Содержание к диссертации
Список сокращений 5
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Туберкулез — особенности патогенеза и иммунного ответа 11
Противотуберкулезные вакцины (BCG, и другие живые вакцины, субъединичные вакцины) 15
Мутация Xid и ее роль в иммунном ответе и чувствительности к инфекциямЛ8
Влияние мутации xid на функции клеток иммунной системы 22
1.4.1. Роль мутации xid в днфференцнровке и функционировании В-
лимфоцитов 22
Макрофаги, их функции и роль Btk 27
Влияние мутации xid на функции нейтрофилов 31
Влияние мутации xid на функции дендритных клеток 32
Влияние мутации xid на проведение сигнала от TLRs 33
1.5. Роль мутации xid в туберкулезной инфекции 36
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40
Лабораторные животные 40
Микобактериальные культуры 40
Заражением tuberculosis H37Rv 40
Вакцинация мышей 40
Определение количества микобактерий в органах зараженных животных 41
Антигены 41
Среды и растворы 41
Получение суспензии клеток легкого 42
Получение суспензии клеток регионарных лимфатических узлов 43
Получение суспензии клеток селезенки 43
Получение суспензии перитонеальных макрофагов 43
Гистопатология 44
Фагоцитоз микобактерий перитонеальными макрофагами 45
Окраска клеток, содержащих микобактерий 45
Получение Т-линий 45
Антиген-специфический пролиферативный тест 46
Получение костномозговых химер 47
Перенос клеток эмбриональной печени 47
Анализ клеток методом проточной цитофлуориметрии 47
Выделение суммарной РНК из суспензии клеток 48
Получение кДНК 49
Определение продукции цитокинов и хемокинов клетками методом ПЦР в реальном времени 49
Определение количества Т-лимфоцитов, продуцирующих IFNy, методом IFNy secretion assay in vitro 49
Определение количества Т-лимфоцтов, продуцирующих IFNy, методом ELISPOT іи vitro 50
Удаление нейтрофилов in vivo 51
2.26. Статистическая обработка результатов 51
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 52
Влияние мутации xid на клеточный состав органов до и после вакцинации. 52
Влияние мутации xid на клеточный состав органов зараженных животных. 54
Оценка числа Т-лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFNy в легких вакцинированных мышей после заражения 59
Зависимость эффективности вакцинации мышей CBA/N-xid от дозы вводимой BCG 62
Роль В-лимфоцитов в формировании иммунного ответа на туберкулезную инфекцию 64
3.4.1. Влияние переноса Т и В лимфоцитов мышей СВА мышам CBA/N на
восстановление их способности к вакцинации 64
3.4.2 Перенос В-клеток также восстанавливает способность к вакцинации
мышей СВАЛЧ 66
3.4.3. Оценка способности мышей линии СВАЛЧ формировать протсктивный
иммунный ответ, при вакцинации сошікатом микобактерий 69
Влияние мутации xid на функции макрофагов 71
Оценка влияния мутации xid на способность макрофагов презентировать антиген Т-лимфоцитам 74
Особенности миграции нейтрофилов мышей линий СВА и CBA/N-xid 76
Оценка экспрессии генов хемокинов, участвующих в миграции нейтрофилов. 81
Эффект блокирования нейтрофилов у мышей СВАЛЧ при вакцинации BCG на последующее заражение туберкулезом 84
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 87
ВЫВОДЫ 92
Список литературы 94
Список сокращений.
АПК - антигенпрезентирующая клетка
ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа
ДК - дендритные клетки
КМ - костный мозг
КОЕ - колониеобразующая единица
КПЭ - клетки перитонеального экссудата
ЛПС - липополисахарид
НАФ - неполный адъюважг Фрейнда
ПП - перитонеальная полость
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ЭП - эмбриональная печень
BCG - Bacillus Calmette-Guerin
Btk - тирозиновая киназа Брутона (Bruton's tyrosine kinase)
FCS — эмбриональная телячья сыворотка ("fetal calf serum")
IFNy - интерферон гамма (interferon у)
Ig - иммуноглобулин (immunoglobulin)
IL - интерлейкин (interleukin)
МНС - главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex)
ТЫ - Т-хелперы первого типа (T-helper)
Th2 - Т-хелперы второго типа (T-helper)
TLR — толл-подобные рецепторы (Toll Like Receptors)
TNFa - фактор некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor а)
Xid - Х-ассоциированный иммунодефицит (X-linked immune deficiency)
XLA - Х-ассоциированной агаммаглобулинемия (X-linked agammaglobulinemia)
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Туберкулез (ТБ) до сих пор является одним из самых распространенных инфекционных заболеваний и остается одной из основных причин гибели людей в мире, что делает проблему его изучения очень актуальной. При соблюдении баланса между собственными защитными реакциями и иммунным ответом хозяина Mycobacterium tuberculosis может, не вызывая реальной болезни, сохранять состояние латентности на протяжении всей жизни инфицированного индивида, что и происходит в 90% случаев [Kaufmann S. Н. Е. 2001, Russell D. G. 2007]. С другой стороны, у 10% инфицированных лиц рано или поздно происходит реактивация латентного туберкулеза. Считается, что возобновление активного размножения микобактерий происходит на фоне снижения иммунитета хозяина. Поскольку реактивация туберкулезного процесса часто сопровождается деструкцией легочной ткани и прорывом очагов в бронхи [Condos R., et al., 1998], возникают условия для воздушно-капельной передачи микобактерий новым хозяевам, что имеет первостепенное значение для выживания популяции возбудителя. Эволюционная стратегия паразитизма микобактерий, по-видимому, сочетает медленно текущий инфекционный процесс (обеспечивает длительную жизнь каждой отдельной бактериальной популяции) и неизбежную реактивацию некоторой небольшой доли латентных популяций (обеспечивает горизонтальную передачу). На сегодняшний момент такое сочетание представляет собой неразрешимую в медицинском аспекте проблему.
Основными средствами борьбы с туберкулезом является его профилактика и применение эффективных терапевтических препаратов. Несмотря на массовую вакцинацию детей BCG и тот факт, что в основном устранен дефицит противотуберкулезных препаратов первого ряда, по данным ВОЗ за 2004 г. в мире зарегистрировано 14,6 млн. больных ТБ, в том числе 8,9 млн. новых случаев. Смертность от ТБ составляет 1,5 - 2 млн. в год [WHO, 2004, Frieden T.R., et al., 2003]. Можно
выделить три основные группы факторов, оказывающих неблагоприятное влияние либо на эпидемическую обстановку, либо на частоту перехода латентной инфекции в активную форму, либо сразу на оба параметра.
Во-первых, это социально-экономические факторы, среди которых выделяются существенное увеличение частоты миграции из неблагополучных по ТБ регионов, недостаток белкового питания, алкоголизм, бездомность и лекарственная иммуносупрессия [Corbett L., Raviglione М. 2005]. Во-вторых, - это широкое распространение и постоянно растущее разнообразие штаммов патогенных микобактерий, устойчивых к антибиотикам. К этой категории относятся штаммы, резистентные к одному - двум препаратам, к нескольким препаратам первого ряда (MDR-штаммы) и ко многим препаратам первого и второго ряда (XDR-штаммы) [Espinal М. A., et al., 2001, Migliori G. В., et al., 2007]. Наконец, в-третьих, на частоту ТБ с клиническими проявлениями существенно влияет пандемия ВИЧ-СПИД [Corbett Е. L., et al., 2003]; так, из 1,7 млн. умерших от ТБ в 2004 г. около 250 тыс. человек были инфицированы ВИЧ [WHO, 2004]. Таким образом, неблагоприятное влияние на ситуацию оказьшают факторы, связанные как с паразитом, так и с хозяином, и все они имеют глобальное распространение и практически не поддаются эффективному контролю.
Для повышения эффективности борьбы с туберкулезом ведется работа в двух основных направлениях. Во-первых, разрабатываются новые лекарственные средства. Во-вторых, продолжаются попытки создать новые вакцины, которые могли бы снизить частоту заболеваемости туберкулезом. Тем не менее, вакцина BCG до сих пор остается единственной используемой на практике противотуберкулезной вакциной. Считается, что вакцинация BCG наиболее эффективна против туберкулезного менингита и детских форм милиарного туберкулеза. Важно отметить, что способносгь отвечать на вакцинацию BCG в различных популяциях людей неодинакова. Так, исследования, проведенные в Индии, показали, что массовая вакцинация детей BCG в одном из штатов была неэффективна
[Bloom B.R., Fine P.E.M., 1994]. По-видимому, одной из важных возможных причин высокой вариабельности ответа на вакцинацию BCG могут быть генетически детерминированные различия ответа на вакцинацию в разных популяциях и у разных индивидов, но этот вопрос никогда подробно не изучался. Более того, до недавнего времени не было описано надежных экспериментальных моделей генетических вариаций ответа на вакцину BCG.
Первая подобная модель была предложена нашей лабораторией. Ранее было показано, что мыши линии CBA/N, наряду с некоторыми другими инбредными линиями, включая мышей СВА, имеют промежуточную чувствительность к туберкулезной инфекции [Niconenko B.V., et al., 1991]. Однако, у мышей CBA/N, в отличие от мышей СВА, после вакцинации BCG не возникает защиты против последующего заражения вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv: среднее время выживания после заражения вакцинированных и невакцинированных мышей CBA/N одинаково [Niconenko B.V., et al., 1996]. Эти данные позволяют рассматривать мышей линии CBA/N как одну из возможных экспериментальных моделей для изучения генетических вариаций ответа на вакцину BCG. Мыши линии CBA/N отличаются от мышей СВА лишь точковой мутацией xid в гене btk, приводящей в первую очередь, к нарушению дифференцировки В-лимфоцитов. Однако эти данные не давали ответа на вопрос о том, какие именно клеточные механизмы, влияющие на Т-зависимый ответ на вакцину, нарушаются при мутации с преимущественной экспрессией в В-лимфоцитах. В связи с этим изучение роли В-лимфоцитов в вакцинном процессе с одной стороны и исследование влияния генетических дефектов В-клеток на формирование Т-клеточного противотуберкулезного иммунитета является актуальной проблемой.
Цель исследования: Изучить особенности иммунного ответа и миграции лимфоидных клеток у мутантных мышей CBA/N и мышей конгенной линии СВА на моделях вакцинации BCG и последующего заражения М. tuberculosis.
Задачи:
Охарактеризовать соотношение клеток иммунной системы и продукцию цитокинов при вакцинации BCG и экспериментальной туберкулезной инфекции у мышей CBA/N и СВА.
Доказать в экспериментах in vivo наличие связи между функционированием клеток иммунной системы и эффективностью вакцинации BCG методами адоптивного переноса.
Исследовать функциональную активность фагоцитов мышей линий CBA/N и СВА in vivo и in vitro.
Оценить роль лимфоцитов В-1 в иммунном ответе на BCG и индукции протективного противотуберкулезного иммунитета.
Исследовать роль нейтрофилов в индукции специфического иммунного ответа при вакцинации BCG мышей CBA/N.
Новизна.
Методом переноса клеток костного мозга мышей линии СВА облученным мышам CBA/N впервые показано, что отсутствие способности к вакцинации BCG мышей CBA/N-xid является следствием дефекта клеток иммунной системы.
Впервые выявлено, что у мышей CBA/N нарушено формирование Т-клеток с фенотипом CD4+, продуцирующих IFNy — основной эффекторный цитокин, активирующий бактерицидную активность макрофагов.
В опытах in vivo впервые показано, что xid-мутация мышей CBA/N способствует тому, что в ответ на введение бактерий BCG нейтрофилы xid мигрируют быстрее и в большем количестве, чем нейтрофилы СВА.
Впервые в опытах in vivo продемонстрировано, что лимфоциты В-1, находящиеся в перитонеальной полости мышей СВА, но отсутствующие у мышей CBA/N-xid, тормозят приток нейтрофилов, а не стимулируют его.
В опытах in vitro впервые показано, что нейтрофилы мышей CBA/N обладают большей подвижностью, чем нейтрофилы мышей СВА.
Впервые исследована динамика экспрессии ключевых хемокинов, участвующих в привлечении нейтрофилов у мышей линии СВА и CBA/N. Показано, что в ответ на введение BCG экспрессия этих факторов носит разнонаправленный характер и коррелирует с динамикой миграции нейтрофилов к месту введения вакцины.
Впервые в опытах in vivo показана негативная роль нейтрофилов при вакцинации BCG мышей CBA/N. Элиминация нейтрофилов за сутки до введения BCG восстанавливает способность к вакцинации у мышей CBA/N.
Практическая значимость. Работа носит экспериментальный характер и посвящена фундаментальной проблеме. Учитывая наличие у человека гена гомологичного xid и слабой изученности роли В-клеток в протективном иммунном ответе при туберкулёзе, полученные данные дают новые представления о механизмах формирования протективного противотуберкулезного иммунитета и о роли В-клеток в этом процессе. Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИТ РАМН.
