Введение к работе
Актуальность проблемы. Иммунохимические методы анализа приобретают всё большее значение в диагностике инфекционных заболеваний человека. Они позволяют выявлять антигены возбудителя, характеризовать его фенотип и патогенетический потенциал, а также оценивать иммунный ответ организма и исследовать его механизмы.
Инфекция бактерией Helicobacter pylori вызывает развитие в слизистой желудка воспалительного процесса, который в большинстве случаев протекает в форме хронического гастрита. В ряде случаев (до 20%) инфекция приводит к возникновению острого гастрита, язвенной болезни, аденокарциномы желудка и MALT-лимфомы (Жебрун, 2006; Kusters et al., 2006). Наиболее выраженные патологические процессы, сопряженные с повышенной вероятностью опухолевой трансформации, вызывают штаммы H. pylori, экспрессирующие цитотоксин CagA (Hatakeyama, Higashi, 2005). Этот белок признан одним из основных факторов патогенности H. pylori и считается ответственным за нарушение целостности эпителия слизистой желудка, индукцию неконтролируемой пролиферации эпителиальных и лимфоидных клеток, секреции провоспалительных цитокинов и модуляцию презентации антигенов клетками эпителия (Brandt et al., 2005; Hatakeyama, 2008; Costa et al., 2009). Цитотоксин CagA является вариабельным белком, и в популяции носителей инфекции H. pylori циркулируют штаммы бактерии, экспрессирующие CagA-белок «западного» или «восточноазиатского» типов, которые различаются по аминокислотной последовательности и биологической активности (Xia et al., 2009).
Инфекции CagA-позитивными штаммами H. pylori сопряжены также с развитием ряда экстрагастральных заболеваний аутоиммунной природы. Антитела против CagA-белка вносят существенный вклад в патогенез иммунной тромбоцитопении (Franceschi et al., 2004; Takahashi et al., 2004). Роль и молекулярные механизмы участия цитотоксина CagA и антител против него в патогенезе других аутоиммунных заболеваний (хроническая уртикария, аутоиммунный тироидит и др.) нуждаются в дальнейшем исследовании (Figura et al., 1999; Bakos, Hillander, 2003; Stasi, Provan, 2008).
До сих пор остаются неизученными свойства CagA-белка как антигена: не выяснена иммуногенность различных эпитопов молекулы, не исследован изотипический спектр антител, вырабатываемых против этого белка.
По заключению ряда экспертов, в том числе III Маастрихтской конференции, для диагностики инфекции H. pylori рекомендуется использовать комплекс иммунологических и молекулярно-биологических методов (Malfertheiner et al., 2007; Mishra et al., 2008; Guarner et al., 2010). Поскольку CagA-белок является маркером высокопатогенных штаммов H. pylori, разработка методов иммунодетекции CagA-антигена и антител против него представляется актуальной проблемой клинической иммунологии (Hatakeyama, Higashi, 2005; Megraud, Lehours, 2007; Monteiro et al., 2009). Решение этой проблемы сдерживается отсутствием стандартизованных препаратов антигена CagA и моноклональных антител (МКАТ) против него. До сих пор не существует эффективной технологии выделения и очистки белка CagA из культур H. pylori, что препятствует получению и аттестации МКАТ против этого антигена.
Цель и задачи работы
Цель работы состояла в создании иммунохимических реагентов - антигенов и моноклональных антител - для выявления CagA-белка Helicobacter pylori и антител против него.
В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
С помощью методов биоинформатики выявить области молекулы CagA, различающиеся по степени консервативности и иммуногенности, и определить участки аминокислотной последовательности для конструирования рекомбинантных фрагментов цитотоксина.
-
Создать штаммы бактерий Escherichia coli, экспрессирующие рекомбинантные фрагменты белка CagA H. pylori.
-
Изучить характер связывания рекомбинантных фрагментов CagA с сывороточными антителами и оценить возможность их использования для исследования антител против цитотоксина в сыворотке крови человека.
-
С помощью гибридомной технологии создать панель моноклональных антител против высоко- и низкоиммуногенных участков молекулы CagA.
-
Изучить эпитопную специфичность и иммунохимические свойства полученных моноклональных антител с использованием рекомбинантных полипептидов в качестве антигенов.
-
Изучить взаимодействие моноклональных антител с нативным белком CagA из культур бактерий H. pylori и определить методы их применения для выявления цитотоксина.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Анализ аминокислотных последовательностей белков CagA с помощью методов биоинформатики оказался эффективным подходом к конструированию рекомбинантных полипептидов и созданию МКАТ.
-
Созданные рекомбинантные фрагменты CagA соответствуют изолированным участкам первичной структуры цитотоксина, обладающим разной иммуногенностью, что позволяет получать МКАТ против высоко- и низкоиммуногенных детерминант молекулы CagA.
-
Рекомбинантные фрагменты CagA позволяют выявлять антитела против цитотоксина в сыворотках носителей инфекции H. pylori, исследовать их изотипический состав и специфичность в отношении различных участков молекулы белка CagA.
-
Рекомбинантные фрагменты могут служить основой для стандартизации методов количественного определения белка CagA в биологическом материале.
-
Созданные МКАТ способны взаимодействовать как с рекомбинантными фрагментами CagA, так и с «природным» белком CagA в культурах H. pylori, и позволяют дискриминировать CagA-позитивные и CagA-негативные штаммы H. pylori методами иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа.
Новизна и научная значимость работы
В результате молекулярно-генетического типирования клинических изолятов H. pylori впервые осуществлен анализ особенностей молекулярной организации гена cagA штаммов H. pylori, циркулирующих на территории России. В базе данных GenBank депонированы первые последовательности гена cagA российских изолятов бактерии.
Предсказана методами биоинформатики и подтверждена в экспериментах разная иммуногенность отдельных участков молекулы CagA.
Созданы штаммы Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантные фрагменты цитотоксина CagA, которые в совокупности воспроизводят всю аминокислотную последовательность этого белка.
Впервые создана панель МКАТ, распознающих антигенные детерминанты высоко- и низкоиммуногенных участков молекулы цитотоксина CagA.
Впервые предложена система двухцентрового иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления CagA-антигена, основанная на использовании исключительно МКАТ.
Созданные реагенты открывают перспективы для решения ряда научно-исследовательских задач, таких как изучение закономерностей иммунного ответа на цитотоксин, анализ протективной эффективности антител против него, молекулярных механизмов развития язвенной болезни и опухолевой трансформации, роли CagA-белка в патогенезе экстрагастральных аутоиммунных заболеваний.
Практическая значимость работы
На основе полученных рекомбинантных фрагментов CagA белка разработан вариант ИФА для выявления специфических антител в сыворотках носителей высокопатогенных штаммов H. pylori.
Рекомбинантные фрагменты CagA могут быть использованы в качестве контрольных и калибровочных реагентов для различных иммунометрических систем.
Созданные в работе МКАТ против CagA-белка представляют собой основу для разработки и производства диагностических тест-систем, позволяющих выявлять пациентов-носителей высокопатогенных CagA-позитивных штаммов H. pylori, а также контролировать эффективность проводимой терапии.
Внедрение результатов исследования
Разработанные реагенты проходят апробацию в нескольких научных и диагностических лабораториях России, что подтверждается соответствующими документами. На базе Городской больницы №31 (г. Санкт-Петербург) у пациентов с идиопатической тромбоцитопенией и выявленным носительством H. pylori проводится исследование антител, связывающих рекомбинантные фрагменты CagA. В лаборатории аллергодиагностики НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (г. Москва) разработанные иммунохимические реагенты применяют для анализа взаимосвязи между инфекцией CagA-позитивными штаммами H. pylori и аллергическим иммунным ответом у детей.
Результаты работы используются при проведении практического курса «Иммунологические методы исследования» на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.
Личный вклад автора в проведение исследования
Данные, представленные в работе, получены лично автором. Диссертантом выполнены все этапы создания штаммов-продуцентов рекомбинантных фрагментов CagA, иммунизации экспериментальных животных, получения гибридом, изучения свойств МКАТ, моделирования систем иммуноанализа на их основе. Приготовление меченых МКАТ и антигенов выполнено при участии сотрудников лаборатории гибридомной технологии ФГУ «РНЦ РХТ». Секвенирование образцов ДНК проведено специалистами компании «АТГ Сервис Ген» (Санкт-Петербург). Культивирование клинических изолятов H. pylori выполнено сотрудниками НИЛ «Диагностика» (Санкт-Петербург).
Апробация работы
Материалы работы были представлены на IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии: Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), на научной конференции «От лучей Рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института (Российского Научного Центра Радиологии и Хирургических Технологий)» (Санкт-Петербург, 2008), на XIX Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Хельсинки, 2009).
Публикации
Результаты работы отражены в 3 статьях и тезисах докладов 4 конференций.
Структура и объем диссертации
