Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Функциональная роль и регуляция №+,К+-АТФазы 10
1.2. Изоформы субъединиц Na+,K+-АТФазы 15
1.3. Изоформы а-субъединицы и эндогенные ингибиторы На+,К+-АТФазы..19
1.4. №+,К+-АТФаза и ее изоформы в скелетных мышцах 21
1.5. Холинергическая регуляция Na+,K+-АТФазы в скелетной мышце 26
1.6. Никотиновый холинорецептор скелетной мышцы. связь с №+,К+-АТФазой 31
2. Обьекты и методы исследования
2.1. Электрофизиологические исследования 37
2.1.1. Характеристика экспериментального объекта 37
2.1.2. Характеристика экспериментальных условий 40
2.2. Оценка транспортной активности №+,К*-АТФазы 43
2.3. Оценка каталитической активности Na+,K+-АТФазы 45
2.4. Обработка результатов 45
2.5. Применяемые вещества 46
3. Результаты исследования
3.1. Роль изоформ а-субъединицы Na+,K+-АТФазы в электрогенезе мышечных волокон диафрагмы крысы 47
3.1.1. Вклад изоформ Na+,K+-АТФазы в мембранный потенциал покоя мышечных волокон 47
3.1.2. Параметры потенциалов действия мышечных волокон при блокаде а2 изоформы №*,К+-АТФазы 53
3.2. Роль изоформ а-субъединицы №+,К+-АТФазы в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина в диафрагме крысы 58
3.2.1. Гиперполяризующий эффект ацетилхолина и роль №+,К+-АТФазы 58
3.2.2. Роль al и a2 изоформ Na+,K+-АТФазы в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина 61
3.2.3. Влияние экстракта почек свиньи на гиперполяризующий эффект ацетилхолина 66
3.3. Роль никотинового холинорецептора в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина в диафрагме крысы 70
3.3.1. Оценка возможности прямого действия ацетилхолина наЫа+,К+-АТФазу 70
3.3.2. Гиперполяризующий эффект ацетилхолина в условиях ингибированияацетилхолинэстеразы 72
3.3.3. Зависимость доза - ответ для гиперполяризующего эффекта ацетилхолина 75
3.3.4. Роль никотинового холинорецептора в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина 77
4. Обсуждение результатов
4.1. Изоформы а-субъединицы Na+,K+-АТФазы и электрогенез скелетных мышечных волокон 81
4.2. Роль изоформ а-субъединицы Ыа\К-АТФазы в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина в диафрагме крысы 87
4.3. Роль никотинового холинорецептора в гиперполяризующем эффекте ацетилхолина в диафрагме крысы 91
5. Выводы 98
6. Список цитированной литературы 100
- Функциональная роль и регуляция №+,К+-АТФазы
- Характеристика экспериментального объекта
- Вклад изоформ Na+,K+-АТФазы в мембранный потенциал покоя мышечных волокон
- Изоформы а-субъединицы Na+,K+-АТФазы и электрогенез скелетных мышечных волокон
Введение к работе
Ф трансмембранных градиентов Na+ и К+ за счет активного транспорта этих
ионов. Эти градиенты обеспечивают необходимый уровень мембранного потенциала и возбудимость клеток, а также ряд других важных транспортных механизмов клетки. Таким образом, №+,К+-АТФаза является важнейшим регулятором клеточных функций, который обеспечивает способность
А возбудимых клеток воспринимать и передавать сигналы, а также
поддерживает ионный гомеостазис организма в целом (см. обзоры: Болдырев, 1985; 1998; Blaustein, 1993; Clausen, 1998; Sejersted, Sjogaard, 2000; Glitsch, 2001; Lichtstein, Rosen, 2001; Schoner, 2002).
№\К+-АТФаза представляет собой димер, состоящий из а- и р-субъединиц, в некоторых тканях включает также у-субъединицу. Субъединица а, содержащая места связывания с АТФ и ионами Na+ и К+, отвечает за каталитические и транспортные свойства №+,К+-АТФазы. Кроме того, а-субъединица содержит участок, являющийся специфическим рецептором для сердечных гликозидов. Для позвоночных в настоящее время известны четыре изоформы а-субъединицы Na+,K+-АТФазы (ctl - а4), каждая из которых кодируется собственным геном. Физиологическая роль изоформ №+,К+-АТФазы во многом остается неясной. По ряду данных основную насосную функцию в клетке выполняет изоформа ctl, тогда как прочие являются вспомогательными (регуляторными) (см. обзоры: Blanco,
* Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001).
В скелетных мышцах активность Ка+,К*-АТФазы является
принципиально важным фактором для поддержания сократительной
функции и работоспособности нервно-мышечного аппарата (Clausen, 1998,
Sejersted, Sjogaard, 2000). Установлено, что скелетные мышечные волокна
млекопитающих экспрессируют две изоформы (al и а2) а-субьединицы
Na+,K+-AT
щ (Lavoie et al., 1997; Thompson et al., 1999; He et al., 2001). Механизмы
регуляции данных изоформ и их роль в поддержании электрогенеза и
сократительных свойств скелетных мышечных волокон не выяснены, причем
исследовались лишь в опытах на мышцах эмбрионов (Radzyukevich et al.,
2004) и мутантных животных (Не et al., 2001). Эти работы в данном
Л направлении, по сути, являются единственными.
Хорошо известно, что ряд гормонов и медиаторов, в том числе ацетилхолин (АХ), способны регулировать Ыа+,К+-АТФазу (Елаев, 1980; Голиков и др., 1985; Begyun et al., 1996; Clausen, 1998; Glitsch, 2001; Gloor, 1997; Mathias et al., 2000). Это свойство AX имеет непосредственное отношение к классической проблеме немедиаторной, регуляторной функции медиаторов, сохраняющей свою актуальность и в настоящее время (Ухтомский, 1940; Гинецинский, Михельсон, 1937; Коштоянц, 1951; Беритов, 1959; Зефиров, 1967; Полетаев, 1974).
Влияние АХ и его миметиков на Ыа+,К+-АТФазу показано и в
* сердечной (Danilenko et al., 1990; 1991; Mathias et al., 2000), и в скелетной
мышцах (Платонова и др., 1986; Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al., 1983;
Henning et al., 1993; Nikolsky et al., 1994; Kragenbrink et al, 1996). В
частности, обнаружено, что в отличие от квантового АХ, деполяризующего
постсинаптическую мембрану, неквантовый АХ (присутствующий в
Щ синаптический щели в наномолярных концентрациях) вызывает
гиперполяризацию мембраны скелетных мышечных волокон за счет
7
активации электрогенного Na+,K+-Hacoca (Dlouha et al., 1979; Vyskocil et al.,
1983; Nikolsky et al., 1994). Этому эффекту неквантового AX придается
большое физиологическое значение как важному фактору нейронального
контроля электрогенеза скелетной мышцы (Волков, Полетаев, 1988; Vyskocil
et al., 1983; Nikolsky et al., 1994). Гиперполяризующим эффектом обладает и
экзогенный АХ в сходных концентрациях (см. обзор: Кривой, 2000). Однако
^ ни мишень АХ, ни тип изоформы Ыа+,К+-АТФазы в его гиперполяризующем
действии не были установлены.
Цель и основные задачи исследования: целью данной работы было
выявление роли al и a2 изоформ a-субъединицы №*,К+-АТФазы в
поддержании и холинергической регуляции электрогенеза зрелых скелетных
^ мышечных волокон нормальных (не мутантных) крыс.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Оценить вклад изоформ al и a2 в мембранный потенциал покоя
(МГШ) мышечных волокон диафрагмы крысы, а также роль изоформы а2 в
поддержании их электрогенеза.
т 2. Выявить участие Ыа+,К+-АТФазы в гиперполяризующем эффекте
наномолярных концентраций АХ в диафрагме крысы и определить тип изоформы ее a-субъединицы, вовлеченной в этот эффект.
3. Исследовать характеристики мишени АХ в его гиперполяризующем действии; проверить роль никотинового холинорецептора в качестве такой мишени.
Положения, выносимые на защиту:
1. Основную "насосную" функцию, обеспечивающую Ml 111 мышечных
волокон диафрагмы крысы в покое, выполняет al изоформа Ыа+,К+-АТФазы;
роль а2 изоформы в поддержании МПП относительно невелика, однако ее
активность важна для генерации нормальных мышечных потенциалов
действия (ПД).
Гиперполяризация мышечных волокон диафрагмы крысы при действии АХ в наномолярных концентрациях обусловлена существенным увеличением вклада а2 изоформы Na ,К*-АТФазы в величину Ml 111.
Холинергическая регуляция электрогенеза мышечных волокон диафрагмы крысы при участии а2 изоформы Na+,K+-ATOa3bi осуществляется за счет связывания АХ с никотиновым холинорецептором в
ф конформационном состоянии со сверхвысокой аффинностью к АХ.
Научная новизна работы. Впервые исследована роль al и a2 изоформ Ыа+,К>-АТФазы в поддержании электрогенеза мышечных волокон скелетной мышцы нормальных (не мутантных) взрослых крыс. Анализ зависимости МПП мышечных волокон диафрагмы крысы от концентрации
w специфического ингибитора Ыа*,К+-АТФазы оуабаина впервые показал, что
основной электрогенный вклад в МПП вносит изоформа al. Вклад а2 изоформы в МПП относительно невелик, однако ее селективная блокада оуабаином вызывает нарушения в механизме генерации мышечных ПД (снижение амплитуды и увеличение длительности). Установлено, что
^ гиперполяризующее действие наномолярных концентраций экзогенного АХ
в диафрагме крысы реализуется за счет существенного увеличения вклада в
МПП именно а2 изоформы Na+,K+-АТФазы (без влияния на изоформу al).
Применение агонистов и антагонистов никотинового холинорецептора, а
также анализ концентрационной зависимости для гиперполяризующего
эффекта АХ показал, что этот эффект реализуется при участии никотинового
холинорецептора в конформационном состоянии со сверхвысокой
аффинностью к АХ, предположительно, в состоянии десенситизации.
Впервые выдвинута гипотеза о том, что в скелетной мышце а2 изоформа
№+,К+-АТФазы выполняет регулирующую функцию и за счет
" функциональной связи с никотиновым холинорецептором участвует в
холинергическом контроле электрогенеза мышечных волокон.
9 Практическая значимость работы. Полученные данные раскрывают новый механизм регуляции скелетной мышцы циркулирующими эндогенными и экзогенными холинергическими лигандами и дигиталисоподобными ингибиторами Ыа+,К+-АТФазы. Эти знания важны также для понимания механизмов побочных эффектов применяемых в клинике сердечных гликозидов, холинопозитивных препаратов
Ф (применяемых как стимуляторы памяти, при лечении ряда
нейродегенеративных расстройств, миастении и др.), а также негативных последствий курения. Предлагаемый принцип регуляции за счет функциональной связи никотинового холинорецептора с №+,К+-АТФазой возможно действует и в ЦНС, где важнейшей функцией никотиновых
iv холинорецепторов является модуляция эффективности синаптических
связей.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конкурсах молодых ученых СПбГУ (1998, 2000), на заседаниях секции общей физиологии Санкт-Петербургского общества физиологов, биохимиков и
фармакологов им. И.М. Сеченова (2001, 2004), Всероссийских школах
"Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 1999, 2000, 2001),
Российской медико-биологической конференции "Человек и его здоровье"
(Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001), Международной междисциплинарной
конференции "Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы" (Санкт-
4* Петербург, 1998, 2000), конференции молодых ученых России с
международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2001), "32 Annual Meeting Society for NeuToscience", Orlando, Florida (2002), "10 International Conference on Na,K-ATPase and Related Cation Pumps", Elsinore, Denmark (2002), International Symposium
у "Biological Motility" dedicated to the memory of acad. G.M. Frank Pushchino,
Russia (2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы.
10 Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 116 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 источников, из которых 120 -иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и 2 таблицами.
Функциональная роль и регуляция №+,К+-АТФазы
Для млекопитающих в настоящее время известны четыре изоформы а-субъединицы (а1 - а4), три изоформы Р-субъединицы (pi - РЗ) и одна изоформа у-субъединицы Ыа+,К+-АТФазы, каждая из которых кодируется собственным геном. Существует множество доказательств того, что экспрессия разных изоформ №+,К+-АТФазы регулируется по-разному в зависимости от вида ткани, типа клетки, стадии развития организма, а также под действием определенных гормонов и, возможно, в зависимости от уровня клеточной активности (см. обзоры: Sweadner, 1995; Blanco, Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001).
Изоформы а-субъединицы несколько различаются количеством аминокислотных остатков (1021 - 1028), имеют высокую степень гомологии (более 90% для изоформ al - a3 и 78% для изоформы а4) (Blanco, Mercer, 1998). Изоформы а-субъединицы различаются по чувствительности к ионам Na+ и К+, АТФ, гормонам и физиологическим стимулам, а также к специфическому блокатору Ка+,К+-АТФазы оуабаину и другим сердечным гликозидам. Наибольшее различие в аффинности а-изоформ к оуабаину л наблюдается у грызунов: константа блокирования изоформы al составляет -10-100 мкмоль/л, тогда как для изоформ а2 - а4 эта константа на 2 - 4 порядка ниже. Изоформа al обнаружена практически во всех животных клетках. Клетки некоторых тканей (эритроциты, почки) экспрессируют только эту изоформу. В большинстве тканей клетки, помимо al, экспрессируют также одну из изоформ а2 - а4. Изоформа а2 обнаружена в скелетных, гладких и сердечной мышцах, в глиальных клетках и в некоторых нейронах; изоформа аЗ преобладает в нервной ткани. Изоформа а4 пока обнаружена только в семенниках и сперме (см. Blanco, Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Woo et al, 2000). Ряд данных позволяет предположить, что основную насосную функцию в клетке выполняет изоформа al, тогда как изоформы а2 - а4 являются вспомогательными (регуляторными) (см. обзоры: Blanco, Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001). Так, в сердечной мышце изоформа % а2 рассматривается как ключевой регулятор кальциевого баланса через систему Na+,Ca +-обмена (James et al, 1999; Mathias et al., 2000). В мозгу активация изоформы а2 глиальных клеток позволяет, по-видимому, эффективно устранять избыточный внеклеточный К+ (Blanco, Mercer, 1998). ,ц, Изоформа аЗ, вероятно, препятствует излишнему накоплению Na+ в тонких нервных окончаниях при частых разрядах нейронов и, предположительно, участвует в поддержании синаптического проведения в сердечной и скелетной мышце (Zahler et al., 1996; Blanco, Mercer, 1998). Физиологическая особенность изоформы а4, необходимой для обеспечения подвижности сперматозоидов, заключается в регуляции уровня Н за счет сопряженной 9 работы с системой Na+,H -o6MeHa (Woo et al., 2000). Показано, что изоформа cd равномерно распределена в плазматической А. мембране. Характерной особенностью регуляторных изоформ х2 - а4 является их локализация в особо организованных микродоменах, образованных плазматической мембраной и сарко(эндо)плазматическим ретикулумом. В этих компартментах осуществляется сопряженное функционирование регуляторных изоформ Ыа+,К+-АТФазы с транспортными механизмами, зависящими от градиента Na+ (Са2+- и ЬҐ-обменники), с такими клеточными компонентами как митохондрии, а также с ионными каналами и рецепторами (Arnon et al., 2000; Woo et ah, 2000; Aizman et al., 2001; Scheiner-Bobis, Schoner, 2001). По-видимому, благодаря локализации разных изоформ в специфических компартментах клетки обеспечивается автономность их регуляции различными факторами. На кардиомиоцитах морской свинки с применением метода фиксации потенциала показано, что изоформа al селективно регулируется катехоламинами через р-адренорецепторы и АХ через м-ХР при участии аденилатциклазы и цАМФ-зависимой протеинкиназы А. Изоформа х2 также регулируется катехоламинами, но через cti-адренорецепторы, сопряженные с фосфолипазой С и фосфоинозитидами при участии протеинкиназы С (Mathias et ah, 2000). Что касается изоформ Р-субъединицы Ка+,К+-АТФазы (количество аминокислотных остатков 279 - 304), то об их функциональной специализации известно еще меньше, чем об изоформах а-субъединицы. Изоформа pi, подобно al, экспрессируется во всех исследованных тканях. Изоформа Р2 широко представлена в почках, скелетных и гладких мышцах, сердце, нервной системе. Изоформа РЗ преимущественно экспрессируется в семенниках, но обнаружена также в мозге, почках и других внутренних органах (Blanco, Mercer, 1998; Mobasheri et al., 2000; Lopina, 2001). Комбинации различных изоформ а- и р-субъединиц обеспечивают дополнительное разнообразие свойств Ка+,К+-АТФазы. В отличие от изоформ а-субъединицы, имеющих степень гомологии более 90%, в том числе у очень разных видов, изоформы Р-субъединицы гомологичны лишь примерно на 40% даже в пределах одного вида (Gloor, 1997; Blanco, Mercer, 1998). В некоторых клетках экспрессируются три изоформы а субъединицы (а1, а2э аЗ) и как минимум две изоформы р-субъединицы (Р1, Р2), что позволяет предположить сосуществование димеров, Na ,К -АТФазы. Димеры Na ,К -АТФазы, содержащие разные изоформы Р-субъединицы, очень мало различаются по каталитической активности (Gloor, 1997). Следовательно, разные изоформы р-субъединицы, имеющие, как сказано выше, существенно разную первичную структуру, определяют какие-то другие свойства фермента. Учитывая, что эта субъединица играет роль "шаперона", можно предположить, что ее разные изоформы обеспечивают доставку и встраивание соответствующих изозимов Ыа+,К+-АТФазы в определенные субклеточные компартменты (Schmalzing et aL, 1997). Наконец, следует упомянуть у-субъединицу, хотя о ее изоформах мало что известно, и ее роль остается загадочной. В отличие от р-субъединицы, она не является компонентом, необходимым для структурно-функционального созревания №+,К+-АТФазы и ее встраивания в мембрану. Напротив, у-субъединица стабильно встраивается в мембрану только будучи ассоциированной со зрелым комплексом еф.
Характеристика экспериментального объекта
Опыты проводили на изолированных френико-диафрагмальных препаратах белых крыс (самцы весом 150 - 200 г.). Эвтаназию проводили резким "разрывом" в области шейных позвонков. Полоску левой полудиафрагмы крысы шириной 10 - 15 мм с входящим в нее нервом длиной около 20 мм помещали в плексигласовую камеру с проточным раствором следующего состава (в ммоль/л): NaCl-137; КС1-5; CaCI2-2; MgCl2-2; ЫаНСОз-24; NaHaPGr"!; глкжоза-11; рН всех растворов составлял 7,4—7,6. Раствор постоянно аэрировали карбогеном (95% Oi + 5% СО2).
Опыты проводили при температуре раствора в экспериментальной камере +28 С. Температуру в камере измеряли с помощью термодатчика и электротермометра ТПЭМ-1. Поддержание температуры обеспечивалось специальной электронной системой термостабилизации, нагревательный элемент был вмонтирован в дно камеры. Приготовленный френико-диафрагмальный препарат крысы помещали в экспериментальную камеру и оставляли в ней на 60 минут для того, чтобы мышца восстановилась после экстирпации. Затем регистрировали величину МПП мышечных волокон через каждые 15-30 минут в течение 2-3 часов. Каждый раз регистрировали МПП в 30 - 35 волокнах, процедура регистрации занимала 5 минут. В некоторых экспериментах в части волокон (20 - 30 волокон) регистрировали ПД. Регистрацию МПП и ПД мышечных волокон проводили с помощью стеклянных микроэлектродов с внутренними капиллярами, вытянутых из стекла марки "Пирекс" на микрокузнице МЭ-4. Микроэлектроды заполняли 3 М раствором КС1, их сопротивление составляло около 10 мОм, собственный потенциал кончика не превышал нескольких мВ. Величину МПП и параметры ПД регистрировали во внесинаптическом районе мышечных волокон на расстоянии около 2 мм от мест нервных разветвлений. Это расстояние намного превышает постоянную пространства, составляющую для мышечных волокон диафрагмы крысы около 0,6 мм (Zolovick et al., 1970). Таким образом, влиянием неквантового АХ, а также экзогенного АХ на результат измерения МПП через постсинаптические н-ХР можно было пренебречь. Процедура регистрации МПП в индивидуальном мышечном волокне была следующей. Сразу после погружения микроэлектрода в мышечное волокно нажатием кнопки формировался синхроимпульс, который запускал аналого-цифровой преобразователь ЭВМ. В опытах с регистрацией ПД данный синхроимпульс также формировал стимул длительностью 0.1 мс. Этим стимулом (величиной 2-3 порога) через всасывающий электрод проводили однократную стимуляцию нерва. После регистрации МПП (ПД) микроэлектрод выводили из данного мышечного волокна, и процедура повторялась с другими волокнами. Значение нуля системы оценивалось при компьютерном усреднении шума (микроэлектрод находился в растворе); смещение нуля корректировали с помощью ЭВМ перед измерением МПП в каждом волокне. Применяли усилитель с полосой пропускания 0 - 5000 Гц с входным сопротивлением предусилителя около 1 Юм. Микроэлектрод соединяли с входом предусилителя через агар-агаровый переходник с помощью хлорированной серебряной проволоки. Индифферентный хлорсеребряный электрод ввинчивали в заполненное агар-агаром "гнездо" в боковой стенке экспериментальной камеры, перемещение которой осуществляли препаратоводителем СТ-12. Подведение к мышечному волокну и погружение микроэлектрода в волокно производили при помощи подачи микроскопа "Биолам". Установка, блок-схема которой показана на рис. 1, располагалась в металлической заземленной камере, что позволяло устранить внешние электрические помехи. s В левом верхнем углу название файла с кратким описанием. Слева параметры сигнала, помеченного на рабочем окне звездочкой. Крестами зачеркнуты выбраковываемые ПД, удаленные из дальнейшей статистической обработки (см. п. 2.4.). В нижней части экрана расположено меню управления. Транспортную активность Na ,К -АТФазы оценивали по оуабаин-чувствительному входу нерадиоактивного Rb в эритроциты крысы с помощью метода эмиссионной пламенной фотометрии. Преимущество данного метода, помимо простоты, заключается в возможности в одних и тех же пробах измерять внутриклеточное содержание Na иК и таким образом оценивать состояние клеток (Веренинов и др., і982; Longo et al., 2001). Эритроциты получали из 2 мл цельной крови после промывки 4-х кратным объемом охлажденного до 4С раствора (в ммоль/л): NaCl - 145, Трис - 10, (рН раствора 7,4) с последующим центрифугированием (600 g) в течение 3-х минут. Супернатант и верхний слой эритроцитов, содержащий лейкоциты, удаляли, осажденные эритроциты снова промывали (см. Казеннов и др., 1984). Процедуру повторяли 4 раза, после чего суспензию с А осажденными эритроцитами доводили до исходного объема взятой пробы крови (2 мл) инкубационным раствором следующего состава (в ммоль/л): NaCl- 145, СаС12- l,NaH2P04- 1, MgCl2 -2; Трис- 10, глюкоза- 10; рН раствора 7,4. Далее для приготовления одной пробы к 0,1 мл полученной суспензии эритроцитов добавляли 1 мл инкубационного раствора, содержащего или не содержащего исследуемые вещества.
Вклад изоформ Na+,K+-АТФазы в мембранный потенциал покоя мышечных волокон
Проведенный выше анализ показал, что в присутствии АХ может существенно повышаться чувствительность а2 изоформы Ыа+,К+-АТФазы к сердечным гликозидам, что можно использовать в качестве чувствительного физиологического теста на ингибиторы, специфичные к данной изоформе.
Мы использовали такой подход для анализа эндогенных дигиталисоподобных факторов (ЭДПФ) в экстракте из почек свиньи. Почки гомогенизировали в этаноле (соотношение вес/объем 1:2), гомогенат центрифугировали (15 мин 1300 g), супернатант высушивали под вакуумом при температуре 40-45С в ротационном испарителе до получения остатка в виде темно-коричневого материала (около 70-80 г остатка из 5 кг почек). Полученный остаток доводили до 250 мл дистиллированной водой («экстракт»). Затем 1% раствор этого экстракта центрифугировали (8000 g), фильтровали через мембранный фильтр Alltech (диаметр поры 0.45 мкм), после чего подвергали ультрафильтрации в центриконе (Amicon) на 10 кДа. Полученный после ультрафильтрации раствор экстракта далее применяли в электрофизиологических экспериментах. Другая часть экстракта экстракта была исследована с помощью двух методов. Проф. Ф. Мандел (Бейлорский Медицинский Колледж, Хьюстон, США), выделял ЭДПФ из экстракта с помощью принципиально новой методики, и далее сепарировал их с использованием жидкостной хроматографии высокого давления и полупрепаративных колонок С-18. О наличии в пробах факторов, ингибирующих №+,К+-АТФазу, судили по изменению входа Rb в эритроциты человека. Этот анализ показал наличие в экстракте почек не только фактора, идентичного оуабаину, но еще, по крайней мере трех, пока не идентифицированных ЭДПФ (Mandel et al., 2003). Другой метод основан на конкуренции связывания иммобилизованного коньюгата и содержащего ЭДПФ образца с поликлональными антителами к маринобуфагенину и оуабаину (получены из кролика, иммунизированного соответствующими сердечными гликозидами). Такой анализ экстракта, проведенный д-ром А.Я. Багровым (Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, РАН) с применением иммунофлуоресцентного м метода и специфических антител, показал наличие в экстракте и оуабаин-, и маринобуфагенин-подобного материала. Мы исследовали влияние физиологического раствора, содержащего экстракт почек, на величину МПП и на вызываемую АХ гиперполяризацию мышечных волокон. Чтобы оценить динамику действия экстракта, мышцы & инкубировали в физиологическом растворе с экстрактом (разведенным в 10000 раз) в течение 1-го, 2-х или 3-х часов; по истечении каждого часа на 15 мин добавляли АХ (100 нмоль/л). Действие экстракта на гиперполяризующий эффект АХ развивалось очень медленно. Только через 2 часа действия раствора с экстрактом наблюдалось существенное уменьшение вызываемой АХ гиперполяризации, и лишь через 3 часа развивался полный блокирующий эффект (рис. 13). Отметим, ранее мы показали, что при инкубации мышц в нормальном физиологическом растворе в течение 3-х часов добавление АХ в разные моменты времени всегда приводило к гиперполяризации величиной около 4-х мВ (см. рис. 8). Далее мышцы инкубировали в физиологических растворах, содержащих экстракт при разной степени разведения (от 2000 до 100000 раз) в течение 3-х часов, только после этого на 15 мин добавляли АХ. Экстракт (как и оуабаин) дозо-зависимым образом блокировал гиперполяризующий эффект АХ. На рис. 14 сравниваются зависимость величины МПП щ мышечных волокон в присутствии АХ от концентрации оуабаина (эта кривая ранее была представлена на рис. 11) и такая же зависимость от степени разведения экстракта. Оказалось, что в присутствии АХ экстракт (как и оуабаин) вызывал дозо-зависимую деполяризацию мембраны. Предсказываемый моделированием уровень МПП при максимальном эффекте экстракта составил -75.5 ± 1.4 мВ, что соответствует МПП при полном ингибировании а2 изоформы Ыа+,К+-АТФазы. Величина ИК5о этого эффекта соответствовала очень сильному разведению экстракта: в -20000 раз (рис. 14).
Изоформы а-субъединицы Na+,K+-АТФазы и электрогенез скелетных мышечных волокон
Следующей целью работы была характеристика мишени АХ в его гиперполяризующем эффекте. Хорошо известно, что ряд гормонов и медиаторов (катехоламины, тиреоидные гормоны, инсулин, серотонин, дофамин), в том числе АХ, влияют на активность и индукцию Na ,K+-АТФазы через соответствующие рецепторы (см. обзоры: Clausen, 1998; Glitsch, 2001; Gloor, 1997; Mathias et al., 2000). На сегодняшний день хорошо изучено участие в регуляции Ыа+,К+-АТФазы м-ХР, в частности, в сердечной мышце (Danilenko et ah, 1990; 1991; Begyun et al., 1996; Mathias et al., 2000). Для скелетной мышцы показано, что АХ в низкой концентрации активирует Ыа ,К+-АТФазу и вызывает гиперполяризацию мембраны мышечных волокон за счет электрогенного компонента активного транспорта ионов (Dlouha et al., 1979; Nikolsky et al., 1994; Vyskocil et al., 1983). Характер мишени AX в этом эффекте не был установлен, в частности, обсуждалась возможность прямого активирующего действия АХ на Ыа+,К+-АТФазу (Nikolsky et al., 1994; Vyskocil et al., 1983). Мы полагаем, однако, что подобное действие АХ в низкой концентрации ( 100 нмоль/л) трудно объяснить без предположения о существовании соответствующего специфического рецептора.
Проведенный нами анализ показал следующее. 1) АХ в широком диапазоне концентраций не влияет на оуабаин-чувствительный вход Rb+ в эритроцитах крысы, ни на активность очищенной Ыа+,К+-АТФазы из почек овцы (в почках и эритроцитах отсутствуют какие-либо рецепторы к АХ) (см. 3.2.2.). Все это противоречит предположению о прямом активирующем действии АХ на Ыа+,К+-АТФазу. 2) Гиперполяризация мышечных волокон полностью воспроизводится на фоне блокатора м-ХР атропина, что исключает участие таких рецепторов в данном эффекте. Отметим, что имеющиеся данные об участии м-ХР в холинергической регуляции электрогенеза скелетной мышцы крысы неквантовым АХ (Urazaev et al., 2000) получены на денервированной мышце, то есть на совершенно иной экспериментальной модели.
Далее мы проверили возможность участия в гиперполяризующем эффекте АХ н-ХР. Здесь важно отметить, что величина вызываемой АХ гиперполяризации (-4 мВ) в диафрагме крысы не изменяется после ингибирования АХЭ. Это означает, во-первых, что при интактной АХЭ гиперполяризацию вызывает сам АХ, а не продукты его гидролиза (например, холин). Это подтверждается и в опытах с использованием таких негидролизуемых агонистов н-ХР как никотин или карбахолин, которые в условиях интактной АХЭ также вызывают гиперполяризующее действие, хотя и несколько меньшее, чем АХ. Во-вторых, из опытов с ингибированием АХЭ следует, что эффективная концентрация АХ во внесинаптическом районе при интактной АХЭ соответствует концентрации АХ в омывающем растворе. По-видимому, это можно объяснить относительно низкой плотностью АХЭ во внесинаптической области и достаточно свободной диффузией АХ в эту область из перфузирующего раствора. Для дальнейшей характеристики н-ХР в гиперполяризующем эффекте АХ мы исследовали этот эффект в присутствии различных лигандов, являющихся агонистами или антагонистами специфических мест связывания н-ХР. Агонисты специфических сайтов н-ХР никотин или карбахолин (в концентрации 100 нмоль/л) также вызывали гиперполяризацию мембраны, хотя и несколько меньшую по сравнению с АХ в той же концентрации. Конкурентные антагонисты н-ХР d-тубокурарин (обратимого действия) и а-бунгаротоксин (необратимого действия) полностью блокировали гиперполяризующее действие АХ. С другой стороны, антагонист н-ХР проадифен (десенситизирующий агент неконкурентного типа, блокатор открытого ионного канала) не изменял величины гиперполяризующего действия АХ, однако существенно сдвигал кривую доза-ответ для гиперполяризующего эффекта АХ в область меньших концентраций АХ (см. х. ниже). Таким образом, три специфических агониста н-ХР - АХ, карбахолин или никотин вызывали гиперполяризацию мышечной мембраны. В то же время два специфических конкурентных антагониста (d-тубокурарин, а-бунгаротоксин) блокировали вызываемую АХ гиперполяризацию, а р неконкурентный антагонист проадифен модулировал ее. Эти результаты подтверждают участие в гиперполяризующем эффекте АХ н-ХР, причем показывают, что в реализации эффекта играют существенную роль специфические места связывания рецептора. Активация №+,К+-АТФазы АХ и последующая гиперполяризация щ могут быть следствием потока ионов через открытые каналы н-ХР. Например, вход Na+ и выход К+ приводят к активации Ыа+,К+-АТФазы. Другая возможность - вход в клетку Са+, что может индуцировать гиперполяризацию вследствие активации Са+-зависимых калиевых каналов. Однако известно, что проадифен в концентрации 5 мкмоль/л действует как блокатор ионных каналов н-ХР (Ryan et al., 2001; Song, Pedersen, 2000; Song et al., 2003), причем эффективность блокирования существенно возрастает в присутствии агонистов н-ХР (см. Magazanik, Vyskocil, 1976; Giniatullin et al., 1989). Так как гиперполяризующий эффект АХ полностью сохранялся в присутствии проадифена, можно сделать вывод, что этот эффект не зависит от ионных % токов через каналы н-ХР. Таким образом, наши данные свидетельствуют о существовании в зрелых мышечных волокнах диафрагмы крысы функциональной связи между н-ХР и Ыа+,К+-АТФазой (предположительно, ее а2 изоформой), причем это взаимодействие реализуется через механизм, не связанный с открыванием ионного канала н-ХР. Напомним, что подобный эффект наблюдали на культуре скелетных мышечных клеток С2С12, где было показано, что н-ХР вовлечен в долговременную регуляцию индукции а2 изоформы Na+,K+- АТФазы, не зависящую от его основной функции в качестве лиганд управляемого ионного канала (Henning et al., 1994; Kragenbrink et al., 1996). Далее, для того чтобы охарактеризовать сайт связывания АХ, нами была исследована зависимость доза-ответ для гиперполяризующего эффекта АХ. Было установлено, что величина ЭК5о Для вызываемой АХ гиперполяризации составляет 28.3 ± 3.6 нмоль/л. Известные константы активации н-ХР скелетной мышцы для АХ намного выше: порядка 10 мкмоль/л (Ререг et al., 1982; Garland et al., 1998). Таким образом, наши данные свидетельствуют об участии в гиперполяризующем эффекте АХ рецепторов, характеризующихся повышенной аффинностью к АХ.
