Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
1.1. Актуальность темы 4
1.2. Цель и задачи исследования 4
1.3. Научная новизна 5
1.4. Практическая значимость работы. 6
1.5. Вид и формы внедрения в практику 6
2. Обзор литературы 7
2. 1. Введение 7
2.1.1. Генетический контроль туберкулезной инфекции 7
2.2. Генетика туберкулеза человека 7
2.2.1. Общие положения 7
2.2.2. Гены, контролирующие восприимчивость к туберкулезу у человека 9
2.2.3. Генетика экспериментального туберкулеза 16
2.2.3.1. Общие положения 16
2.2.3.2.Два подхода к исследованию генетики туберкулеза на мышах 16
2.2.3.3. Гены, участвующие в контроле туберкулеза у мышей, выявленные методом «обратной генетики» 17
2.2.3.4. Ген xid (btk) 21
2.2.3.5 Гены предрасположенности к туберкулезу у мышей, выявленные методом «прямой генетики» 22
2.2.3.5.1. Ген Sc11a1 (по старой номенклатуре Nramp1) 22
2.2.3.5.2. Ген Ipr1 24
2.2.3.5.3 Локусы Trl-1, Trl-2, Trl-3 и Trl-4 25
2.2.3.5.4. QTL на 3, 9 и 17 хромосомах 26
3. Материалы и методы 29
3.1. Животные и выведение рекомбинантных конгенных линий мышей 29
3.2. Выделение ДНК 29
3.3. Генетическое типирование 30
3.4. Заражение и параметры инфекции 32
3.5.Подсчет колоний микобактерий (CFU) 32
3.6. Приготовление суспензии легких и проточная цитофлуориметрия 32
3.7. Продукция цитокинов. 33
3.8. Гистологические исследования. 33
3.9. Постановка пролиферативного теста 34
3.10. Выделение РНК и получение кДнк 34
3.11. Определение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 35
3.12. Клонирование генов-кандидатов 35
3.13. Определение экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов Illumina 36
3.14. Статистическая обработка результатов 36
4. Результаты 37
4.1. Выведение новых рекомбинантных линий мышей, конгенных по МНС 37
4.2. Локус tbs-3 влияет на разные фенотипы 39
4.3. Исследование роли полиморфизма TNF- в течении инфекции 43
4.4. Тонкое генетическое картирование участка МНС, содержащего ген-кандидат 44
4.5. Генотипические и фенотипические характеристики новой линии B6.I-9.5.7 47
4.6. Исследование клеточного состава легких при инфекции 50
4.7. Линия мышей В6 несет доминантный аллель, определяющий резистентность к инфекции 51
4.8. Анализ экспрессии генов в нормальной и зараженной легочной ткани линий 52
4.9. Сужение области генома, несущей ген(ы) –кандидат(ы) 55
4.10. Сравнение параметров течения ТБ у мышей линий B6.I-249.1.15.100 и родительских линий 56
4.11. Позиционное клонирование в области 17:34,243371 - 34,341959 59
5. Обсуждение 62
6. Выводы 65
7. Список сокращений 66
8. Список литературы
- Научная новизна
- Генетический контроль туберкулезной инфекции
- Генетическое типирование
- Генотипические и фенотипические характеристики новой линии B6.I-9.5.7
Научная новизна
К первой группе относятся гены, кодирующие и регулирующие экспрессию INF-, а также рецепторы к нему. Существуют данные о том, что некоторые мутации в этих генах у человека приводят к состоянию иммунодефицита [15,16]. В 1995 году было описано несколько случаев наследственных иммунодефицитов, приводящих к увеличению чувствительности к диссеминированной нетуберкулезной микобактериальной инфекции и сальмонеллёзу. Этот тип иммунодефицита был связан с дефектом макрофагов, состоящим в неспособности вырабатывать TNF- в ответ на эндотоксин и отвечать на INF- выработкой цитокинов. При генетическом исследовании была обнаружена мутация в гене, кодирующем лиганд-связывающую цепь рецепторного комплекса к INF -, приводящая к отсутствию этого рецептора на поверхности лейкоцитов [16,17]. Функционально похожие мутации были обнаружены и в последовательности, кодирующей другую часть рецепторного комплекса, а именно сигнальную трансдукторную цепь. Эти мутации приводили к неспособности клеток отвечать активацией на INF - при нормальной экспрессии рецептора [18].
Цитокин TNF выполняет провоспалительную функцию в организме человека и продуцируется моноцитами, макрофагами и дендритными клетками в ответ на присутствие микобактерий или их продуктов. Влияние на чувствительность к туберкулезу полиморфизмов в промоторном участке гена TNF (238G/A и 308G/A) изучались на отдалённых популяциях в Иране и Колумбии [19,20]. Другие исследования были сосредоточены уже на гене, кодирующем рецептор к цитокину TNF, - TNFR1. Здесь обнаружили корреляцию между полиморфизмом в гене TNFR1 и резистентностью к ТБ в Гане и ЮАР [21].
IL-1 экспрессируется многими иммунными клетками в виде неактивного предшественника, но после расщепления каспазой-1 переходит в активную форму в составе инфламмосомы. IL-1 регулирует работу растворимых медиаторов, и тем самым контролирует ответ хозяина на инфекцию. Полиморфизм 3953T/C в гене IL-1 определяет изменение чувствительности к ТБ [22], но сам механизм действия пока не установлен.
IL-6 обладает, главным образом, провоспалительными свойствами, которые проявляются на самом раннем этапе развития иммунного ответа, что связано с вовлечением в процесс дифференцировки макрофагов и цитотоксических Т-клеток. Полиморфизм 174G/A коррелирует с изменением чувствительности к ТБ у населения в Иране [19,20] и среди аборигенов Канады [23]. Высокая концентрация IL-10 в легочной ткани в некоторой степени помогает размножению микобактерий, т.к. данный цитокин блокирует созревание фагосом внутри макрофагов [24]. В данном гене известны два SNP: 1082G/A [25] и 592A/C [26], которые ассоциированы с изменением чувствительности к ТБ.
Мутации в генах, кодирующих субъединицу р40 самого цитокина IL -12 [27] и 1-цепь рецептора к IL-12 [28] у человека приводят к развитию диссеминированной формы микобактериальной инфекции. Клинические проявления при этих мутациях сходны с таковыми при дефиците INF- и его рецептора, но болезнь протекает значительно мягче и наблюдается положительный эффект при лечении таких больных экзогенным INF- [18].
В модельных экспериментах было показано, что мыши, несущие нокаут-мутацию в гене, кодирующем IL-18, проявляли чувствительность к M. bovis (BCG) и M. tuberculosis [29]. В одной из популяций в Китае было найдена зависимость между полиморфизмом в гене IL18 и чувствительностью к туберкулезу [30]. IL-22, продуцируемый клетками Th-17 и NK-клетками, способствует активации нейтрофилов. Недавно было показано, что несколько единичных нуклеотидных замен, расположенных в промоторе гена IL22, определяют повышенную чувствительность к туберкулезу в одной из популяций в Китае. Предположительно, механизм, посредством которого IL-22 контролирует развитие туберкулезной инфекции, связан с активацией транскрипционного фактора STAT3, который, в свою очередь, является опосредованным активатором большого набора генов, кодирующих цитокины [31]. Иммунодефицит, обусловленный нехваткой IL-23, приводящий к увеличению чувствительности к микобактериальной инфекции и сальмонеллёзам, связан со снижением выработки других цитокинов – IL -12 и INF - [32].
Общеизвестная функция витамина D, как регулятора кальциевого обмена, не является единственной. Не менее важную роль играет метаболит витамина D - 1,25-дигидроксивитамин Dз (1,25-Dз), который является важным гормоном регуляции иммунной системы, активирует моноциты, а также стимулирует некоторые реакции клеточного иммунитета, но может подавлять пролиферацию лимфоцитов и синтез цитокинов [33,34]. Свое действие 1,25-Dз осуществляет через рецептор к витамину D (VDR), который есть на поверхности моноцитов и активированных Т- и В-клеток [35]. Доказательства того, что чувствительность к туберкулезу зависит от дефицита витамина D были получены уже давно [36]. Лечение туберкулезных больных этим витамином дает положительный эффект, особенно при туберкулезе кожи. При действии на моноциты человека in vitro 1,25-Dз происходит снижение уровня внутриклеточного размножения М. tuberculosis [34,37]. Механизм действия заключается в том, что 1,25-Dз при связывании с рецептором VDR, индуцирует синтез антибактериального белка кателицидина, который попадая в фагосому убивает М. tuberculosis [38].
Влияние полиморфизма по данному гену на чувствительность к туберкулезу была многократно показана для разных популяций человека [39-41].
Оптимальный уровень циркулирующего 1,25-D3 в сыворотке крови поддерживается специальным ферментом - D-1-гидролазой, которая кодируется геном CYP27B1. Данный фермент превращает про-гормон 25-гидровитамин D3 в 1,25-дигидроксивитамин D3 [42]. Была найдена зависимость между уровнем экспрессии гена CYP27B1 и продолжительностью инкубации человеческих моноцитов до проявления ответа на липопротеины M. tuberculosis. Механизм антимикобактериального процесса заключается в том, что сигнал от рецептора VDR приводит к увеличению экспрессии двух антимикробных генов, которые кодируют и кателицидин, и белок DEFB4. Оба этих белка уничтожают микобактерии внутри клетки [38].
Участие генов класса II комплекса HLA в контроле туберкулезной инфекции подтверждено не раз [43-45]. Большой массив данных свидетельствует о том, что степень восприимчивости к ТБ варьирует у носителей аллельных вариантов гена HLA-DR [46,47]. В частности, комплекс аллельных вариантов семейства HLA-DR2 влияет на риск развития заболевания в нескольких этнически отдаленных друг от друга популяциях [48-50]
По результатам HLA-типирования больных ТБ и контрольной популяции в Камбодже было показано, что варианты аллеля DQB 0503 влияют на развитие инфекции [43]. Позднее было установлено, что разницу по чувствительности к туберкулезу определяет полиморфизм по аминокислотному остатку 57 -цепи молекулы DQ. Исследования, проведенные на антиген-презентирующих клетках, в которых были экспрессированы разные аллельные варианты DQ, показали, что клетки с аллелем кодирующем -цепи молекулы с Asp57 быстрее индуцируют продукцию IFN- Т-клетками CD4 в ответ на связывание антигенов M. tuberculosis, по сравнению с клетками - с Ala57 [51].
Влияние полиморфизма по генам семейства рецепторов TLR на восприимчивость к разным инфекциям подтверждено многократно. Доказано, что М. tuberculosis распознается несколькими представителями данного семейства: TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, и TLR9. Рецептор TLR2 может взаимодействовать как сам по себе, так и в виде гетеродимера с TLR1 или TLR6. Наиболее выраженный воспалительный ответ на инфекцию происходит при активации сигнального пути от TLR2 через адапторные белки MyD88 и TIRAP (TIR domain-containing adaptor protein) [52]. Поэтому именно вариант аллеля гена TLR2 является решающим фактором в изменении чувствительности к ТБ. Известен полиморфизм Arg753Asn в гене TLR2, который определяет восприимчивость к стафилококку, причем аллельный вариант 753Asn характеризуется сниженной функциональной активностью рецептора TLR2 и повышенной чувствительностью к инфекции [53]. Другой полиморфизм гена TLR2 (597T/C) связан с изменением чувствительности к менингиту в популяции Вьетнама [54]. Аналогично, в корейской популяции была показана связь между полиморфными отличиями в интроне II гена TLR2 и чувствительностью к туберкулезу [55]. Упомянутый выше ген TIRAP играет важную роль в передаче сигнала от рецепторов TLR2 и TLR4 при активации транскрипционного фактора NF-kB [56], хотя в отношении контроля ТБ данные по этому гену остаются противоречивыми. Так, в популяционных исследованиях в Западной Африке в гене TIRAP был обнаружен полиморфизм Ser180Leu, влияющий на степень чувствительности к ТБ; при этом, вариант 180Leu - детерминировал большую резистентность [57]. Однако исследования во Вьетнаме эти данные не подтвердили [55], а еще одна работа показала, что значимой является аминокислотная замена в позиции 186, а не 180, причем она приводит к изменению в чувствительности к туберкулезному менингиту, а не вообще к ТБ [58].
Скрининг полного генома человека позволил установить сцепление слабых вариантов фенотипических проявлений ТБ с аллельными вариантами других генов врожденного иммунитета. Например, было описано сцепление вариантов течения ТБ с двумя промоторными вариантами гена CD209, кодирующего рецептор DC-SIGN (Cype lectin dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin), который считается одним из основных рецепторов для микобактерий на дендритных клетках [59]. Затем та же группа авторов показала, что полиморфизм A/G в промоторах гена CD209 в 336 и 871 позициях в южно-африканской популяции определяет чувствительность к ТБ [60].
Генетический контроль туберкулезной инфекции
Несмотря на отмеченные выше недостатки метода полного выключения генов, он позволил довольно быстро получить массив доказательств роли конкретных генов в развитии туберкулезной инфекции. Естественно, проверку техникой нокаут в первую очередь прошли те гены, роль которых предполагалась, исходя из косвенных данных и общих представлений о выполняемых ими функциях в иммунной системе.
С помощью мышей-нокаут было установлено, что разрушение генов, кодирующих INF-, IL-12, IL-6 сильно снижает сроки выживания животных после заражения микобактериями и нарушает иммунный контроль над размножением последних в органах [90-92]. В тоже время, нарушение структуры генов, кодирующих IL-4, IL-5 и IL-10, не приводило к изменению чувствительности к туберкулезу [93].
Было показано, что мыши с дефицитом самого цитокина TNF- или его рецептора значительно чувствительнее к заражению микобактериями [94]. При этом нейтрализация TNF в модели латентного и активного туберкулеза у мышей четко показала его роль в поддержании интегрированного состояния гранулем и блокаде диссеминации инфекции [95-97]. TNF- продуцируется разными иммунными клетками: макрофагами, нейтрофилами и Т-клетками [96]. Хорошо известно, что при защите организма-хозяина от внутриклеточных инфекций, важную роль играет INF-. Этот факт подтверждается тем, что мыши - нокауты по гену ifng, кодирующему INF-, не способны контролировать даже сублетальную для мышей дикого типа дозу М. tuberculosis вне зависимости от способа заражения, что приводит к стремительному росту бактерий в органах. Патология легких у этих мышей отличается наличием обширных некротических участков ткани. При этом гранулемы в легких образуются, но входящие в их состав клетки не синтезируют активных форм азота и не могут ограничивать размножение микобактерий. Туберкулез у таких животных протекает стремительно и имеет тенденцию к диссеминации. Введение экзогенного рекомбинантного INF- может отсрочить, но не предотвратить гибель животных [91,98].
Роль рецептора к INF- тоже была изучена c помощью мышей-нокаутов [99]. Оказалось, что для защиты хозяина важен не только сам INF-, но и полноценно функционирующий рецептор. При заражении мышей IFN-R-/- и контрольных животных низкой дозой вирулентного штамма М. bovis первые погибали через 7-9 недель, а мыши дикого типа жили еще несколько месяцев, что сопровождалось соответствующими различиями в размножении микобактерий в органах. При оценке патологии легочной ткани у мышей-нокаутов обнаруживалось снижение числа гранулем, а в сыворотке крови – концентрации TNF-, IL-1 и IL-6 по сравнению с мышами дикого типа.
Роль IL-12 в развитии иммунного ответа на туберкулезную инфекцию тоже была доказана с помощью метода нокаут. Отсутствие субъединицы р40 IL-12 приводит к потере способности организма животного контролировать размножение микобактерий в органах и быстрой гибели. У таких животных наблюдается существенное снижение продукции INF- и TNF-, что приводит к снижению количества активированных макрофагов и к формированию гранулем с низким содержанием лимфоцитов. Характерно было присутствие в ткани легкого многочисленных макрофагов с высоким содержанием вакуолей. Было высказано предположение, что неспособность образовывать полноценные гранулемы связана с дефицитом Т-хелперов-1, т.к. для продукции ими INF- требуется дополнительная активации через IL-12 [100]. Многофункциональный цитокин IL-6, участвующий в гемопоэзе, Т- и B-клеточной дифференцировке и воспалительных реакциях, оказывает сильное влияние на течение туберкулеза. Оказалось, что мыши-нокауты по гену IL-6 очень чувствительны к заражению вирулентным штаммом М. tuberculosis. Сроки выживания таких мышей по сравнению с контрольными животными составляют 60 вместо 120 дней. Через 15 дней после заражения количество микобактерий в органах мышей двух групп различается в 10 раз, а через 60 дней – в 100-1000 раз. В культуре in vitro клетки селезенки мышей-нокаутов по IL-6 в ответ на антигены микобактерий продуцировали меньше INF- и TNF-, но больше IL-4, чем мыши дикого типа. Таким образом, роль IL-6 в защите организма хозяина от микобактерий может состоять в развитии воспалительного ответа и активации ответа по типу 1, приводящего к синтезу INF-, который, в свою очередь, активирует макрофаги и повышает их бактериостатические возможности [101]. Интересно, что при заражении вакцинным штаммом М. bovis BCG, мутантные мыши и мыши дикого типа одинаково хорошо контролируют инфекцию.
У макрофагов мышей одним из основных эффекторных механизмов, обеспечивающих уничтожение внутриклеточных микобактерий, является выработка активных форм азота. В работах 90-х годов многими авторами была показана корреляция между ингибированием размножения микобактерий макрофагами мышей, стимулированных различными цитокинами, и образованием активных форм азота. [102-107]. Источником активных форм азота в макрофагах служит ферментативное разложение L-аргинина ферментом iNOS – индуцируемой NO-синтетазой.
Исследования, проведенные на мышах с разрушенным геном inos, кодирующем этот фермент, доказали важную роль этого гена в контроле туберкулезной инфекции. Выключение гена ведет к неконтролируемому росту микобактерий в легких, причем скорость роста микроорганизмов гораздо выше, чем даже у мышей с нокаутом по генам для INF- и его рецептора [108]. В этой же работе показано, что у гибридов первого поколения между мышами-нокаутами и мышами дикого типа, несущих только один аллель гена iNos, уровень NO снижен на 30-40%, но продолжительность жизни после заражения такая же, как и у мышей дикого типа, что свидетельствует о существовании пороговой эффективной концентрации фермента.
Семейство рецепторов TLR экспрессируется на поверхности клеточной мембраны основных клеток иммунной системы, в том числе, макрофагов и дендритных клеток. После взаимодействия конкретных микобактериальных структур с TLR, запускается сигнальный путь, в котором играет важную роль молекула MyD88 [109]. Сигнальный путь проходит через IRAK (IL-1 receptor-associated kinases), TRAF (TNF receptor-associated factor), TAK1 (TGF-activated protein kinase 1) и MAP-киназу (Mitogen-activated protein kinase), что в конечном итоге заканчивается активацией ядерного транскрипционного фактора - NF-В [110]. Это приводит к транскрипции генов, которые участвуют в активации системы врожденного иммунитета, в основном генов, кодирующих воспалительные цитокины, такие как TNF, IL-1 и IL-12 [111] .
Описанный выше путь не является единственным для активации генов врожденного иммунитета, также описан сигнальный путь активации рецептора TLR4 внутриклеточными сигналами, с последующей активацией молекул TIR (adapter molecule Toll/IL-1R) и TRIF(adapter inducing interferon IFN- ). Было доказано, что TLR4-зависимая активация играет важную роль в слиянии фагосомы и лизосомы и, следовательно, является важным компонентом врожденной защиты хозяина от микобактерий [112].
Распознавание различных компонентов клеточной стенки микобактерий осуществляется гетеродимерами, включающими цепи разных рецепторов семейства TLR. Так, гетеродимеры TLR2/TLR1 и TLR2/TLR6 обычно распознают гликолипиды: LAM (mannose-capped lipoarabinomannan), LM (lipomannan), PIM (phosphalidyl-myo-inositol mannosides), микобактериальные гликопротеины с м. м. 38кДа и 19кДа, триацилглицириды и диацилированные липопротеины клеточной стенки [113-115]. Изучение строения гранулем у мышей TLR2-/- показало отсутствие оформленных структур; при инфицировании высокой дозой M. tuberculosis, у таких мышей значительно выше восприимчивость к инфекции по сравнению с мышами дикого типа [116-117]. При этом данные литературы достаточно противоречивы, и роль рецептора TLR4 при микобактериальных инфекциях нельзя считать полностью доказанной [116-118]. Другой представитель семейства TLR, TLR9, играет важную роль в распознавании неметилированного CpG-мотива в бактериальной ДНК. В опытах in vitro было показано, что выработка IL-12 дендритными клетками зависит от рецептора TLR9. Более того, при высокой дозе заражения микобактериями животные без рецептора TLR9 погибают раньше, чем мыши дикого типа [119]. Интересно, что двойные мыши-нокауты по рецепторам TLR2 и TLR9 более чувствительны к микобактериям, чем единичные мыши-нокауты по любому из рецепторов [119].
Роль рецептора TLR8 до конца не определена. На макрофагах было показано, что после заражения BCG происходит увеличение экспрессии гена tlr8, но не известно, контролирует ли TLR8 развитие ТБ [120]. Чувствительность к туберкулезу также связывают с семейством рецепторов NLR (NOD like receptor). В данное семейство входят около 20 консервативно-устроенных рецепторов, которые узнают структуру PAMP (pathogen associated molecular patterns) на поверхности инфекционных агентов. После взаимодействия с PAMP, молекула передает сигнал транскрипционному фактору NF-В в ядро клетки, что в конечном итоге приводит к переработке предшественников цитокинов из семейства IL-1 в биоактивные продукты IL-1 и IL-18 [121]. В частности, внутриклеточный рецептор для бактериальных пептидогликанов NOD2 стимулирует продукцию цитокинов воспалении [122], и на дефицитных по NOD2 мышах было показано нарушение продукции этих цитокинов именно при инфицировании микобактериями. Тем не менее, данные о восприимчивости к ТБ у NOD2-дефицитных мышей противоречивы [123-124].
Генетическое типирование
Цитокины определяли иммуноферментным методом в гомогенате легких зараженных животных. Гомогенаты легких замораживали и хранили при -700С до постановки реакции. После размораживания дебрис удаляли центрифугированием и определяли содержание цитокинов в надосадочной среде методом ELISA с использованием коммерческих наборов OptEIA mouse TNF- Set, OptEIA mouse IL-5 Set и OptEIA mouse IL-6 Set (PharMingen–BD, CA, USA), следуя рекомендациям фирмы-изготовителя, а также INF- ELISA Set Biolegend. Для определения секреции цитокинов (TNF-, IL-5, IL-6, INF-) in vitro получали суспензии клеток легкого по методу описанному ранее. Затем 1.5 х 106 клеток культивировали 48 часов в 24-луночных планшетах в присутствии 10g/ml ультразвукового дезъинтеграта микобактерий и определяли количество цитокина в культуральной жидкости тем же методом. 3.8. Гистологические исследования.
Для исследования патологических изменений в легких подопытных мышей, ткань замораживали в режиме температурного градиента от –600C до –200C в течение 1 часа в электронном криотоме (ThermoShandon, Великобритания), после чего получали срезы толщиной 6-8 мкм, высушивали на воздухе, фиксировали в метаноле и окрашивали гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимической окраски препаратов срезы фиксировали в ацетоне (-200) в течение 30 минут, а затем срезы высушивали при комнатной температуре и промывали РBS. Для блокирования неспецифического окрашивания на срезы наносили 10% сыворотку козы на 15 минут согласно рекомендации фирмы-производителя. Далее на срезы наносились моноклональные антитела к поверхностному маркеру CD19, разведенные 1:50 в РBS, и оставляли во влажной камере при комнатной температуре на 1 час. Затем срезы тщательно промывали РBS и наносили вторичные биотинилированные антитела, разведенные 1:50 в РBS на 30 минут. После тщательной отмывки наносили раствор пероксидазы хрена, меченной стрептавидином, и инкубировали 30 минут. После отмывки в PBS на срезы наносили раствор диаминобензидина (DAB) на 5-6 минут и останавливали реакцию в дистиллированной воде. Перед окрашиванием гемотоксилином срезы промывали РBS с Tween 3 раза. После гемотоксилина срезы поочередно держали в растворах 50-, 70-, 96%-ного спирта и ксилола. Окрашеный срез легкого заключали в HyperMount под покровное стекло.
Мышей иммунизировали подкожно в подушечки задних лап соникатом M. tuberculosis H37Rv - 10 мкг на мышь в неполном адъюванте Фрейнда (Sigma, CША). Через 21 день после иммунизации из подколенных лимфоузлов выделяли смесь клеток. В качестве культуральной среды использовали среду RPMI-1640, содержащую HEPES, L-глютамин, незаменимые аминокислоты, пируват натрия, пенициллин-стрептомицин и 5% FCS (HyClone, USA). Все культуры ставили в триплетах и культивировали в течение 72 часов в СО2-инкубаторе при 37С, последние 18 часов в присутствии 0,5 C [Н3]-тимидина. Включение [Н3]-тимидина определяли на сцинтилляционном -счетчике Wallac (Turku, Finland) после переноса содержимого лунок на фильтры с помощью харвестера «Scatron».
Выделение РНК из селезенок и легких проводили при помощи набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Для удаления примеси геномной ДНК очищенную РНК обрабатывали дезоксирибонуклеазой I по протоколу фирмы-изготовителя (AMPD1, Sigma). Чистоту выделения РНК проверяли на спектрофотометре: соотношение А260/А280 составляло более 2,0 и А260/А230 - не менее 1,8-2,2. Кроме того, выделенную РНК проверяли на сохранность и отсутствие признаков деградации, для этого проводили электрофорез в денатурирующих условиях в агарозном геле с формамидом [178].
Комплементарную цепь ДНК синтезировали на РНК-матрице с использованием олиго(dT) праймера (Fermentas) с помощью обратной транскриптазы M-MLV (Promega, USA). Для проведения ПЦР в реальном времени мы использовали систему количественной идентификации ПЦР-продукта по связыванию с интеркалирующим красителем SYBR Green I. Последовательности праймеров для интересующих нас генов были подобраны с учетом следующих требований: величина Тm праймеров составляла 600-610С, ампликон для всех исследуемых генов составлял 150-160 пар оснований, праймеры не должны были образовывать вторичные структуры и быть комплементарными к друг другу. Кроме того forward- и reverse-праймеры были комплементарны последовательностям разных экзонов гена. В качестве «housekeeping» гена использовали b-актин, экспрессию которого определяли с праймеров ActbF 5 -CACCTTCTACAATGAGCTGC-3 и ActbR 5 -CTGGATGGCTACGTACATGG-3 . Для экспрессии генов Ring и Wdr46 использовали праймеры: RingF 5 -GAGATTGAGCTTGTGTTCCG-3 , RingR 5 -CTGTGGTTTCCTGCTGCTG-3 и Wdr46F 5 GGCGAAGATTCTGTGTCAC-3 , Wdr46R 5 -CAAGGTCCGGGAACTCAG-3 соответственно. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали готовую реакционную смесь (Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, Fermentas), ДНК-полимеразу Taq (Хеликон, Россия), кДНК в разведениях и праймеры, подобранные для интересующих нас генов. Использовали не менее 3-х образцов кДНК для каждой точки. В качестве контролей были использованы лунки не содержащие матрицы и образцы без обратной транскриптазы (RT-). Реакцию ПЦР проводили в амплификаторе СFX96 Real Time System (Bio-Rad), используя следующий протокол: 95С – 5 мин; 39 циклов: 95С – 15 сек, 60С - 40 сек. Поскольку для детектирования ампликонов использовали SYBR Green, который связывается с любой двухцепочечной ДНК, присутствие неспецифических продуктов могло приводить к увеличению сигнала. Поэтому продукты дополнительно анализировали и строили кривые плавления. Для обработки результатов использовали относительный пороговый метод (threshold method).
Поскольку последовательность генома линии мышей I/St до сих пор не установлена, и последовательности генов не известны, для синтеза праймеров использовали последовательности генов мышей В6, которые брали из базы данных Ensembl [179]. Для клонирования использовали праймеры длиной 21-25 нуклеотидов и для обеспечения лучшей комплементарности с последовательностью генов линии мышей I/St, forward-праймер заканчивали старт-кодоном ATG, а reverse-праймер стоп-кодоном TGA. Исследуемый ген амплифицировали с синтезированной кДНК с использованием высокоточной полимеразы Advantage GC Genomic LA Polymerase (Clontech, USA). Для клонирования использовали PCR-Script Amp Cloning Kit (Stratagene, USA) или вектор pALA (Евроген). В последнем случае очищенные ПЦР-продукты проходили дополнительные 3 цикла амплификации с Taq-полимеразой для добавления поли-А-хвостов. Очистку ПЦР-продуктов проводили электрофоретически в 1% агарозе с использованием набора для выделения ДНК из геля (Евроген). Вставки (очищенные ПЦР-продукты) лигировали в вектор с помощью T4-лигазы (T4 DNA ligase, Promega, USA), как описано в прилагаемой инструкции. 2 мкл лигазной смеси использовали для трансформации XL10-Gold химически компетентных клеток E.coli, которую проводили согласно протоколу [180]. Трансформированные клетки высевали на чашки с LB-агаром, ампициллином, X-gal и IPTG. Белые колонии проверяли на наличие вставки с помощью ПЦР, 3-6- позитивных клона отбирали для минипрепов и последующей очистки плазмидной ДНК с помощью кита PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit (Life Technologies, USA) согласно инструкции производителя. Для верификации последовательности гена проверяли последовательность 3-5 клонов. Определение последовательностей клонов проводили в компании Евроген (Москва).
Генотипические и фенотипические характеристики новой линии B6.I-9.5.7
Ранее в нашей лаборатории был картирован в 17 хромосоме мыши генетический локус, участвующий в контроле восприимчивости к туберкулезу - tbs-3 [167]. Пик сцепления в этом локусе находится вблизи маркера D17Mit103 (геномная позиция 17:34,184 м.п.о.) Для того, чтобы сузить генетический интервал и приступить к поиску генов-кандидатов были выведены конгенные рекомбинантные линии, у которых на резистентную основу C57BL/6 от чувствительной инбредной линии I/St были перенесены различные области локуса tbs-3 . Был исследован геномный участок около 60 м.п.о на 17 хромосоме между позициями 8,63 м.п.о и 65,34 м.п.о.
Для перевода на резистентную основу C57BL/6 все новые полученные рекомбинантные линии прошли по крайней мере 10 возвратных скрещиваний, после чего проводили братско-сестринские скрещивания для получения гомозиготных конгенных линий, несущих на основе В6 участок генома I/St в исследуемой области.
Для определения родительского происхождения аллелей в границах переноса мы использовали маркеры микросателлитной полиморфной некодирующей ДНК sslp (simple sequence length polymorphisms), позволяющие отличать мышей разных линий по длине продуктов ПЦР, включающих разное количество повторов нуклеотидов в sslp. Мы использовали маркеры D17Mit, представленные в базе данных www.jax.org (сайт Jackson Laboratory), но поскольку все маркеры Mit были разработаны для линии В6 и их размер у мышей I/St не был известен, сначала пришлось установить размер каждого sslp у родительской линии I/St, а затем использовать для генетического типирования только маркеры отличающиеся у родительских линий. В результате этой работы мы подобрали полиморфный набор маркеров для обеих родительских линий (Табл. 3, см. Материалы и методы). Все полученные нами линии мышей были проверены на чувствительность к туберкулезной инфекции, для чего их заражали в аэрозольной камере 500 КОЕ вирулентного штамма M.tuberculosis H37Rv. По срокам выживания новые конгенные линии разбились на две группы: в первой группе (B6.I-219, B6.I-20.15, B6.I-411, B6.I-107, B6.I-20.3) среднее время выживания составило 230-240 дней и не отличалось от родительской линии В6 (242 ± 14 дней). Вторая группа линий (B6.I-9.5.7, B6.I-9.5А, B6.I-21, B6.I-364.1, В6.I-398.16) была более чувствительна к ТБ и имела среднее время выживания 130-150 дней (Рис.1). В эту группу вошли линии, у которых область переноса включала геномный интервал 17-й хромосомы от 33,168 до 36,21 м.п.о. (Табл.4).
Нужно отметить, что вновь полученные чувствительные линии выживали достоверно дольше, чем родительская чувствительная родительская линия I/St (СВВ 88+/- 6 дней, см. Рис.1). Этот факт вполне согласуется с полигенным наследованием уровня восприимчивости к туберкулезной инфекции [168]: поскольку локус 17-й хромосомы определяет лишь часть фенотипа, конгенные по нему линии меньше отличаются от мышей В6, чем мыши I/St.
Таким образом, перенос различных участков 17 хромосомы от родительской чувствительной линии I/St на резистентную генетическую основу В6 позволил более точно определить генетическую область, несущую ген(ы), контролирующие чувствительность к ТБ. С помощью рекомбинантных конгенных линий был исследован сегмент хромосомы от 8,63 до 65,34 м.п.о., и область поиска удалось сократить до интервала 33,168-36,21 м.п.о (между маркерами D17Mit147 и D17Mit47). Тем не менее, установленный нами участок генома оставался слишком большим для позиционного клонирования генов, поэтому наши дальнейшие усилия были направлены на сужение генетического интервала за счет более тонкого картирования и получения следующего набора линий с рекомбинациями внутри выявленной области. Еще одной задачей стало исследование того, на какие проявления ТБ влияет исследуемый локус, поскольку оставалось неясным, контролируются ли разные параметры заболевания (размножение бактерий в органах, патология легких, срок выживания и др.) независимо или интегрально.
Для сравнения с родительскими линиями по нескольким «классическим» фенотипам были выбраны конгенные линии B6.I-9.5A (СВВ=134 ± 8) и B6.I-21 (СВВ=138 ± 25), несущие в картированной нами геномной области аллели от мышей I/St (Табл. 3) и имеющие промежуточный фенотип по выживанию (Рис.1).
Также, мы исследовали характер патологических изменения в легочной ткани зараженных мышей. Оказалось, что перенос на генетическую основу В6 участка генома мышей I/St приводит к принципиальным изменениям в развитии легочной патологии при ТБ (Рис.4). На поздних стадиях болезни у мышей конгенной линии B6.I-21 площадь поражения легких и размеры туберкулезных воспалительных очагов были значительно больше, чем у мышей В6 (Рис. 4А,Б). В отличие от мышей В6, у мышей B6.I-21 развивалась диффузная туберкулезная пневмония со слиянием отдельных очагов воспаления (Рис. 4 В, Г). Интересно, что у мышей B6.I-21 фолликулы В-клеток в легких были крупнее и плотнее, чем у мышей В6, подобно тому, что было описано для мышей I/St [141].
Среди генов исследуемой нами области ген tnfa (геномная позиция 17:35,199 – 35,202 м.п.о.) может рассматриваться как один из приоритетных генов-кандидатов. Во-первых, многочисленные исследования подтвердили важность этого провоспалительного цитокина при ТБ [182-184]. Во-вторых, несмотря на общий эволюционный консерватизм гена tnfa, связанный, вероятно, с высокой важностью выполняемых этим цитокином функций, именно мыши I/St отличаются от всех других несколькими мутациями в гене tnfa [174]. Это потенциально могло бы привести к серьезным изменениям в иммунном ответе при ТБ. Для исследования были отобраны конгенные линии мышей, которые отличаются по чувствительности к ТБ и несут области генома от мышей I/St с границами между D17Mit22 (34,333 м.п.о.) и D17Mit47 (36,21 м.п.о.) (Табл.5). Аллельные варианты TNF-a определяли методом RFLP продуктов ПЦР: аллели tnfa у мышей В6 и I/St отличаются заменой Arg8His (G A), что приводит к появлению сайта для рестрикционной нуклеазы DraIII (см. Материалы и Методы). Результаты исследования показаны в Табл. 5 и на Рис. 5.
Сопоставление данных по типированию аллельных вариантов гена tnfa у конгенных линий мышей с данными о чувствительности к ТБ (выживаемость и кахексия) позволяют заключить, что аллельные варианты гена tnfa не определяют чувствительность или резистентность. Оказалось, что две резистентные линии, B6.I-20.15 и B6.I-411, имеют разные аллели, соответственно, tnfaj и tnfab, а линии B6.I-9.3 и B6.I-9.5А обе чувствительнее к инфекции, чем исходная линия В6, хотя первая несет аллель tnfb линии В6, а вторая приобрела в результате рекомбинации аллель tnfaj от чувствительной линии I/St (Табл. 5, Рис. 5). Таким образом, основная роль в определении уровня восприимчивости и тяжести течения ТБ принадлежит не гену tnfa, а искомый ген лежит проксимальнее tnfa.
