Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. №,К-аденозинтрифосфатаза (АТФаза): свойства, молекулярная организациям функционирование 15
1.2. Ингибиторы Ыа,К-АТФазы и эндогенная регуляция активности №,К-АТФазы 20
1.3. Na,K-АТФаза как рецептор для эндогенного дигоксиноподобного фактора (ЭДФ) 22
1.4. Открытие и основные этапы изучения дигоксино подобного фактора. Натрийуретический гормон 22
1.5. Эндогенный дигоксиноподобный фактор 26
1.6. Изменение концентрации ЭДФ в плаз,ме крови при различных патологических состояниях 27
1.7. ЭДФ, Na,K-АТФаза при острой ишемии миокарда 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования 34
Клиническая характеристика исследованных больных
2.1.1. Больные острым инфарктом миокарда 36
2.1.2. Больные с нестабильной стенокардией 38
2.1.3. Больные с пароксизмальными нарушениями ритма и проводимости сердца 40
2.1.4. Характеристика контрольной группы (здоровых людей) 41
Методики исследования
2.1.5. Исследование эритрограммы 41
2.1.6. Определение активности №,К АТФазы в мембране цельных эритроцитов 42
2.1.7. Расчёт активности №,К-АТФазы в цельных эритроцитах 43
2.1.8. Построение калибровочной кривой для неорганического фосфата 44
2.1.9. Использование детергентов при определени активности №,К-АТФазы в цельных эритроцитах 45
2.2.0. Метод "функциональной нагрузки на ИаД-АТФазу 46
2.2.1. Определение концентрации неорганичекого фосфата 47
2.2.2. Обработка результатов 48
2.2.3. Использованные реактивы 48
ГЛАВА 3. Результаты исследований
3.1. Активность Na,K-ATOa3bi цельных эритроцитов у здоровых лиц ( контрольная группа ) 49
3.2. Активность Ыа,К-АТФазы цельных эритроцитов у больных острым инфарктом миокарда
в первые сутки заболевания 49
3.3. Активность №,К-АТФазы цельных эритроцитов у больных острым инфарктом иокарда в динамике заболевания 58
3.4. Результаты исследования активности Ыа,К-АТФазы при различной концентрации магния в инкубацион ной среде у больных ОИМ 62
3.5 Активность №,К-АТФазы у больных ишемической болезнью сердца, нестабильной
стенокадией 1-2 класса тяжести 66
3.6. Активность ИаД-АТФазы цельных эритроцитов у больных с пароксизмальными нарушениями ритма и проводимости сердца 67
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 70
Выводы 82
Практические рекомендации 83
Список литературы
- Na,K-АТФаза как рецептор для эндогенного дигоксиноподобного фактора (ЭДФ) 22
- Больные с нестабильной стенокардией
- Построение калибровочной кривой для неорганического фосфата
- Активность №,К-АТФазы цельных эритроцитов у больных острым инфарктом иокарда в динамике заболевания
Na,K-АТФаза как рецептор для эндогенного дигоксиноподобного фактора (ЭДФ) 22
В 1957 году J.C. Scou, работая на нервных волокнах краба, убедительно продемонстрировал, что магний-зависимая Na,K-АТФаза может использовать энергию, вырабатываемую при гидролизе АТФ, и тратить её на перенос ионов через клеточную мембрану.
Было установлено, что концентрация одновалентных катионов натрия и калия внутри и снаружи клеток различаются. Концентрация натрия во внеклеточном пространстве значительно выше, чем в клетке, а концентрация калия — высока в клетке и значительно ниже во внеклеточном пространстве. Как показал J.C.Scou, причина этого заключается в наличии в мембране клетки фермента, гидролизующего аденозинтрифосфорную кислоту (АТФ) и использующего эту универсалыгую для живого организма энергию на переноса ионов против электрохимического градиента.
При этом гидролиз АТФ происходит только в присутствии ионов натрия, калия и магния. Scou J.C. показал, что ионы Na+ увеличивают активность фермента в присутствии Mg24", а ионы К+ в присутствии Na+ и Mg2+.
Впервые была установлена зависимость между активностью Na,K-АТФазы и работой Na-насоса, т.к. специфический ингибитор Na-насоса ингибировал одновременно транспорт ионов и активность Ыа,К-АТФазы. Важность №,К-АТФазы для клетки заключается в поддержании ионного гомеостаза, обеспечивающего ионный градиент по обе стороны мембраны. №,К-АТФаза выступает в виде движущей силы в процессах возбуждения (натриевый насос) или вторично-активного транспорта и может
регулировать состояние воды в цитоплазме, что обеспечивается меньшей гидрофобностью Na+ по сравнению с К+. Функции основных ионов в клетке достаточно разнообразны. Ионы натрия регулируют осмотический гомеостаз организма, участвуют в поддержании кислотно-щелочного равновесия, стабилизируют структуру макромолекул и многие другие функции клетки. Ионы калия участвуют в регуляции процессов возбуждения. Натриевый насос (молекулярной формой которогао является Ыа,К-АТФаза) контролирует многие функции клетки: объём клетки, теплообмен, мембранный потенциал, рН клеточной среды, концентрацию свободного Са2+. В связи с этой функцией работа насоса строго регулируется концентрацией одновалентных ионов, АТФ и наличием эндогенных ингибиторов.
В результате многолетних исследований (Болдырев А.А., 1981; Болдырев А.А., Свинухова И.А., 1986; Albers 1967, 1976; Skou 1957, 1993) было установлено следующее: 1. Транспорт Na+ и К в процессе гидролиза АТФ тесно взаимосвязан (ни один из этих процессов не может осуществляться без другого). 2. Транспорт и гидролиз АТФ происходит лишь в том случае, если ионы Na+ и АТФ присутствуют на вігутренней поверхности мембраны, а ионы К+ - с её наружной стороны. Это условие важно и в опытах in vivo и in vitro. 3. Уабаин (строфантин Е) - ингибирует Ыа,К-АТФазу только с наружной стороны мембраны, где и расположены рецепторы для него и для сердечных гликозидов. 3. При гидролизе каждой молекулы АТФ три иона натрия выкачиваются наружу, а два иона калия закачиваются внутрь клетки, одна молекула фермента может гидролизовать 100 молекул АТФ в секунду.
Дальнейшие исследования определили структурную организацию этого фермента, его кинетику и свойства. №,К-АТФаза относится к АТФазам Ei и Ег типа, т.е. к ферментам, которые затрачивают энергию АТФ на осуществление конформационных превращений, конечным результатом которых является перенос ионов через мембрану. Первая схема, описывающая гидролиз АТФ ферментом, ранее была предложена (Olbers, Post, 1978), она в дальнейшем была уточнена другими исследователями (рис. 1). Рис. 1 Схема реакционного цикла Ыа,К-АТФазы (Glynn, 1985; Repke, 1986). ADP Mg2 К E_ATP E ATP— Еі Р—ЛГ"Р— E + Pr Na+ + Mg 1 3 Согласно этой модели, фермент может существовать в двух конформационных состояниях - Ei и Ег, которым соответствует пара фосфоферментов ЕрР и Е2-Р. Фосфорилированный фермент (киназная активность-1 стадия) требует присутствия Na и Mg . Кроме того, Mg2+ необходим и на 3-стадин ионзависимого підролиза АТФ (транслоказная стадия-3). На этой стадии фермент претерпевает копформационные изменения, что и обеспечивает перенос связанных с ним ионов Na+ через мембраігу.
Добавление ионов К+ вызывает дефосфорилирование фермента с высвобождением неорганического фосфата (4 стадия), в ходе которой К+ - связывающие центры оказываются обращенными внутрь клетки, а фермент возвращается в своё исходное конформационное состояние.
Как фосфатазная, так и фосфокиназная стадии реакции протекают на внутренней стороне мембраны.
Предложены и другие схемы. Существенным моментом каждой них является представление, что гидролиз АТФ, осуществляемый ферментом, трансформирует свободную энергию фосфорноэфирной связи в энергию конформационного напряжения молекулы, которая в свою очередь используется для трансмембранного переноса ионов.
Поэтому все схемы реакции гидролиза АТФ предусматривают нахождение ферментов в 2-х конформационных состояниях -"напряжённом" (Т-конформация) и "релаксированным" (Р-конформация).
Больные с нестабильной стенокардией
В группу больных с нарушениями ритма и проводимости сердца, не связанными с ОИМ, вошли 15 больных. В данную группу вошли 9 мужчин и 6 женщин в возрасте от 20 до 81 года (средний возраст 54,3± 19,0). Больные с пароксизмальными нарушениями ритма сердца, развившимися на догоспитальном этапе на фоне сердечной патологии различного генеза. Терапия проводилась врачом специализированной
кардиологической бригады (СКБ) как медикаментозно, так и путём проведения электрокардиоверсии (трое больных). В эту группу были отобраны больные, у которых не было ЭКГ признаков ишемического повреждения миокарда, пароксизмы не сопровождались ангинозными болями, они не относились к нестабильной стенокардии класса А.
Материал для определения активности №,К-АТФазы у данных больных брался сразу после купирования приступа. Больные по характеру нарушений ритма сердца и патологии, на фоне которой развились эти нарушения распределились следующим образом: 1) У 6 больных возникли пароксизмы мерцательной аритмии, у 5 из них приступы возникли на фоне постинфарктного кардиосклероза, у одного больного диагностирован пролапс митрального клапана; 2) У 2 больных с митральным пороком сердца ревматической этиологии возникли пароксизмы суправентрикулярной тахикардии; 3) У 2 больных пароксизмы суправентрикулярной реципрокной A-V тахикардии связаны с WPW синдромом; 4) У 2 больных с постинфарктным кардиосклерозом возникли пароксизмы желудочковой тахикардии; 6) у 3 больных с постинфарктным кардиосклерозом развилась А-V блокада 3 степени, у 2 из них проводилась временная эндокардиальная стимуляция, после коррекции ритма сердца эти больные госпитализированы в стационар.
В контрольную группу были включены 16 человек в возрасте от 20 до 43 лет - 5 мужчин и 11 женщин (средний возраст 31,5±3,2).
Методики исследования В связи с тем, что активность Ыа,К-АТФазы цельных эритроцитов, возможно, коррелирует с возрастом клеток, необходимо было знать популяцию эритроцитов поэтому у всех исследуемых определялась кислотная эритрограмма. Кислотоустойчивость мембран цельных эритроцитов определяли по методу, предложенному И.И. Гительзоном и И. А. Терсковым (1959). Запись интегральных кривых кислотного гемолиза эритроцитов в 0,004 М растворе НС1 проводили на фотоколориметре (КФК-2) После дифференцирования интегральных кривых результаты качественного состава эритроцитов представляли в виде эритрограмм. Определение вели следующим образом: устанавливали на ФЭК кювету с контрольным раствором (физиологический раствор), вторую кювету с "рабочим раствором" (физиологический раствор + кровь) устанавливали напротив контрольного образца, длина волны 750 нм. Контрольный раствор "выводили на ноль".Путём разведения рабочего раствора физиологическим раствором доводили показатель экстинкции раствора до (0,7). Затем из полученной пробы брали 1 мл раствора и добавляли такое же количество гемолитика (0,004 НС1 на 0,85% физиологическом растворе). При добавлении гемолитика и перемешивании пробы включали секундометр, показания экстинции фиксировали через каждые 30 секунд.
Определение активности Na,K-ATOa3bi в мембране цельных эритроцитов Для выявления максимальной активности фермента в цельных эритроцитах проводили преинкубацию клеток в 1% растворе детергента твин-20 по методу А.М.Казёшюва и соавт. (1984). Отмытые эритроциты смешивали с равным объёмом 1% раствора твин-20, приготовленным на 0,25 М растворе сахарозы в 0,02 М трис- НС1 буфере (рН-7,4 при 25 С), смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 40 минут. Далее суспензию эритроцитов разводили раствором сахарозы в 0,02 М трис НС1 буфере (рН 7,4) в 2,5 раза (конечное разведение в 5 раз). Полученную суспензию эритроцитов в количестве 0.1 мл помещали в пробирку, содержащую 0,3 мл. инкубационной смеси следующего состава: (в мМ): NaCl-100; КС 1-Ю; трис-НС1 (рН-7,6 при t-37 С)-50; АТФ.2 Na; MgCl-З; ЭДТА-0,5.
Инкубацию эритроцитов проводили при 37 С в течение 40 минут на водном термостате U-10 в присутствии и отсутствии 0,5 мМ уабаина. Реакцию останавливали добавлением 0,2 мл охлаждённой (4 С) 20 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ).
Активность АТФазы определяли по приросту неорганического фосфата (Фн), по разнице между АТФазной активностью в присутствии и отсутствии уабаина. Активность АТФазы выражали в мкмоль Фн./час на 1 мл упакованных клеток цельных эритроцитов. Гематокрит упакованных эритроцитов определяли после последней промывки крови раствором 0,145 М NaCl в 0,02 М трис НС1 буфере (рН-7,6). Для этого эритроциты помещали в стекляные капилляры и центрифугировали на микроцентрифуге ТН-12 в течение 7 минут при 12000 g.
Построение калибровочной кривой для неорганического фосфата
Добавление антител к дигоксину в инкубационную среду значительно снижало способность безбелковых супернатантов плазмы крови к угнетению №,К-АТФазы, снижало возможность развития опасных нарушений ритма сердца (Фёдорова О.В., 1992).
Практическое применение таких методов, как определение общей ЛДГ (включая изоформы), ACT в качестве биомаркёров ОИМ в настоящее время не рекомендуются вследствие их низкой специфичности (The Joint European Sosiety, 2000).
Время от начала заболевания ОИМ и время, когда наблюдается повышение уровня этих ферментов в периферической крови, значительно различаются, в зависимости от сроков начала заболевания. Для распознавания острого ищемнческого повреждения миокарда необходимо использовать определение соответствующего фермента в соответствующие сроки (Сыркин А.Л.,2003).
В соответствии с рекомендацией Всемирной Организации Здравоохранения (WHO, 1979), диагноз острого инфаркта миокарда основывается на: 1) появлении ишемического типа боли в грудной клетке; 2) типичных изменений на ЭКГ (подъём сегмента ST и/или патологический зубец Q не менее, чем в двух отведениях кроме Vi и aVR; 3) повышении уровня биохимических маркёров ишемического повреждения (некроза) миокарда в периферической крови с их последующей нормализацией.
Типичная боль в грудной клетке возникает у 70 - 80% больных с ОИМ. Подъём сегмента ST и/или появление патологических зубцов Q высокоспецифично для ОИМ, но у части больных ОИМ такие изменения на ЭКГ, которые затрудняют трактовку признаков инфаркта миокарда ( наличие острых или хронических внутрижелудочковых блокад, наличие хронической аневризмы сердца, имплантированный искусственный водитель ритма сердца и т. д.), поэтому биохимические маркёры острого ишемического повреждения (некроза) миокарда для многих больных могут быть решающими в установлении правильного диагноза, особенно в первые часы заболевания.
Одним из таких методов при диагностике ОИМ, как уже указывалось ранее, может быть определение активности Na,K-АТФазы.
В условиях ишемии происходят изменения в миокардиальной клетке: увеличивается проницаемость мембраны миокарда, происходит нарушение ряда метаболических процессов в кардномиоцитах, лишённых поступления кцслорода. Раньше всего нарушаются функции специфических мембранных "насосов", таких как №,К-АТФаза. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, то наступление необратимых изменений коррелирует с появлением обширных дефектов в мембране клетки, при которых изменяется её проницаемость для поливалентных ионов и происходит дезорганизация фосфолипидов (Burton К.Р., 1981; Chien K.R. et al. 1981). Как известно, Na,K-ATOa3a - мембрановстроеииый фермент. Нарушение функции мембраны приводит к: а) изменению потоков ионов натрия, калия, кальция, б) превышению поступления ионов кальция в клетки над их выведением, можно трактовать как компенсаторную функцию миокарда в ответ на снижение контрактилыюй способности миокарда.
Как следствие острого ишемического повреждения миокарда было важно определить активность Иа,К-АТФазы при этом состоянии.
Что касается специфичности определения этого фермента при диагностике ОИМ, то снижение активности Ыа,К-АТФазы наблюдалось, как указывалось ранее, и при другой патологии, поэтому критерием отбора наблюдавшихся нами больных ОИМ, являлось отсутствие таких состояний ( высокая, устойчивая артериальная пшертензия, хроническая недостаточность кровообращения, почечная, печёночная недостаточность). Как уже говорилось, ионы магния необходимы для работы АТФаз, в том числе и №,К-АТФазы. Для проведения дифференциальной диагностики ОИМ с другими формами острого коронарного синдрома и другими патологическими состояниями только определение активности №,К-АТФазы цельных эритроцитов в стандртных условиях недостаточно, поэтому необходимо было применить более специфические методы исследования.
По существу, исследование магний-зависимых свойств Na,K-АТФазы является, как бы "функциональной нагрузкой "in vitro" на фермент (определение свойств фермента производится в нормальной и изменённой среде при различных концентрациях магния).
Исследования во всех группах проводились с нагрузкой магнием (в концентрации ЗмМ, 6 мМ, 12 мМ в инкубационной среде).
Характер кривой у больных ОИМ при различных концентрациях магния в инкубационной среде достаточно специфичен и характер езуется отсутствием чувтствительности фермента к высоким концентрациям магния (уплощение кривой). Нами были получены результаты исследований активности Na,K-АТФазы цельных эритроцитов с нагрузкой магнием у больных ОИМ, не осложненным кардиогенным шоком, в первые сутки заболевания, сходные с предыдущими исследованиями.
Активность №,К-АТФазы цельных эритроцитов у больных острым инфарктом иокарда в динамике заболевания
Различные ткани человека и животных содержат вещества, обладающие натрийуретической активностью, способностью ингибировать №,К-АТФазу, а также иммунореактивностыо, сходной с таковой с препаратами дигиталиса. В настоящее время, идентифицировано несколько ЭДФ - эндогенный уабаин (Hamlin, Manuntaa, 1992), маринобуфагенин (АЛ.Багров, 1997) и, кроме того, обнаружено существование различных изоформ Ка,К-АТФазы (Eadnee, 1995; Blaco et al.,1998). Для инфаркта миокарда характерно появление в крови и маринобуфагенина, являющегося также ингибитором натриевого насоса - Ыа,К-АТФазы. Концентрация ЭДФ в крови значительно повышается в первые сутки развития ОИМ и уже на вторые сутки заболевания концентрация ЭДФ в плазме крови снижается до контрольных цифр, а в течение последующих 2-х недель существенно не изменяется (Багров АЛ., 1998).
Большинство исследователей считают, что местом образования ЭДФ являются надпочечники, гипоталамическая область. Значительное повышение уровня ЭДФ в крови больных ОИМ с первых суток заболевания связано, скорее всего, со снижением контрактилыюй способности миокарда, вследтвие выключения части инфарцированного миокарда. Измененяются трансмембранные потоки ионов миокардиальных клеток. Изменение активности Ка,К-АТФазы при ОИМ связано именно с присутствием в плазме крови больных гуморального ингибитора (ов) этого фермента т.е. ЭДФ. Отсутствие изменений активности Ма,К-АТФазы в мембранных препаратах эритроцитов больных ОИМ, отмытых от вне- и внутриклеточного содержимого позволяет считать, что в плазме крови больных ОИМ, действительно присутствуют факторы , ингибирующие фермент. При остром инфаркте миокарда происходит также целый ряд разнообразных метаболических изменений — нарушение обмена фосфолипидов в миокарде (Berohn et al.,1982; Schwartz et al., 1987, образрвание активных форм кислорода и стимуляция перекисного окисления ( Демуров, Игнатова, 1985; Stam, 1985).
Эти изменения, в свою очередь, тоже могут оказывать ингибирующее действие на активность №,К-АТФазы.
В предыдущих исследованиях не было выявлено корреляции между уровнем дигоксиноподобной реактивности плазмы крови и активностью Иа,К-АТФазы цельных эритроцитов. Наиболее вероятной причиной подобной дисроциации может являться гетерогенность циркулирующих ингибиторов Ка,К-АТФазы (Фёдорова О.В., 1992).
Существенную роль в ишемическом повреждении миокардиалыюй клетки в комплексе патологических изменений играют свободные радикалы. Свободные радикалы - атомы или группы химически связанных атомов, обладающие свободными валентностями, что определяет их высокую химическую активность. Накопление, например, промежуточных продуктов свободпорадикального окисления липидов, приводит к изменению свойств липидного слоя биологических мембран, снижению их гидрофобности, увеличению проницаемости для ионов. Наиболее чувствительны в отношении свободных радикалов SH-группы ферментов биологических мембран, окисление которых приводит к увеличению проницаемости мембран для катионов и анионов. Конечные продукты свободпорадикального окисления 77 альдегиды, кетоны, альдо- и кетокислоты вызывают увеличение проницаемости липидного слоя для протонов, приводящее к разобщению окислительного фосфорилирования (тканевого дыхания в митохондриях). Эти продукты свободнорадикального окисления увеличивают поверхностный (отрицательный) потенциал мембран, снижают электрическую стабильность липидного бислоя. Эти и другие явления лежат в основе цитотоксического действия свободных радикалов и продуктов свободнорадикального окисления, которые в высоких концентрациях вызывают гибель клеток.
Определение активности Ыа,К-АТФазы у больных ОИМ с "функциональной нагрузкой" "in vitro" на фермент является очень чувствительным тестом на острое ишрмическое повреждение миокарда, и, как уже говорилось ранее, обнаружен достаточно характерный вид кривой активности Ыа,К-АТФазы при различных концентрациях магния в инкубационной среде. Особенно перспективно использование этого метода, у больных острым инфарктом миокарда, в первые часы заболевания, когда поверхностная ЭКГ затруднена для диагностики ОИМ.
Постепенное же восстановление активности Na,K-ATOa3bi цельных эритроцитов у больных ОИМ скорее всего связано с постепенным исчезновением из сосудистого русла эритроцтов, связанных с ЭДФ. У больных с нестабильной стенокардией 1 — 2 функциональных классов тяжести по нашим наблюдениям активность Ыа,К-АТФазы цельных эритроцитов и характер кривой при различных концентрациях магния в инкубационной среде не отличались от таковых у здоровых (контрольная группа). Между тем, согласно литературным данным, у больных с нестабильной стенокардией 3 функционального класса тяжести наблюдается некоторое снижение активности Ыа,К-АТФазы. Отсутствие изменений дигоксиноподобной иммунореактивности в плазме крови больных с нестабильной стенокардией 1-2 функционального класса тяжести а, следовательно, и отсутствие снижения активности Ка,К-АТФазы позволяет высказать предположение, что повышение уровня ЭДФ в плазме крови у больных ОИМ было скорее всего связано с уменьшением сердечного выброса и возможно, со стрессорной реакцией, когда в ответ на развитие ОИМ запускается в действие система гипоталамус - гипофиз — надпочечники. Снижение активности №,К-АТФазы при стрессе впервые было установлено Масловой М.Н. и сотр.,(1992).
В конце 80-х годов в крови больных острым инфарктом миокарда обнаружены белки - тропонины, которые специфичны для миокарда. Тропонины (I, Т, С) являются компонентами контрактилыюго аппарата мышечных клеток и в составе тропошш -тропомиозинового комплекса связанного с актином, образуют тонкие миофиламенты саркомеров.
Кардиальная изоформа Тн-I отличается от мышечных изоформ весьма существенно: 40 % её аминокислотной последовательности специфичны для миокардиальной изоформы. Тн-I, выявляется в крови у больных ОИМ через 4-5 часов от начала заболевания, пик концентрации приходится на 10-24 час болезни, затем концентрация его в крови падает (Смирнов Г.Б., 1999).
Диагностическая ценность любого биомаркёра определяется соотношенм 2-х характеристик — показателей чувстствителыюсти и специфичности. В качестве сравнительной характеристики биомаркёров, примняемых в настоящее время при диагностике ОИМ можно привести следующие таблицы:
