Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Адъюванты и современные представления о механизме их действия 14
1.1. Общие сведения об адъювантах 14
1.2. Сложные смеси адъювантов 18
1.3. Системы доставки антигена (носители) 18
ГЛАВА 2. Белки теплового шока - активаторы врожденного и адаптивного иммунитета 22
2.1. Белки теплового шока: общая характеристика 22
2.2. Роль белков теплового шока в активации врожденного и адаптивного иммунитета 23
ГЛАВА 3. Адъювантные свойства белков теплового шока при разработке вакцин против инфекционных заболеваний и злокачественных новообразований 31
3.1. Противоинфекционные и противоопухолевые вакцины на основе белков теплового шока 31
3.2. Анализ возможной роли белков теплового шока в развитии аутоиммунных процессов 40
ЧАСТЬ II. Собственные исследования 47
ГЛАВА I. Материалы и методы 47
1.1. Препараты 47
1.2. Штаммы микроорганизмов 50
1.3. Лабораторные животные 50
1.4. Иммунизация животных 51
1.5. Защита мышей от бактериальной и вирусной инфекции 51
1.6. Определение фагоцитарной активности неитрофилов в НСТ тесте 52
1.7. Культивирование дендритных клеток 53
1.8. Анализ фенотипа дендритных клеток
54 1. Характеристика поверхностных антигенов
мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей 54
1.10. Уровень цитокинов 55
1.11. Определение титров антител в сыворотке крови мышей в РИГА 55
1.12. Определение уровня антител к вирусам гриппа в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА) 56
1.13. Определение антител в ИФА 56
1.14. Определение изотипов и субизотипов иммуноглобулинов в сыворотке крови мышей 57
1.15. Определение аутоантител к антигенам органов и тканей человека 57
1.16. Статистическая обработка данных 58
ГЛАВА 2. Активация врожденного иммунитета при совместном введении рекомбинантного белка теплового шока (rHSP70) с бактериальными антигенами в эксперименте 59
ГЛАВА 3. Активация адаптивного иммунитета при введении рекомбинантного белка теплового шока (rhsp70) с бактериальными и вирусными антигенами 74
3.1. Действие rHSP70 на иммуногенную активность анатоксинов 74
3.2. Действие rHSP70 на иммуногенную активность сложных бактериальных антигенов полисахаридно-белковой природы
3.2.1. Титры антител к антигенам условно-патогенных микроорганизмов, входящих в состав терапевтической поликомпонентной вакцины Иммуновак
3.2.2. Титры антител к клебсиеллезному антигену при 85 конъюгации с rHSP70
3.2.3. Протективная активность и титры антител к 88
антигену стафилококка при введении в смеси с rHSP70
3.2.4.Иммуногенная активность капсульного
полисахарида Haemophilus influenzae типа b в смеси или при конъюгации с rHSP70
3.2.5. Действие белка теплового шока rHSP70 на иммуногенную активность вирусных антигенов
3.2.5.1. Адъювантное действие rHSP70 на титр противогриппозных антител 101
3.2.5.2. Адъювантное rHSP70 на титр антител к антигену Е7 вируса папилломы человека 101
ГЛАВА 4. Влияние белка теплового шока на образование аутоантител при совместном введении с бактериальными и вирусными антигенами 106
Заключение 117
Выводы 125
Литература
- Сложные смеси адъювантов
- Анализ возможной роли белков теплового шока в развитии аутоиммунных процессов
- Определение аутоантител к антигенам органов и тканей человека
- Действие rHSP70 на иммуногенную активность сложных бактериальных антигенов полисахаридно-белковой природы
Введение к работе
Актуальность темы. Широкое внедрение в практику генно-инженерных
технологий, методов очистки и химического синтеза антигенов привело к созданию нетоксичных, но, преимущественно, слабоиммуногенных вакцин [S.H.E Kaufmann., 2004, S.A.Plotkin et al., 2008]. Высокоочищенные бактериальные антигены, полисахариды, рекомбинантные белки, синтетические пептиды и олигосахариды нуждаются в использовании адъювантов, неспецифически усиливающих иммунный ответ [Н.В. Медуницын 1999; N.V. Valiante et al., 2003; S.H.E. Kaufmann, 2004].
В настоящее время в экспериментальных исследованиях и клинических испытаниях применяют адъюванты различного происхождения: минеральные соли (гидроксид или фосфат алюминия и др.); растительные (сапонины - QuilA, QS21); микробные (убитые бактерии, липополисахарид и его производные, CpG-мотивы ДНК), полигликозиды (хитозан) [Т.А. Olafsdottir et al. 2009; J. Kovacs-Nolan et al. 2009].
Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов, для широкого клинического использования разрешены только соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59, а в некоторых странах вирусоподобные частицы (VLP - virus-like particles) и иммуностимулирующий комплекс (ISCOM - immunostimulating complex) [N.V. Valiante et al., 2003; B.C. Baudner et al. 2009].
В последние годы знания о механизме действия адъювантов были существенно дополнены на основе современных достижений, раскрывших новые функциональные возможности системы врожденного иммунитета. Установлено, что врожденный иммунитет участвует не только в быстрой защите организма от инфекции, но и определяет направленность (по Thl/Th2 типу), эффективность и длительность адаптивного иммунного ответа. Исходя из этого, в состав новых вакцин необходимо включать адъюванты, активирующие систему врожденного иммунного ответа [N.V. Valiante et al., 2003].
В этом аспекте перспективными, но малоизученными соединениями, являются белки теплового шока (HSPs - heat shock proteins). HSPs - большая и разнообразная
группа белков, представленных у всех живых организмов. Общее свойство HSPs защита биологических систем от стрессовых воздействий. Способностью индукции иммунного ответа обладают представители нескольких семейств, включ HSP60, HSP70, HSP90 и др., про- и эукариотического происхождения. Болыиинств авторов считают, что белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70 иммунологически является наиболее значимым [M-F Tsan et al. 2004; Ю.Ф Пастухов и др., 2005; П.Г. Свешников и др., 2007].
HSP70 действует на различные пути активации врожденного иммунног ответа [A.Casadeval et al., 2003], поэтому возможность его использования в качеств адъюванта при разработке вакцинных конструкций против инфекций, вызываемы как внутриклеточными, так и внеклеточными возбудителями, являете расширяющейся областью научных исследований [CBarrios et al., 1992; E.Roman є al., 1996; R.Young et al., 1996; J.C. Ferraz et al., 2004; W.M.Bogers et al., 2004; M.Pen et al., 2006 и др.].
Адъювантное действие рекомбинантного белка теплового шока (rHSP70 Mycobacterium tuberculosis на активацию систем врожденного и адаптивног иммунитета при его введении в ассоциациях с бактериальными и вирусным антигенами сложной химической природы, высокомолекулярными белковым соединениями (анатоксины), полисахаридами, а также в составе генно-инженерны конструкций до настоящего времени изучено недостаточно. Противоречивь сведения о вероятности развития аутоиммунных процессов при совместно введении HSPs с бактериальными и вирусными антигенами, что важно вследстви высокой степени гомологии аминокислотных последовательностей этих белков живых организмов. Изучению данных вопросов посвящена настоящая работа.
Цель. Исследование действия рекомбинантного белка теплового шока (rHSP70 Mycobacterium tuberculosis на иммуногенные свойства бактериальных и вирусны антигенов в эксперименте.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние иммунизации смесью бактериальных антигенов с rHSP70 н функциональную активность системы врожденного иммунитета пр
моделировании у животных инфекционных процессов вирусной и бактериальной этиологии.
Исследовать влияние смеси бактериальных антигенов с rHSP70 на функциональную активность нейтрофилов периферической крови мышей, созревание дендритных клеток и продукцию цитокинов.
Оценить стимулирующее действие rHSP70 на систему адаптивного иммунитета при его введении животным в ассоциациях (смесь, конъюгат, химерный генно-инженерный белок) с бактериальными и вирусными антигенами.
Определить способность ассоциаций rHSP70 с бактериальными и вирусными антигенами стимулировать образование у животных анти-Н8Р70-антител.
Выявить потенциальную возможность образования антител, перекрестно-реагирующих с тканевыми антигенами человека, в ответ на введение ассоциаций rHSP70 с бактериальными и вирусными антигенами в составе препаратов различных конструкций.
Научная новизна
Продемонстрировано, что rHSP70 в составе смеси и химического конъюгата с антигенами условно патогенных микроорганизмов, а также химерного генно-инженерного белка Е7 вируса папилломы человека 18 типа является активным стимулятором систем врожденного и адаптивного иммунитета.
В системе врожденного иммунитета впервые показано, что:
введение смеси rHSP70 с антигенами условно патогенных бактерий (вакцина Иммуновак ) повышает устойчивость мышей к сальмонеллезной и гриппозной инфекциям в большей степени, чем введение каждого из исследуемых препаратов в отдельности;
иммунизация мышей смесью rHSP70 с Иммуноваком оказывает более выраженное стимулирующее влияние (по сравнению с действием монопрепаратов) на бактерицидную активность нейтрофилов; созревание дендритных клеток; увеличение числа дендритных клеток, экспрессирующих на мембране Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors - TLRs) 2,4,9 и молекулы МНС класса II, а
также приводит к более ранней продукции TGF0 и тормозит появление в сыворотке крови мышей IL-lp.
- введение мышам смеси или конъюгата rHSP70 с капсульным полисахаридом
Haemophilus influenzae типа b стимулирует экспрессию на мононуклеарны
лейкоцитах селезенки мышей TLRs 2, 4, 9; повышает число дифференцировочных і
активационных маркеров CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, NK, CD3/NK (NKT)
CD4+/CD25+(Treg), CD25+, молекул МНС класса П.
В системе адаптивного иммунитета впервые установлено, что:
- введение мышам смеси или конъюгата rHSP70 с капсульным полисахаридо\
Haemophilus influenzae типа b переключает Т-независимый иммунный ответ на Т
зависимый, о чем свидетельствует повышение числа клеток с фенотипом CD4+ (Т
хелперы), CD25+ (маркер ранней активации Т-хелперов) и молекул МНС класса II;
- иммунизация животных смесью Иммуновака с rHSP70 приводит
повышению титров антиклебсиеллезных и антистафилококковых антител;
- иммунизация мышей смесью нативного дифтерийного анатоксина и rHSP7
вызывает достоверное повышение титров противодифтерийных антитоксически
антител;
иммунизация мышей смесью rHSP70 с субъединичными гриппозным антигенами приводит к повышению титров антител к антигенам вирусов гриппа А В.
использование в качестве антигена генно-инженерной конструкции и химерного белка Е7 вируса папилломы человека 18 типа и HSP70, в значительн большей степени (в 7,8 раза) увеличивает продукцию специфических антител, п сравнению с гуморальными ответом на введение одного рекомбинантного белк Е7(ВПЧ-18);
антитела к химерному белку E7(BIT4-18)-HSP70 перекрестно реагируют рекомбинантным белком Е7(ВПЧ-16);
- иммунизация химерным белком Е7(ВПЧ-18) - HSP70 приводит к увеличени
образования IgGl- и ^С2Ь-антител и снижению продукции 102а-антител, чт
свидетельствует о поляризации иммунного ответа по Th2 пути.
Впервые установлено, что введение животным rHSP70, ассоциированного с бактериальными и вирусными антигенами, в составе препаратов различных конструкций, не вызывает образования анти-Н8Р70-антител, перекрестно-реагирующих с общими тканевыми антигенными эпитопами человека.
Практическая значимость
rHSP70 можно рассматривать в качестве потенциального кандидата в адъюванты при конструировании бактериальных и вирусных вакцин. Конъюгация rHSP70 с полисахаридными антигенами дает возможность использовать его для индукции Т-зависимого иммунного ответа, повышения эффективности иммунизации и формирования иммунологической памяти. Химерный белок Е7 вируса папилломы человека 18 типа может быть использован для получения моноклональных антител, разработки диагностических тест-систем, а также при создании профилактических и лечебных препаратов против инфекций, вызванных вирусами папилломы человека 16 и 18 типов.
Основные положения, выносимые на защиту
1) rHSP70 в ассоциации с бактериальными антигенами в составе препаратов
различных конструкций стимулирует функции системы врожденного иммунитета,
что проявляется в активации нейтрофилов; созревании дендритных клеток,
увеличении числа дендритных клеток, экспрессирующих TLRs 2, 4, 9 и молекулы
МНС класса II. Следствием этого является быстрое повышение устойчивости
мышей к инфекциям бактериальной и вирусной этиологии.
2) rHSP70 оказывает адъювантное действие при активации системы
адаптивного иммунитета, способствуя повышению титров антител к бактериальным
и вирусным антигенам.
3) rHSP70 в ассоциации с бактериальными и вирусными антигенами в составе
препаратов различных конструкций (при использованных схемах и дозах введения)
вызывает у животных образование анти-Н8Р70-антител, не обладающих
перекрестной реактивностью с тканевыми антигенами человека.
Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены: на 5-ом Всемирном конгрессе по иммунологии и аллергологии (получен
сертификат победителя конкурса молодых ученых), Москва 2007; на конференци молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН, посвященно 100-летию присуждения Нобелевской премии И.И.Мечникову (Москва, 2009); конференции отдела иммунологии НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечнико РАМН (2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 14
Сложные смеси адъювантов
Внутриклеточные белки, объединенные в семейство белков теплового шока (heat shock proteins - HSPs), получили свое название в связи с тем, что впервые были идентифицированы у дрозофил при воздействии высокой-температуры [134]. Оказалось, что эти белки имеются у всех биологических существ - от бактерий до человека. Считается, что это самое консервативное семейство белков, так как их межвидовая гомология достигает 70%. Все HSPs делятся на 5 групп по молекулярной массе Hsp ПО, Hsp90, Hsp70, Hsp60 и низкомолекулярные Hsp. HSPs играют исключительную роль в жизнедеятельности клеток организма. HSP70 и некоторые другие HSPs выполняют шаперонную функцию, включающую способность узнавать и связывать вновь синтезированные полипептидные цепи, складывать их в активные молекулы белков, предотвращать агрегацию и денатурацию белков. HSPs контролируют работу клеток- и способствуют их выживанию в агрессивном окружении.
HSPs находятся в цитоплазме и ядре эукариот (исключением является HSP60, который присутствует в митохондриях) [43, 48, 56]. Присутствие HSPs в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме, практически всех эукариотических клеток, свидетельствует О большом разнообразии выполняемых ими функций.
Продукция HSPs индуцируется стрессовыми факторами (температурный или холодовой шок, воспаление, лихорадка, оксидантный шок, присутствие в организме алкоголя и тяжелых металлов), а также состояниями, вызываемыми повреждением и некрозом тканей (инфицирование, травма, ишемия). Наиболее типичной реакцией клеток в ответ на тепловой шок является переход внутриклеточного HSP70 из цитоплазмы в ядро, а позднее (через 18-24 ч) увеличение его концентрации в цитоплазе клеток в 40-50 раз [5]. HSPs ослабляют степень повреждения и разрушения белков, вызванных различными стрессорными факторами, связываются со свободными гидрофобными частями полипептидов и поддерживают функцию основных клеточных механизмов во время стресса.
Связывая белки с нарушенной конформацией, образующиеся внутри клетки при любых стрессовых ситуациях, включая, внутриклеточные вирусные и бактериальные инфекции, опухолевое перерождение клетки и т.д., HSPs обеспечивают их утилизацию через протеолитическую деградацию, освобождая клетку от нефункциональных белковых структур, угрожающих ее жизнедеятельности. HSPs могут находиться как в свободном состоянии, так и в комплексе со специфическими белками. [42, 58, 104-106, 147].
Ранее HSPs считали исключительно внутриклеточными белками. В настоящее время известно, что некротические (но не апоптотические) клетки могут высвобождать HSPs. Внеклеточно локализованные HSPs вовлекаются в воспалительный процесс, что проявляется в стимуляции ими продукции цитокинов и хемокинов, созревании ДК, активации ядерного фактора транскрипции (NF-KB) [26, 157]. Это приводит к активации иммунного ответа [128]. В организме роль HSPs в развитии реакций врожденного и приобретенного иммунитета определяется способностью перехватывать антигенные пептиды и через взаимодействие с антигенпрезентирующими клетками (АПК) репрезентировать эти антигены Т-лимфоцитам в контексте молекул МНС [147].
HSPs содержат в своем составе лиганды для связывания с патогенраспознающими рецепторами (TLRs, скавернджер-рецепторы, рецепторы NK-клеток и др.) клеток врожденного иммунитета.
Toll-подобные рецепторы (TLRs). Рекомбинантный очищенный HSP70 M.tuberculosis через связывание с TLR2 и TLR4 дозозависимо индуцировал in vitro активацию NF-кВ в эндотелиальных клетках человека, а в макрофагах мышей, наряду с этим, и выработку провоспалительных цитокинов, фактора некроза опухоли-а (TNFa) и IL-6 [39]. Эффект HSP70 усиливался в присутствии растворимой формы CD 14 (рецептор для ЛПС). HSP 65 M.tubercalosis взаимодействовал только с TLR4 [32, 39].
Некоторые исследователи полагают, что иммуностимулирующий эффект бактериальных HSPs обусловлен контаминацией ЛПС или другими лигандами для TLRs [111, 159]. Известно, что ЛПС активируют дендритные клетки (ДК) при участии TLR4. Некоторые исследователи утверждают, что в случае отсутствия ЛПС в вакцинах на основе HSPs, последние не способны активировать АПК и, соответственно, именно ЛПС, а не HSP, индуцирует созревание АПК [28, 62]. Сторонники такой интерпретации взаимодействия HSPs с TLRs оспаривают надежность приемов (нейтрализация ЛПС полимиксином В; кипячение, в результате которого денатурируется HSP и сохраняется термостабильный ЛПС), применявшихся для разобщения эффектов собственно HSP и ЛПС как контаминанта. Тем не менее, ряд других исследований демонстрирует способность вакцин на основе HSP, очищенных от ЛПС, стимулировать АПК [116, 163]. В отношении TLR-зависимого эффекта микобактериальных HSP65 и HSP70 получены убедительные доказательства. А именно, расщепление HSP протеиназой К отменяло индуцируемую им активацию NF-кВ в макрофагах. Высокоочищенные микобактериальные HSPs сохраняли способность стимулировать ДК через TLRs [39]. Другим аргументом является то, что эукариотические HSP70 и глюкозо-регулируемые HSPs - gp96, выделенные из ткани печени и почек мышей, активировали макрофаги и ДК. HSP70 и gp96 человека, полученные in vitro и, следовательно, свободные от бактериальных контаминантов, эффективно активировали макрофаги через TLR2HTLR4[87].
Анализ возможной роли белков теплового шока в развитии аутоиммунных процессов
Целью настоящего раздела работы явилось исследование активации врожденного иммунитета на моделях инфекциий бактериальной и вирусной этиологии у мышей при введении бактериальных антигенов в смеси с рекомбинантным микобактериальным белком теплового шока (rHSP70). В качестве бактериальных антигенов мы использовали сложный липополисахаридно-белковый комплекс, являющийся активным действующим началом терапевтической вакцины из условно патогенных микроорганизмов - Иммуновак, и стафилококковый антиген, входящий ее состав. Иммуновак содержит лиганды для Толл-подобных рецепторов (Tolllike receptors LRs) - TLR1/2, TLR4, TLR5, TLR2/6, TLR9 клеток-эффекторов системы врожденного иммунитета. Некоторые авторы считают, что эффект действия rHSP (при клонировании в Escherichia coli или в других грамотрицательных бактериях), обусловлен контаминацией ЛПС, который является лигандом для TLR4.
При планировании экспериментов мы исходили из того, что в Иммуноваке содержится большое количество ЛПС (144 мкг/мг), a rHSP70 содержит примесь ЛПС в количестве - 0,185-0,226 мкг/мг. Проведение этих опытов позволяет разобщить эффект действия ЛПС и собственно rHSP70, так как его незначительная примесь в rHSP70 (в 637-778 раз меньше, чем в Иммуноваке) не может оказать существенного влияния на исход опытов. Для этого проведены исследования на модели инфекции, вызванной S.typhimurium у мышей.
В I опыте исследовали влияние смеси Иммуновака в дозе 200 мкг (доза, рекомендуемая для человека) с различными концентрациями rHSP70 (от 1 до 100 мкг) на устойчивость мышей к заражению S.typhimurium при 1-кратном введении. Препараты вводили одновременно внутрибрюшинно в разных шприцах. Заражение проводили через 24 часа после иммунизации. В качестве групп сравнения использовали Иммуновак в дозе 200 мкг и rHSP70 в дозе 100 мкг. Во всех исследованных группах протективный эффект проявлялся в задержке развития инфекции в течение первых 5 суток после заражения (табл.1). Наибольшая выживаемость мышей в этот срок, составляющая 70% (Z=2,69), выявлена при введении Иммуновака в дозе 200 мкг. rHSP70 в дозе 100 мкг защищал от заражения 50% мышей (Z=2,25).
Введение смеси Иммуновака с разными дозами rHSP70 обеспечило выживаемость от 40 до 60% животных. Последнее значение получено при одновременном введении Иммуновака с rHSP70 в дозах 200 и 10 мкг, соответственно, (Z=2,96). Исследования по определению оптимальных схем и доз введения этих препаратов были продолжены.
Во II опыте испытывали различные дозы и схемы введения препаратов. Было сформировано 10 групп мышей. Из них 1-я группа привита Иммуноваком как в предыдущем опыте 1-кратно внутрибрюшинно. Группы со 2-ой по 7-ю иммунизированы Иммуноваком 3-кратно внутрибрюшинно в дозах 20 или 200 мкг с разными интервалами (1-2 суток или ежедневно); 8-я группа получала rHSP70 3-кратно ежедневно в дозе 10 мкг; 9-я группа -смесь Иммуновака (20 мкг) с rHSP70 (10 мкг); 10-ой группе препаратов не вводили и использовали в качестве контроля заражающей дозы.
Однократное введение большой дозы Иммуновака (400 мкг) (опыт II, группа 1) способствовало увеличению продолжительности жизни мышей, и на 5 сутки наблюдения выжило 50% мышей при гибели 90% животных в контроле. При 3-кратном введении Иммуновака с интервалом 2 суток обе испытанные дозы (20 и 200 мкг) обеспечивали выживаемость 77,7-80% (Z=2,73 и 3,08 соответственно) животных, тогда как при сокращении интервала до 1 суток выявилось преимущество введения малых доз препарата. Ежедневное 3-кратное введение Иммуновака в дозе 200 мкг приводило к снижению выживаемости мышей до 30%, тогда как введение малых доз (20 мкг) было эффективным и при этой схеме иммунизации на 5 сутки наблюдения выживало 66,7% животных. Таблица 1
Индукция устойчивости мышей к заражению S.typhimiirhim после введения смеси Иммуновака с rHSP70 №№ опыта №№ группы Препарат для иммунизации Схема иммунизации Разовая доза , мкг Количество выживших мышей из числа взятых в опыт Z Р кратность интервал, сут Иммуновак rHSP на 5 сутки (%) на 21 сутки I 1 Иммуновак 1 - 200 - 7/10 (70) 0/10 2,69 0,01 rHSP70 1 - - 100 5/10 (50) 1/10 2,25 0,05 Иммуновак+гН8Р70 -«- - 200 1 4/10 (40) 0/10 2,42 0,02 -«- -«- - 200 10 6/10 (60) 0/10 2,96 0,005 -«- -«- - 200 100 5/10 (50) 0/10 1,26 0,05 Контроль - - - - 0/10 (0) 0/10 - II 1 Иммуновак 1 - 400 - 5/10 (50) 0/10 1,77 0,05 -«- 3 2 20 - 8/10 (80) 2/10 3,08 0,005 -«- -«- -«- 200 - 7/9 (77,7) 0/9 2,73 0,01 -«- 3 1 20 - 7/10 (70) 1/10 3,07 0,005 -«- -«- -«- 200 - 4/9 (44,4) 0/10 2,88 0,005 -«- 3 ежедневно 20 - 6/9 (66,7) 1/9 2,76 0,01 -«- -«- -«- 200 - 3/10 (30) 0/10 1,37 0,05 rHSP70 -«- -«- - 10 4/10 (40) 0/10 2,65 0,01 Иммуновак rHSP70 3 -«- 20 10 9/10 (90) 1/10 3,40 0,005 Контроль - - - - 1/10 (10) 0/10 - Примечание. 1) - Z - критерий значимости (на 21 сутки наблюдения) [С.А.Гланц, 1999]; 2) р - достоверность разности между опытом и контролем; 3) все группы мышей заражены внутрибрюшинно S.typhimiirhim в дозе 10б микробных клеток в объеме 0,5 мл через 24 часа после иммунизации; 4) заражающая доза 200 LD5o; 5) контроль - не иммунизированные мыши. Полученные результаты показали, что при 1-кратном введении Иммуновака оптимальными являются дозы 200-400 мкг. При многократном введении Иммуновака, для достижения протективного эффекта, можно снизить дозу до 20 мкг, а при введении больших доз (200 мкг) необходимо увеличить интервал между его введениями не менее чем до 2 суток.
В опыте II иммунизацию мышей смесью Иммуновака с rHSP70 проводили ежедневно 3-кратно в дозах 20 и 10 мкг, соответственно (группа 9). Эта схема и дозы введения смеси препаратов выбраны потому, что в настоящем исследовании, для Иммуновака, наиболее выраженный защитный эффект получен при 3-кратном введении препарата в дозе 20 мкг. Лучшие результаты при иммунизации мышей rHSP70 продемонстрированы при 3-кратном ежедневном введении дозы 10 мкг [8]. В данном опыте при 3-кратном ежедневном введении смеси Иммуновака с rHSP70 в дозах 20 и 10 мкг, соответственно, получен наиболее высокий защитный эффект (выживаемость 90% мышей, Z=3,4) по сравнению с другими исследуемыми группами.
Более высокая устойчивость мышей к заражению S.typhimurium через 24 ч после иммунизации при введении смеси Иммуновака с rHSP70 по сравнению с монопрепаратами, позволяет предположить, что действие rHSP70 связано не только с примесью ЛПС, а обусловлено наличием в его составе других структур, обладающих иммуностимулирующей активностью.
В следующих опытах мы попытались оценить протективную rHSP70 на модели локальной стафилококковой инфекции у мышей. Белых беспородных мышей иммунизировали Иммуноваком по выбранной в предыдущем опыте схеме, то есть 3-кратно ежедневно в дозе 20 мкг и смесью Иммуновака с rHSP70 в дозах 20 и 10 мкг, соответственно. Через 24 ч мышей заражали введением в подушечку левой лапы 2x109 микробных клеток штамма S.aureus 1986, а в подушечку правой лапы вводили 0,9% раствор натрия хлорида (табл 2).
Определение аутоантител к антигенам органов и тканей человека
В этом опыте нам также не удалось.выявить различий в протективной активности между исследуемыми препаратами и титры AT не коррелировали с защитой от инфекции.
В этом исследовании было установлено, что- лучше использовать модель генерализованной стафилокковой инфекции при введении! больших доз препаратов - 200 мкг для стафилококкового антигена и 100 мкг для оценки адъювантного действия rHSP70.
Для» того чтобы выяснить, почему иммунизация» стафилококковыми препаратами приводила к. более выраженной воспалительной реакции,- у животных был определен уровень цитокинов (табл. 27). Сыворотку крови исследовали после 3-кратной иммунизации стафилококковым» антигеном и смесью стафилококкового антигена с rHSP70 в дозах 200 и 100 мкг соответственно. Интервал между иммунизациямисоставил,Г4 суток.
Примечание. 1) доза стафилококкового антигена 200 мкг; доза? смеси стафилококкового антигена rHSP70 (200+100) мкг; 2) иммунизация 3-кратно с интервалом 14 суток; 3) сыворотки получены на 11 сутки после последней иммунизации; 4) в скобках указана степень повышения показателя по сравнению с контролем;- 5) контроль — не иммунизированные.
На 11 сутки после иммунизации большинство исследованных цитокинов в сыворотке крови не определялись. Уровень IL-4 и IL-12p70 не имел различий с контрольной группой. Наиболее выраженные изменения определены в содержании TGFp, участвующего в торможении иммунного ответа. В опытных группах его уровень был в 2-8,7 раза ниже, чем в контроле. Этим можно обяснить более выраженное местное воспаление в лапке мышей при введении стафилококкового антигена и его в смеси с rHSP70.
Суммируя все представленные в этом разделе данные, можно сделать заключение о том, что стафилококковый антиген, обладая достаточно слабыми антигенными свойствами, нуждается в использовании адъювантов. Это подтверждается полученными нами данными, когда в составе вакцины Иммуновак, содержащей в своем составе ЛПС в качестве природного адъюванта, титры AT к стафилококку при введении в смеси с rHSP70 достоверно повышались. Однако введение стафилококкового антигена с rHSP70, по-видимому, было недостаточным для индукции AT и защиты от заражения, поэтому для усиления иммуногенных свойств стафилококкового антигена, вероятно, следует использовать коадъювант (еще одно соединение с адъювантными свойствами) для индукции выраженного адаптивного иммунитета.
Наряду с использованием высокомолекулярных соединений сложной химической природы исследовали действие rHSP70 на иммуногенную активность капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b (КІШіЬ), представляющего собой полирибозил-рибитолфосфат.
Конъюгация с белком является необходимым условием для получения эффективных полисахаридных вакцин, так как полисахаридные антигены капсульных бактерий при введении в организм вызывают Т-независимый ответ без участия CD4+ Т-лимфоцитов [92, 173]. При использовании белка-носителя активируются CD4+ Т-лимфоциты, и происходит переключение классов иммуноглобулинов, созревание аффинности антител, формируется иммунологическая память.
В связи с этим было проведено изучение действия rHSP70 на активацию систем врожденного и адаптивного иммунитета при введении в ассоциации с КПНіЬ.
В работе использовали КПНіЬ, полученный с помощью осаждения цетавлоном. Конъюгат КПНіЬ с rHSP70 получали при использовании глютарового альдегида.
Исследование проводили на мышах линии СВА. Для оценки действия rHSP70 на индукцию иммунного ответа к КПНіЬ использовали 2 и 3-кратную схемы иммунизации с интервалами 21 или 14 дней, соответственно. КПНіЬ вводили внутрибрюшинно мышам в дозе 5 мкг. В составе смеси также вводили 5 мкг КПНіЬ и rHSP70 в дозах 20 или 100 мкг. Доза конъюгата по КПНіЬ составляла 5 мкг, в пересчете по rHSP70 - 16,75 мкг. В каждой группе было по 6 мышей.
Активацию системы врожденного иммунитета при введении КПНіЬ и КПНіЬ с rHSP70 исследовали по экспрессии Толл-подобных рецепторов (Toll-like receptors - TLRs), продукции цитокинов, определению маркеров мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей через 12 дней после 3-кратной иммунизации (табл. 28). Установлено, что КПНіЬ, у которого нет лигандов для связывания с TLRs, не вызывал повышения уровня экспрессии TLR 2, 4, 9. В группах мышей, получавших смесь КПНіЬ с rHSP70, выявлено значительное повышение уровня TLR 2, 4, 9 по сравнению с контролем. При этом уровень TLR 2, повышался в 12 раз независимо от дозы rHSP70 (20 или 100 мкг), или использования химической конъюгации. Повышение TLR 4 в 3,1 и 3,7 раза было выявлено только в группах мышей, получавших смесь КПНіЬ с rHSP70 в дозах 20 и 100 мкг, соответственно.
Действие rHSP70 на иммуногенную активность сложных бактериальных антигенов полисахаридно-белковой природы
При исследовании действия смеси rHSP70 на образование титров AT к антигенам, входящим в состав вакцины Иммуновак, установлено, что повышение титров AT при испытанных схемах и дозах введения препарата происходило к антигенам, обусловившим в данном опыте меньшее повышение уровня AT (клебсиеллезный, стафилококковый). При иммунизации смесью Иммуновака с rHSP70 образование AT происходило в большей степени (в 2,6 и 4,3 раза соответственно).
Однако при использовании стафилококкового антигена на модели генерализованной стафилококковой инфекции при разных схемах и дозах иммунизации не было выявлено преимущества в использовании rHSP70. Более того, на модели локальной стафилококковой инфекции, при использовании различных схем и доз введения препаратов, мы также не получили разницы в степени воспалительной реакции в лапке мышей, зараженной штаммом стафилококка, при использовании смеси стафилококкового антигена с rHSP70, по сравнению с контролем. Тем не менее, по сравнению с монопрепаратами (стафилококковый антиген или rHSP70) реакция была менее выраженной. Существенного повышения титров AT к стафилококковому антигену выявлено не было. Это предполагает, что для стафилококкового антигена необходимо использование помимо rHSP70 дополнительного адъюванта, так как в составе вакцины Иммуновак, содержащей ЛПС и другие иммунодоминантные соединения, титр AT к стафилококку повышался.
Хорошей моделью для исследования иммунологической активности rHSP70 являлся капсульный полисахарид Н. influenzae типа b (КПНіЬ). Были использованы разные схемы и дозы введения препаратов. Установлено, что КПНіЬ не стимулировал исследованные нами реакции врожденного иммунитета, тогда как под влиянием КПНіЬ в ассоциации с rHSP70 происходила активация врожденного иммунитета, что проявлялось в значительном повышении уровня TLRs 2, 4, 9, а также увеличении числа лимфоцитов с маркерами CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, NK, CD3/NK (NKT), CD25+, МНС класса П. Повышение уровня CD4+ (Т-хелперы), CD25+ (маркер ранней активации Т-хелперов) и увеличение содержания МНС класса II можно расценивать как переключение Т-независимого иммунного ответа на Т-зависимый. Химическая конъюгация КПНіЬ с rHSP70 оказалась в данном случае менее эффективной, чем введение смеси антигенов, возможно за счет экранирования активных антигенных детерминант. При исследованных схемах и сроках взятия крови разницы в титрах AT к КПНіЬ между препратами выявить не удалось. Возможно, была необходима бустерная инъекция препаратов.
При использовании rHSP70 с субединичными гриппозными антигенами, входящими в состав полуфабриката гриппозной инактивированной трехвалентной вакцины, было выявлено повышение титров антител к вирусам гриппа A/HiNi и В в 2 и 4 раза соответственно.
Наиболее сильное адъювантное действие HSP70 было выявлено при использовании химерного генно-инженерного белка вируса папилломы человека (ВПЧ) E7(BII4-18)-rHSP70. Использование HSP70 в составе химерного белка E7(Bn4-18)-HSP70 приводило к повышению титров AT к белку Е7 в 7,8 раза по сравнению с монопрепаратом (рекомбинантный белок Е7). При этом выявлена перекрестная антигенная активность с рекомбинантным белком Е7(ВПЧ) 16 типа. Повышение уровня IgGl, IgG2b и снижение IgG2a свидетельствовало о поляризации иммунного ответа по Th2 пути.
Исследование уровня анти-Н8Р70-АТ при совместном введении rHSP70 с бактериальными и вирусными антигенами различной природы в смеси, при конъюгации или в составе химерного белка было проведено с целью оценки его безопасности при введении в организм животных. При использовании различных препаратов (анатоксины, гриппозные антигены, стафилококковый антиген, капсульный полисахарид) было установлено, что введение rHSP70 с различными антигенными препаратами приводит к повышению титров анти-Н8Р70-АТ, за исключением анатоксинов. Отстуствие анти-Н8Р70-АТ при совместном введении с анатоксинами может быть связано с их постепенным разрушением или нейтрализацией эндогенными HSP70, присутствующими в организме мышей, так как исследование проводили более чем через 5 недель после последней иммунизации. При введении препаратов без rHSP70 титры анти-Н8Р70-АТ практически не отличались от контрольных значений. Высокие значения титров AT, превышающие контрольные в 10,1-17,5 раза были получены при введении стафилококкового антигена и смеси капсульного полисахарида с rHSP70, а также при использовании химически конъюгированных препаратов. При этом доза антигена, вводимого с rHSP70, не имела существенного значения. Наибольшее повышение титров анти-Н8Р70-АТ (в 178,1 раза по сравнению с не иммунизированными животными) было получено при исследовании химерного генно-инжерерного белка Е7 вируса папилломы человека 18 типа.
Определение титров IgG-AT к антигенам органов и тканей человека показало, что присутстие AT к rHSP70 в сыворотке крови иммунизированных животных не приводило к образованию перекрестно-реагирующих AT, имеющих общие эпитопы с антигенами органов и тканей человека при испытанных дозах и схемах иммунизации, а иммунизация rHSP70 не вызывала поликлональной активации В-клеток.
Полученные данные свидетельствуют о целесообразности проведения исследований в направлении изучения адъювантных свойств rHSP70 в отношении других антигенов, причем при их введении не только с rHSP70, но и в сочетании с другими адъювантами.
