Введение к работе
Актуальность исследования. Никотиновые холинорецепторы (н-ХР) опосредуют в организме самые разнообразные эффекты нейромедиатора ацетилхолина (АХ). В ЦНС эти рецепторы участвуют во многих физиологических и поведенческих функциях (когнитивные процессы, память и обучение, нейрональное развитие, мозговой кровоток и метаболизм, формирование никотиновой зависимости и др.) (Jones et al., 1999; Paterson, Nordberg, 2000). В скелетной мышце н-ХР опосредуют синаптическую передачу сигнала от двигательного нерва к мышце.
Одним из физиологически активных компонентов табака является алкалоид никотин -специфический экзогенный лиганд н-ХР. Поскольку н-ХР регулируют нейрональную активность в структурах мозга, относящихся к системе естественного подкрепления, которая ответственна за формирование зависимости не только к никотину, но и к другим наркотикам (кокаин, амфетамин, морфин и др.) (Pierce et al., 2006), основное внимание исследователей во всем мире сосредоточено на роли никотина именно в ЦНС. Что касается скелетной мускулатуры, содержащей большой пул н-ХР, - потенциальных мишеней циркулирующего никотина, то имеются лишь единичные работы о влиянии хронической никотинизации на скелетные мышцы (Larsson et al., 1988; Price et al., 2003). Концентрация циркулирующего никотина при курении табака составляет порядка ста наномолей (Lester, Dani, 1995; Benowitz et al., 1997; Dani, De Biasi, 2001). He известно, вызывает ли этот никотин какие-то изменения на уровне молекулярно-клеточных процессов, обеспечивающих электрогенез, возбудимость, сократимость и работоспособность скелетной мышцы. В частности, нет данных о влиянии наномолярных концентраций никотина на критически важный для функционирования скелетной мышцы фермент - №,К-АТФазу, хотя известно о возможности холинергической модуляции этого белка (Кривой и др., 2004; 2006; Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994; Henning et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996; Wang et al., 1994; Krivoi et al., 2006).
Na,K-AT<2>a3a поддерживает трансмембранные градиенты Na+ и K+ за счет активного транспорта этих ионов, что обеспечивает мембранный потенциал и возбудимость, а также ряд других важных транспортных механизмов клетки. Каталитическая а-субъединица Na,K-АТФазы экспрессируется в виде четырех изоформ (al - сс4). По ряду данных основную насосную функцию в клетке выполняет изоформа al, тогда как прочие являются регуляторными (Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001; Mijatovic et al. 2007). В возбудимых клетках экспрессируются al-, a2- и аЗ-изоформы №,К-АТФазы, в скелетных мышечных волокнах - al- и а2-изоформы (Lavoie et al., 1997; McDonough et al., 2002).
4 Имеются данные о негативном хроническом влиянии никотина на экспрессию а2-
изоформы Na.K-АТФазы в мозге крысы (Wang et al., 1994). Множество данных
свидетельствуют о влиянии холиномиметиков на активность и индукцию №,К-АТФазы в
зрелой скелетной мышце и в культуре скелетных мышечных клеток (Vyskocil et al., 1983;
Henning et al., 1994; Nikolsky et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996). Установлено, что AX в
наномолярном диапазоне концентраций активирует ІЧаД-АТФазу, вызывая
гиперполяризацию скелетных мышечных волокон (Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994),
причем за счет увеличения электрогенной активности ее а2-изоформы (Кривой и др., 2006;
Krivoi et al., 2006). Показано, что гиперполяризацию мышечных волокон вызывает и никотин
в концентрации 100 нмоль/л (Krivoi et al., 2006), однако, как влияет при этом никотин на
электрогенную активность №,К-АТФазы и ее изоформ неизвестно.
В целом, в данный момент вопрос об остром и хроническом влиянии никотина в наномолярных концентрациях, сопоставимых с уровнем циркулирующего никотина у курильщиков табака, на №,К-АТФазу и ее изоформы в скелетной мышце, а также электрогенез и работоспособность скелетной мускулатуры не изучен.
Цель работы: исследование влияния никотина в наномолярном диапазоне концентраций на электрогенную активность изоформ Na.K-АТФазы и электрогенез скелетной мышцы.
Задачи исследования:
Провести анализ гиперполяризующего эффекта никотина в скелетной мышце крысы, включающий изучение действия специфических блокаторов №,К-АТФазы, динамики развития эффекта и роли ионных токов через каналы н-ХР в его реализации.
Используя фармакологический подход с применением специфического блокатора Na.K-АТФазы уабаина сравнить влияние острого и хронического действия никотина в наномолярном диапазоне концентраций на электрогенные вклады уабаин-чувствительной (а2) и уабаин-резистентной (al) изоформ Na.K-АТФазы.
3) Провести сравнительный анализ хронического действия никотина в
микромолярной концентрации при его локальной аппликации к мышце с помощью
силиконовых имплантантов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Никотин (100 нмоль/л) при остром действии вызывает гиперполяризацию мышечных
волокон скелетной мышцы крысы величиной около 4 мВ за счет селективного
увеличения электрогенного вклада а2-изоформы №,К-АТФазы. Ионные токи через
каналы н-ХР не являются фактором развития гиперполяризации, вызываемой никотином.
2. Локальная доставка никотина с помощью силиконовых имплантантов в течение 3-х суток
приводит к деполяризации скелетных мышечных волокон, что подтверждает возможность хронических изменений в скелетной мышце при длительном воздействии на нее никотина.
3. Хроническое введение никотина крысам в течение 3 - 4.5 недель с помощью питьевой
воды приводит к деполяризации мышечных волокон скелетной мышцы за счет
существенного снижения электрогенного вклада al-изоформы №,К-АТФазы при
незначительном увеличении вклада а2-изоформы.
Научная новизна. Впервые установлено, что никотин, добавляемый в раствор в концентрации 100 нмоль/л, вызывает гиперполяризацию мышечных волокон изолированной скелетной мышцы крысы. Установлено, что причиной гиперполяризации является селективное увеличение электрогенной активности уабаин-чувствительной а2-изоформы ИаД-АТФазы без изменения электрогенной активности уабаин-резистентной al-изоформы. Показано, что проадифен - неконкурентный блокатор открытого ионного канала н-ХР, не влияет на величину гиперполяризации, вызываемой 100 нмоль/л никотина, что свидетельствует о развитии этого эффекта и в условиях блокады ионных токов через каналы н-ХР. Установлено, что вызываемое никотином увеличение электрогенного вклада Na,K-АТФазы не является следствием изменения входного сопротивления мембраны мышечных волокон. Впервые использован метод локальной доставки никотина к скелетной мышце с применением нетоксичных силиконовых имплантантов, содержащих никотин. Установлено, что никотин в микромолярном диапазоне концентраций при локальной доставке к камбаловидной мышце крысы в течение 3-х суток вызывает долговременную деполяризацию мышечных волокон. Впервые в условиях моделирования формирования никотиновой зависимости у крыс, хронически (в течение 3 - 4.5 недель) получавших никотин с питьевой водой, обнаружено снижение мембранного потенциала покоя (МПП) волокон диафрагмальной мышцы преимущественно за счет уменьшения электрогенного вклада al-изоформы Ка,К-АТФазы, при незначительном увеличении электрогенного вклада а2-изоформы.
Практическая значимость работы.
Полученные данные свидетельствуют об изоформ-специфическом участии Na,K-АТФазы в регуляции электрогенеза скелетной мышцы крысы никотином в наномолярном диапазоне концентраций, что раскрывает новый механизм модуляции скелетной мускулатуры циркулирующими холинергическими лигандами. Эти знания важны для более глубокого понимания механизмов побочных эффектов применяемых в клинике антихолинэстеразных препаратов (используемых как стимуляторы памяти, при лечении
ряда нейродегенеративных расстройств, миастении и др.), для выявления новых механизмов никотиновой интоксикации при табакокурении.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Российской медико-биологической конференции "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской школе "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 2005); PENS Summer Course "Contemporary problems of Neurobiology: Molecular mechanisms of synaptic plasticity" (Kazan, Russia, 2007); 3rd HBGS Student Council Symposium "Cell Structure and Organelles" (Helsinki, Finland, 2008); International Symposium "Biological Motility: Basic Research and Practice" (Pushchino, Russia, 2008); 12* International ATPase Conference "Na,K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Mechanisms, and Roles in Health and Disease" (Arhus, Denmark, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 4 статьи в рецензируемых изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 118 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 172 источника, из которых 25 отечественных и 147 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 3 таблицами.
