгетического препарата нового класса.
Как трансдуктор сигнала Ыа+,К+-АТФаза участвует не только в регуляции ноцицепции, но и в модуляции роста и пролиферации клеток разных тканей (Пеннияйнен В.А. и др., 2003; Xie Z., Askari А., 2002; Schiener-Bobis G., 2002;
Schoner W., 2002a; Schoner W., 20002b; Schoner W., Schiener-Bobis G., 2005). Ec активность в организме человека и животных регулируют эндогенные дигиталисоподобные факторы, выделяющиеся в кровь в наномолярных концентрациях. Возможно, эндогенные стероиды могут модулировать сигнальную функцию 1\'а+,К+-АТФазы в системе опиоидоподобный рецептор -Ыа+,К.+-АТФаза - Navl.S-канал и изменение функциональной активное Ыа+,К+-АТФазы будет оказывать как аналгетический, так и иные эффекты.
Цель исследования. Исследовать болеутоляющий эффект и изменение пролиферативной активности клеток разных тканей при фармакологической модуляции сигнальной функции Ыа+,К+-АТФазы и разработать оригинальный лекарственный препарат с аналгетической активностью, механизм действия которого связан с модуляцией этой функции фермента.
Задачи:
-
Исследовать участие Na+,IC- АТФазы в модуляции ноцицептивных сигналов в системе опиоидоподобный рецептор - №+,К+-АТФаза - Navl.S-канал.
-
Исследовать действие эндогенного блокатора Ыд+,К+-АТФазы оуабаина на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.
-
Выявить физиологическую роль рамнозильного остатка в молекуле оуабаина.
-
Исследовать действие препаратов группы сердечных гликозидов как экзогенных блокаторов Na+,K -АТФазы на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.
-
Исследовать действие производной гамма-пирона коменовой кислоты как экзогенного модулятора Na+,K+-АТФазы на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов, ткани сердца и сетчатки глаза 10-12-дневных куриных эмбрионов.
-
Исследовать аналгетическую активность коменовой кислоты в экспериментах in vivo.
-
На основе коменовой кислоты разработать лекарственную форму препарата, обладающего аналгетическим эффектом и реализующего свои свойства за счет модуляции сигнальной функции Ма+,КГ-АТФазы.
-
Оценить фармакологическую активность препарата «Аноцептин» в экспериментах in vitro и in vivo.
-
Изучить возможность формирования лекарственной зависимости при длительном введении препарата «Аноцептин».
-
Изучить безопасность действия и фармакоюшетику препарата «Аноцептин» в исследованиях на животных и человеке.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработана методологическая система поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции Na^,K+-АТФазы.
-
Сигнальная функция К'а+,К.+-АТФазы проявляется в модуляции ноцицептивных сигналов ансамблем: опиоидоподобный рецептор -Na\K+-АТФаза - Ыа4-8-канал (либо №+,К+-АТФаза - №у1.8-канал) и регуляции процесса тканевого моделирования на различных этапах онтогенеза.
-
Оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, модулирует сигнальную функцию Ыа+,К+-АТФазы. Наличие в молекуле оуабаина рамнозильного остатка повышает аффинность Ма+,К+-АТФазы к этому сердечному гликозиду и определяет тканеспецифичность действия гликозида.
-
При регуляции процессов роста и пролиферации в эмбриональный период развития оуабаин по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагенин и сопоставим с коменовой кислотой. Трофотропные эффекты оуабаина и коменовой кислоты наиболее выражены в отношении ткани сетчатки.
-
На основе производной гамма-пирона коменовой кислоты создан препарат «Аноцептин», обладающий аналгетической и противовоспалительной активностью и не вызывающей лекарственной зависимости и выраженных побочных эффектов при его длительном (90 суток) парентеральном введении.
Научная новизна. Доказано, что Ыа+,К+-АТФаза как трансдуктор участвует в модуляции ноцицептивных сигналов в системе опиоидоподобный рецептор - Ыа+,К+-АТФаза - Nav1.8-Kanan и направленной регуляции процесса тканевого моделирования. Показано, что физиологическое значение эндогенных дигиталисоподобных факторов заключается в регуляции этих процессов на разных этапах онтогенеза. Обнаружено, что оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, участвует в регуляции ноцицептивных сигналов в ансамбле №ь,К4-АТФаза - Кау1.8-канал мембраны сенсорных нейронов спинальных ганглиев млекопитающих.
Наличие в молекуле оуабаина рамнозильного остатка повышает аффинность Ыа^,К+-АТФазы к этому гликозиду на пять порядков. При регуляции процессов роста и пролиферации в эмбриональный период развития оуабаин по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагенин и сопоставим с коменовой кислотой.
Установлено, что трофотропные эффекты оуабаина и коменовой кислоты наиболее выражены в отношении ткани сетчатки.
Действие препарата «Аноцептин», разработанного на основе коменовой кислоты, основано на рецептор-опосредованной регуляции сигнальной функции Na ,К -АТФазы сенсорных нейронов спинальных ганглиев. Доказана его эффективность как аналгетического средства. Обнаружен противовоспалительный эффект препарата. Применение препарата «Аноцептин» не вызывает активации системы положительного подкрепления латерального гипоталамуса. Лекарственная зависимость при длительном
парентеральном введении препарата не формируется. Побочные эффекты при использовании аноцептина в аналгетических дозах не проявляются.
Теоретически и экспериментально обосновано новое перспективное направление создания аналгетических средств, механизм действия которых основан на фармакологической модуляции сигнальной функции Na+,K+-АТФазы.
Научно-практическое значение работы. Разработана методологическая система поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции №\К1-АТФазы.
Создана лекарственная форма принципиально нового отечественного препарата «Аноцептин», относящегося к классу аналгетиков. Отчет о доклиническом исследовании безопасности, фармакокинетики и фармакологической активности препарата «Аноцептин» (лекарственная форма в виде I и 2% раствора для внутривенных инъекций) представлен в Фармакологический комитет Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации. На основании разрешения Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития N 185 от 03 05.2007 г. в Институте мозга человека РАН проведено исследование безопасности и фармакокинетики препарата «Аноцептин» в клинических условиях. Безопасность препарата для организма человека клинически доказана. Отчет о клиническом исследовании безопасности и фармакокинетики представлен в ФГУ Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора РФ и утвержден (протокол N12 от 5 июня 2009 г.). Выпуск препарата планируется в виде 1 и 2% раствора для инъекций в ампулах объемом 1, 2 и 5 мл. Получены патенты Российской Федерации: патент РФ № 2322977 «Синтетическое анальгетическое средство и способ лечения на основе этого средства», приоритет от 01.08.2006, авторы: Крылов Б.В., Лопатина Е.В; патент РФ № 2367432 «Анальгстичсское средство и способ лечения болевого синдрома различной этиологии с помощью этого средства», приоритет от 27.09.2007, авторы Крылов Б.В., Лопатина Е.В.; патент РФ № 2362554 «Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства», приоритет от 27.09.2007, авторы: Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Крылов Б.В.
Основные положения диссертации используются в научно-
исследовательской работе научно-исследовательского отдела
экспериментальной физиологии и фармакологии ФГУ «ФЦСКИЭ им. В. А.
Алмазова», Института физиологии им И.П. Павлова РАН, экспериментальных
исследованиях отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПбНИИФ», научно-
клинической работе Института Мозга человека РАН, педагогической работе
кафедры общей физиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.
Под руководством д.х.н. И.Н. Домнина налажен промышленный синтез коменовой кислоты на базе ФГУП «СКТБ» «Технолог». Лабораторный регламент изготовления готовой лекарственной формы препарата адаптирован
к промышленным условиям. Экспериментальные партии препарата «Аноцептин» произведены на базе НИИ ОЧБ и ООО «НТФФ» «Полисам».
Апробация работы. Результаты работы доложены на: конгрессе ассоциации кардиологов стран СНГ «Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии», СПб, 18-20 сентября 2003 г.; Научно-практической конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 10-11 декабря
-
и 3-4 декабря 2007 г.; III Всероссийской с международным участием Школе-конференции по физиологии кровообращения, Москва. 27-30 января
-
г.; Международной конференции «Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине (к 100-летнему юбилею присуждения Нобелевской премии академику И.П.Павлову)», Минск, 15-16 июня 2004 г.; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург. 20-24 сентября
2004 г.; Конференции "Современные возможности диагностики и лечения
витрео-ретинальной патологии", Москва, 27 мая 2004 г.; Международной
конференции «Клеточные технологии в офтальмологии», Москва, 16-17 марта
2005 г.; Humboldt-Kolleg Conference «Technologies of the 21st Century: Biological,
Physical, Informational and Social Aspects», SPb, September 27-29 2005 г.; I съезде
физиологов СНГ, Сочи, 19-23 сентября 2005 г.; Международной научно-
практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких
технологий в промышленности» [Высокие технологии, фундаментальные и
прикладные исследования, образование], СПб, 7-9 февраля 2006 г.; V
Международной конференции по функциональной нейроморфологии
(Колосовские чтения - 2006), СПб. 2006 г.; на XX Съезде Физиологического
общества им И.П. Павлова, Москва, 4-8 июня, 2007 г.; Всероссийском
симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы
адаптации» (Посвящается памяти проф. А.А. Филаретова), СПб, 3-5 октября,
2007 г.; Конференции «Нейрохимические механизмы формирования
адаптивных и патологических состояний мозга», СПб. 10-12 сентября, 2008 г.;
Всероссийском симпозиуме по фармакологии «Результаты фундаментальных и
прикладных исследований для создания новых лекарственных средств.
Фундаментальные науки новым лекарствам», Москва, 9-11 июня 2008 г.; The
2nd St.-Petersburg Humboldt-Kolleg Conference «Technologies of the 21st Century:
Biological, Physical, Informational and Social Aspects», SPb. October 7-9, 2008; II
съезде физиологов СНГ, Кишинев, 29-31 октября, 2008 г.; международной
конференции «Висцеральные системы», СПб, 29 сенгября-2 октября 2009 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ в отечественной и зарубежной печати и три патента РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 'Mb страницах машинописного текста, иллюстрирована Цт рисунками, содержит чЬ таблиц. Работа построена по стандартному плану и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы, результаты исследований, обсуждение результатов. . выводы и список литературы, включающий нЦ отечественных и J зарубежных источников.
