Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Искусственные антигены и иммуномодуляторы 9
1.1. Механизм иммуногенеза 11
1.2. Искусственные антигены, построенные по принципу природных аналогов 17
1.3. Искусственные иммуномодуляторы 23
1.4. Искусственные антигены, не имеющие аналогов в природе 31
Глава 2. Проблема Ir-генного контроля иммуногенеза 35
2.1. Генетика иммунного ответа на искусственные антигены 35
2.2. Проблема фенотипической коррекции иммуногенеза 44
Глава 3. Материалы и методы исследования 48
3.1. Синтетические полиэлектролиты 48
3.2. Антигены 49
3.3. Животные 50
3.4. Приготовление клеточных суспензий 51
3.5. Метод определения количества антителообра-зующих клеток методом локального гемолиза в агарозном геле (Jeme U.K., iforuin АЛ., 1963) 52
3.5.1. Сенсибилизация эритроцитов барана (Т,Г)-А-Л (Taussig М.J. et al., 1974) 53
3.5.2. Сенсибилизация эритроцитов барана тринит-рофенилом (Ritteiiberg М»В., Pratt K.L., 1969) 54
3.5.3. Прописи буферных растворов 55
3.6. Изучение влияния синтетических полиэлектролитов на иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л 55
3.6.1. Облучение мышей 55
3.6.2. Моделирование кооперации Т- и В-клеток в системе адоптивного переноса 55
3.6.3. Получение активированных Т-клеток 56
3.6.4. Изучение первичного и вторичного иммунного ответа на конъюгат (Т,Г)-А-Л-ТНФ 56
3.6.5. Изучение влияния синтетических полиэлектролитов на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) на (Т,Г)-А-Л 58
3.7. Исследование иммунологических свойств конъюгата антиген-полиэлектролит 58
3.7.1. Первичный и вторичный иммунный ответ на конъюгаты (Т^-А-Л с полиэлектролитами 58
3.7.2. Исследование тимусзависимости конъюгата (Т,Г)-А-Л-полиэлектролит 59
3.7.3. Реакция гиперчувствительности замедленного типа на конъюгат (Т,Г)-А-Л-полиэлект-ролит 59
3.8. Статистическая обработка данных 59
Глава 4. Влияние синтетических полиэлектролитов на иммунный ответ на искусственный антиген (Т,Г)-А-Л 61
4.1. Гуморальный иммунный ответ 61
4.1.1. Взаимодействие Т- и В-лимфоцитов в системе адоптивного переноса 61
4.1.2. Влияние синтетических полиэлектролитов на кооперацию Т- и В-клеток 63
4.1.3. Влияние синтетического полиэлектролита на процесс активирования Т-клеток 66
4.1.4. Влияние синтетических полиэлектролитов на иммунный ответ на конъюгат (Т,Г)-А-Л-ТНФ 67
4.2. Клеточно-опосредованный иммунный ответ 71
4.2.1. Влияние синтетических полиэлектролитов на реакцию гиперчувствительности замедленного типа на (Т,Г)-А-Л 71
Глава 5. Фенотипическая коррекция Ir-генного контроля иммунного ответа конъюгатами (Т,Г)-А-Л с синтетическими полиэлектролитами 75
5.1. Гуморальный иммунный ответ 75
5.1.1. Первичный иммунный ответ на конъюгаты (Т,Г)-А-Л с синтетическими полиэлектролитами 75
5.1.2. Вторичный иммунный ответ на конъюгаты (Т,Г)-А-Л с синтетическими полиэлектролитами 77
5.1.3. Тимуснезависимость иммунного ответа на конъюгат (Т,Г)-А-Л-полиэлектролит 79
5.2. Клеточно-опосредованный иммунный ответ 82
5.2.1. Реакция гиперчувствительности замедленного типа на конъюгат (Т,Г) -А-Л-полиэлектролит 82
3аключение 85
Выводы 107
Список литературы 108
- Механизм иммуногенеза
- Генетика иммунного ответа на искусственные антигены
- Синтетические полиэлектролиты
- Взаимодействие Т- и В-лимфоцитов в системе адоптивного переноса
- Первичный иммунный ответ на конъюгаты (Т,Г)-А-Л с синтетическими полиэлектролитами
Введение к работе
Актуальность темы.
Поиск, создание и изучение механизмов действия иммуностимуляторов является одной из основных задач практической и теоретической иммунологии. Этот вопрос тесно связан с проблемой феноти-пической коррекции генного контроля иммунного ответа, т.е. перевода генетически низкореагирующих на определенные антигены особей в высокореагирующие. Пониженная реактивность к конкретным антигенам, контролируемая генетически, экспрессируется преимущественно на уровне Т-системы лимфоцитов. Поэтому основное внимание должно быть уделено компенсации функций Т-клеток.
В последние годы найдены природные и искусственные полимеры, обладающие выраженной адъювантной активностью. Их можно разделить на три группы: 1) природные высокополимерные соединения (бактериальные и растительные полисахариды, гликопротеиды, липополиеаха-ридные комплексы, нуклеиновые кислоты (Доклад научной группы ВОЗ, 1978); 2) искусственно синтезированные аналоги природных полимерных соединений (полипептиды, полинуклеотиды) (В.М.Земсков, 1973; Schmidtke J.R. et al., 1971} Vogt W. et al., 1973); 3) искусственно синтезированные полимеры, не имеющие аналогов в природе (синтетические полиэлектролиты - полианионы, поликатионы, полиам-фолиты) (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1978).
Иммуностимулирующие свойства синтетических карбоцепных полиэлектролитов были открыты сравнительно недавно. Механизм их действия на иммуногенез связан со способностью полиэлектролитов замещать функцию Т-хелперов и усиливать отдельные этапы иммуногене-неза - пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток, Т- и В-лимфоцитов, кооперацию Т- и В-клеток в иммунном ответе (Р.В. Петров и соавт., 1974,1975; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1976,1978). Совместными исследованиями коллективов, руководимых академиком Р.В.Петровым, профессором Р.М.Хаитовым, членом-корреспондентом АН СССР В.А.Кабановым, разрабатывается принципиально новый подход к созданию искусственных выеокоиммуногеиных препаратов - получение искусственных антигенов, представляющих собой комплексы гаптенов или слабоиммуногенных молекул с неприродными полиэлектролитами, обладающими способностью к кооперативному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток.
Так, комплексирование гаптенов (Р.В.Петров и соавт., 1977) или слабоиммуногенных белков (В.А.Кабанов и соавт., 1978, 1980; Р.В.Петров и соавт., 1979,1981) с молекулами полиэлектролитов позволило получить макромолекулы, обладающие резко повышенной имму-ногенностью.
Иммунный ответ на синтетический полипептид (Т,Г)-А-Л контролируется ІГ-1А геном (McDevitt Н.О., Sela M»r 1965»1967? Вепасег-r.af В., 1974-J McKenzie I.F.C., Henning MJvl., 1977? Klein J. et al., 1978r Benacerraf в., Germain Е.Ы., 1978). Генетически детерминированная низкая отвечаемость особей на конкретные антигены делает важнейшей проблему фенотипической коррекции иммунного ответа. Эти искусственные антигены оказались Т-независимыми. Известно, что lr-гены проявляют свое действие преимущественно на уровне Т-клеток. Отсюда возникла идея, что создание Т-независимых антигенов - это путь к фенотипической коррекции іг-генного контроля иммунного ответа.
Цель и задачи исследования.
Целью нашего исследования явилось изучение возможности фенотипической коррекции иммунного ответа, контролируемого ІГ-1А ге- ном, с помощью синтетических полиэлектролитов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
На различных экспериментальных моделях исследовать влияние полиэлектролитов - полиакриловой кислоты (ПАК), поли-4-винил-пиридина (ПВП), сополимера акриловой кислоты (АК) и н-виншшир-ролидона (н-ВПД) - НА, а также модифицированного НА (мна) на гуморальный иммунный ответ на синтетический полипептидный антиген (Т,Г)-А-Л.
Исследовать способность полиэлектролитов воздействовать на клеточно-опосредованный иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л.
Создать полностью искусственный антиген - синтетический полипептид - синтетический полиэлектролит путем конъюгирования (Т,Г)-А-Л с ПАК, на и МНА, обеспечивающий фенотипическую коррекцию генного контроля иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л.
Исследовать тимусзависимость конъюгата полипептид-полиэлектролит .
Научная новизна результатов исследований.
В отличие от других исследований в нашей работе впервые изучен иммунный ответ на конъюгаты синтетического полипептидного антигена (Т,Г)-А-Л с неприродными полиэлектролитами - ПАК, НА и МНА, была показана его тимуснезависимость и исследована возможность фенотипической коррекции иммунного ответа, контролируемого Іг-ТА геномі Впервые показана возможность усиления кооперации Т- и В-лимфоцитов с помощью синтетических полиэлектролитов в системе адоптивного переноса в иммунном ответе на (Т,Г)-А-Л и способность полиэлектролитов усиливать процесс активирования Т-хел-перов (Т,Г)-А-Л. Исследовано влияние синтетических полиэлектролитов на иммунный ответ на конъюгат (Т,Г)-А-Л-тринитрофенил (ТНФ). Кроме того, показана возможность коррекции не только гуморально- го, но и клеточного ответа на (Т,Г)-А-Л на модели реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ).
Научно-практическая ценность работы.
Данная работа является частью комплексной программы создания выеокоиммуногеиных искусственных иммунизирующих препаратов, которые представляют собой антигены или их детерминанты, соединенные с синтетическими неприродными носителями, обладающими иммуностимулирующими свойствами. Нами исследованы некоторые ранее не известные механизмы иммуностимулирующего действия нетоксичных искусственных иммуноадъювантов - сополимеров акриловой кислоты и N-винилпирролидона, установлена возможность "обхода" генетически предетерминированной низкой отвечаемости и возможность создания полностью искусственного тимуснезависимого антигена (Т,Г)-А-Л-по-лиэлектролит.
Исследования, проведенные с применением искусственных антигенов нового типа, - важный этап на пути к решению проблемы фено-типической коррекции иммунного ответа, что является одним из подходов к получению искусственных вакцин.
Работа выполнена в рамках Государственной программы 0.69.07 "Исследовать генетические и молекулярные механизмы нарушений иммунитета и наследственных болезней и разработать на этой основе способы их профилактики, диагностики и лечения", утвержденной Постановлением ГКНТ СССР и Госплана СССР Ш 181/128 от 16 июля 1981 года. Результаты проведенных исследований использованы для решения задач, поставленных в разделе 03.01.Н2 данной программы: "Создать искусственные выеокоиммуногеиные макромолекулярные комплексы и дать оценку возможности их применения".
ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Механизм иммуногенеза
В настоящее время механизм иммуногенеза изучен в достаточно большой мере. Рядом экспериментов было установлено, что иммунный ответ в организме начинается с распознавания чужеродных антигенов и заканчивается накоплением эффекторных клеток и антител. С помощью культивирования клеток в системах in vivo, in vitro и в клинической практике было показано, что иммунный ответ на большинство антигенов требует взаимодействия нескольких типов клеток: Т- и В-лимфоцитов, а также макрофагов. Каждый из перечисленных типов клеток, в свою очередь, включает в себя много подтипов кооперирующих клеток (Р.В.Петров, 1968,1970,1976; Р.В.Петров, А.Н.Череде-ев, 1974; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов и соавт., 1981; Mitchell к., Miller J., 1968j ClamanE., Chaperon E.A., 1969? Osooa D», 1970$ Elayfair J.H.L., 1971).
С помощью хромосомных маркеров (Wu A.M. et al., 1968? Howel P#C. et al., 1970) было показано, что едиными предшественниками для Т- и В-лимфоцитов являются недифференцированные стволовые клетки костного мозга, то есть у всех лимфоцитов и кроветворных клеток эритроидного, миелоидного и мегакариоцитарного ряда имеется общий источник возникновения. Пул стволовых кроветворных клеток находится в эмбриональной печени и костном мозге в постнаталь-ный период (Й.ЛЛертков, А.Я.Фриденштейн, 1977; И.Л.Чертков, О.А. Гуревич, 1982). Кроме полипотентной стволовой кроветворной клетки показано существование лимфоидной стволовой клетки. Основанием для вывода о ее существовании послужил анализ "швейцарского" типа тяжелой комбинированной иммунологической недостаточности у человека, при которой отсутствуют, как Т-, так и В-лимфоциты (Hitzig W,H. et al., 1978). Эта клетка характеризуется высокой радио чувствительностью (Basch. R.S., Kadish J.L., 1977) и присутствием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (Bartoh мл. et al.,1975; Gregoiere к.Е. et al., 1979). Лимфоидные стволовые клетки генерируют два типа клеток - предшественников Т-клеток и предшественников В-клеток, из которых развиваются Т- и В-популяции лимфоцитов, достигающих функциональной зрелости, становясь иммунокомпетентны-ми в центральных органах иммунной системы - зобной железе (тимусе), сумке Фабрициуса (у птиц), а также костном мозге и селезенке (Rozing J. et al., 1976). Аналогом фабрициевой сумки птиц у млекопитающих в эмбриональном периоде считаются кроветворные очаги печени (Owen J.J-Т., 1980).
Т-лимфоциты образуются в тимусе из протиыоцитов и пре-Т-кле-ток. Они генерируют и поставляют в кровообращение и периферические лимфоидные органы три самостоятельных субкласса лимфоцитов: Т-хелперы, Т-эффекторы и Т-супрессоры (Р.В.Петров, 1982). Для идентификации каждого субкласса используют поверхностные маркеры. Наиболее современным и специфичным считается классификация поверхностных антигенов, кодированных генами Ly- и Qa-1-систем (Stanton Т.Н., Boyse Е.А., 1976; Flaherty L», 1976).
Генетика иммунного ответа на искусственные антигены
Иммунный ответ на многие антигены у различных видов животных контролируется генами иммунного ответа (Іг.-генами), сцепленными с главным комплексом гистосовместимости (Benacerraf В., Katz D.H., 1975). Исследованиями было установлено, что гены, ответственные за такие специфические иммунные реакции, как например, иммунный ответ на тимусзависимые антигены (ir-гены) и стимуляция лимфоцитов, обладающих специфической супрессорной активностью (Is-гены, локализуются в 1-области главного комплекса гистосовместимости. При более детальном изучении были идентифицированы локусы 1-А и I-C, которые отвечают за эти феномены (Benacerraf В., 1977).
Благодаря узкой специфичности иммунного ответа на искусственные антигены (Seaver s.s. et ai., 1976), они позволили продемонстрировать распознавание на уровне одной специфической детерминанты. Было показано, что (Т,Г)-А-Л, введенный в физиологическом растворе с полным адъювантом Фрейнда инбредным мышам линий СВА (гаплотип н-2 ) и C57BL/6 (гаплотип н-2 ) вызывает во вторичном иммунном ответе после повторной иммунизации антигеном образование антител у мышей C57BL/6, в 10 раз превышающее уровень образования антител у мышей СВА. При замене аминокислотного остатка тирозина в молекуле антигена на аминокислотный остаток гисти-дина результаты носили обратный характер. При замене остатка гис-тидина на остаток фенилаланина уровень иммунного ответа у обеих линий совпадал (McDevitt Н.О., SelaM., 1965). Исследования, позволившие выявить и описать гены иммунного ответа, были проведены с синтетическим антигеном (Т,Г)-А-Л. Было показано, что способность различных инбредных линий мышей вырабатывать антитела на (Т,Г)-А-Л находится под контролем доминантного аутосомного гена 1г-1А. При анализе обратного скрещивания гибридов первого поколения между высоко- и низкоотвечающими линиями мышей было показано, что иммунологическая реактивность на (Т,Г)-А-Л наследуется как элементарная генетическая единица (McDevitt и.о., seia м., 1965,1967).
Ген Ir-IA. контролирует иммунный ответ на многоцепочные разветвленные полипептиды - (Т,Г)-А-Л, (Гис,Г)-А-Л, (Ф,Г)-А-Л. Шши с гаплотипом н-2 являются высокоотвечающими на (Т,Г)-А-Л, H-2d - средне отвечающими, а н-2к, н-г9-, н-2г, H-2S, H-2W - низкоотве - 37 чающими и неотвечающими. Максимальные различия между отвечающими и неотвечающими фенотипами проявляются при повторной иммунизации на уровне синтеза igG антител (McDevitt и.о., seia Е., 196?І Benacerraf В., McDevitt Н.О., 1972? McDevitt И.О., et al., 1974). Было показано, что иммунный ответ на синтетические полипептиды (Т,Г)-А-Л (Gunther Е. et al., 1972? Balcarova J. et al., 1975), ГАТ (Benedict A.A. et al., 1977) и ГТ (Koch C, Simonsen A., 1977) у кур сцеплен с В-комплексом, который является аналогом Н-2 комплекса мышей. Последующие исследования это подтвердили (Pevzner i.Y. et al., 1979). На курах были выполнены эксперименты по идентификации антигенных детерминант синтетического многоцепочного полипептидного антигена (Т,Г)-А-Л (Sorup Р., Koch С, 1978), которые позже получили продолжение в экспериментах на мышах. Было показано, что за различия в иммунном ответе у оппозитно реагирующих линий мышей с гаплотипами н-2 и н-2 ответственна часть антигена, содержащая АЛА-ЛИЗ и именно она контролируется 1г-генами (stotter н. et al., 1981).
Синтетические полиэлектролиты
В работе использовали следующие синтетические полиэлектролиты: поликатион - поли-4-винилпиридин (ПВП) с молекулярной массой (ММ) 100.000, полианион - полиакриловую кислоту (ПАК) с ММ 50.000 и 80.000.
Кроме того, изучали действие сополимера акриловой кислоты (АК) и N-винилпирролидона (Н-ВПД) с ММ 80.000-100.000 с 45 мольными процентами АК. Также рассматривали влияние модифицированного т. ота.).
Их общие формулы:
ПАК, НА и Шк растворяли в стерильном физиологическом растворе, ПВП - в стерильной дистиллированной воде с добавлением 0,5% уксусной кислоты. Готовился 1% раствор полимера и вводился внутрибрюшинно из расчета 50 мг на 1 кг массы тела.
В качестве антигена использовали синтетический разветвленный много цепочный полипептид поли-(ь -тирозин : L-глутаминовая кислота )-поли-DL-аланин : поли-Ь-лизин, сокращенно (Т,Г)-А-Л (Miles Laboratories Inc.,. Elkhart, Ind.46514, USA) (MM 280.000) CO следующим пропорциональным соотношением - L-ЛИЗ : DL-АЛА : L-ГЛУ : L-ТИР = 1: 1-6,4 : 3,6 : 2 и (Т,Г)-А-Л, конъюгированный с ПМ, НА, Шк - (Т,Г)-А-Л-ПАК, (Т,Г)-А-Л-НА, (Т,Г)-А-Л-ША. ПАК получали радикальной полимеризацией АК. Для конъюгации с (Т,Г)-А-Л применяли фракцию полимера с ММ 80.000.
Сополимеры НА и МНА эквимольного состава (50:50) получали согласно Chapiro A., Le Doang Trung (1974)х . Состав мономерной смеси определяли с помощью известных констант сополимеризации АК Конъюгаты (Т,Г)-А-Л с синтетическими полиэлектролитами были получены зав.лабораторией Института иммунологии Минздрава СССР канд.хим.наук Некрасовым А.В.
- 50 и N-ВПД. Состав сополимера устанавливали методами ИК-спектроско-пии и потенциометрического титрования. Ш оценивали вискозиметри-чески. В данной работе использовали сополимер с ММ около 100.000. Модификацию НА проводили по реакции ацилирования с этилендиами-ном. Содержание первичных аминогрупп в МШ. определяли методами потенциометрического титрования и титрования свободных аминогрупп тринитробензолсульфокислотой. Для конъюгации применяли образец МЫА, содержаний 20% аминогрупп. Ковалентное связывание (Т,Г)-А-1 с ПАК, NA и МИА проводили по реакции ацилирования карбомиимидным способом в 0,05М фосфатом буфере (рН 5,7) с ионной силой 0,1М (NaCi), конъюгат выделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадек-сом, диализовали и лиофилизовали. Анализировали конъюгаты (Т,Г)-А-Л с полиэлектролитами методом УФ-спектроекопии.
Кроме того, для изучения иммунного ответа у оппозитнореаги-рующих линий мышей применяли конъюгат (ї,Г)-А-Л-ТНФх).
Взаимодействие Т- и В-лимфоцитов в системе адоптивного переноса
В системе адоптивного переноса показано (Taussig M.J, et al., 1974), что igM ответ на (Т,Г)-А-Л также контролируется 1г-1А геном. Мы использовали данную экспериментальную модель для изучения влияния ПВП и ПАК на иммунный ответ, контролируемый 1г-1А геном. Помимо количественного анализа эффекта этих синтетических полиэлектролитов на уровне иммунного ответа, контролируемого одним геном, эта модель позволяет также проводить изучение влияния ПВП и ПАК на кооперацию Т- и В-лимфоцитов. Это особенно важно, так как местом экспрессии 1г-1А гена являются Т-лимфоциты и их способность к взаимодействию с В-лимфоцитами.
В табл.1 представлены данные, полученные при изучении взаимодействия Т- и В-лимфоцитов при индукции иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л в системе адоптивного переноса. При введении клеток костного мозга (В-лимфоцитов) с (Т,Г)-А-Л формируется незначительное количество АОК, синтезирующих антитела на (Т,Г)-А-Л. Небольшое количество АОК наблюдается также при трансплантации тимоцитов (Т-лимфоцитов).
Введение смеси клеток костного мозга с тимоцитами вызывает накопление АОК в количестве, в 8-Ю раз превышающем общую сумму АОК, образующихся при раздельном введении В- и Т-лимфоцитов. Эти опыты демонстрируют необходимость кооперации между Т- и В-лимфо-цитами для индукции иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л, что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными (Мшіго АЛ., Taussig M.J.» 1975; Taussig M.J. et al., Ї974).
В системе адоптивного переноса Т- и В-клеток наблюдаются межлинейные различия при индукции первичного иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л, т е. на уровне формирования І0. AQK (рис 5)І Так, мыши лини С5?вь/б оказались высоко отвечающими, СВА - низко отвечающими, BSbB/c - среднеотвечающшш. у СсвАзеСідаь/б.ур способность продуцировать г$ AQK в системе адоптивного переноса I- и В-клеток по высокому типу наследуется,, как доминантный, признак.
Первичный иммунный ответ на конъюгаты (Т,Г)-А-Л с синтетическими полиэлектролитами
Получение коныогатов искусственного многоцепочного полипептидного антигена (Т,Г)-А-Л с мощными стимуляторами иммуногенеза поставило на повестку дня вопрос об их применении для коррекции первичного и вторичного иммунного ответа.
В табл.7 представлены данные по первичному иммунному ответу на (Т,Г)-А-Л при иммунизации мышей C57BL/6 и СВА исходным (Т,Г)-А-Л или его конъюгатами с полиэлектролитами. При однократной иммунизации мышей СВА и C57BL/6 только (Т,Г)-А-Л в селезенке формируется небольшое, примерно равное количество igM. и igG АОК на (Т,Г)-А-Л (рис.12).
У мышей, иммунизированных однократно конъюгатами (Т,Г)-А-Л-ЇЇАК и (Т,Г)-А-Л-ИА, происходит увеличение накопления ig№ и igG АОК на (Т,Г)-А-Л по сравнению с их количеством при иммунизации (Т,Г)-А-Л.
