Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1 Микробный этиологический фактор хронических заболеваний гастродуоденальной области 19
1.1.1 Краткая история открытия и эпидемиология инфекции Н. pylori 20
1.1.2 Биологические и патогенные свойства Н. pylori 26
1.1.3 Заболевания, связанные с Н. pylori ...42
1.1.4. Краткая молекулярная биология и эпидемиология вирусов герпеса человека 48
1.1.5 Вирусы группы герпеса и поражение ЖКТ 52
1.2. Иммунопатогенез хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области 54
1.2.1 Иммунная система слизистых оболочек ЖКТ 54
1,2.2.Иммунопатогенез хеликобактериоза 58
1.2.3. Иммунопатогенез герпесвирусных инфекций 72
Глава 2. Материалы и методы 76
2.1. Основные этапы исследования 76
2.2. Характеристика клинического материала по данным ЭГДС, гистологии и цитологии 77
2.3. Определение инфекционных агентов в нативном субстрате методом полимеразной цепной реакции 80
2.4. Иммуномагнитная сепарация клеток периферической крови 85
2.5. Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов 86
2.6. Определение специфических антител к инфекционным агентам 86
2.7. Определение уровня экспрессии мРНК цитокинов в биопсийном материале слизистой оболочки гастро-дуоденальной области и мононуклеарах периферической крови 87
2. 8. Статистическая обработка полученных данных 88
Глава 3. Характеристика инфицирования слизистой оболочки гастродуоденальной области и местная реакция на инфекцию 89
3.1. Структура инфицирования штаммами Н. pylori и выявление генов патогенности Н. pylori в биопсийном материале слизистой оболочки гастродуоденальной области 89
3.2. Зависимость патологических изменений слизистой оболочки от степени обсеменения Н. pylori... 94
3.3. Структура инфицирования слизистой оболочки гастродуоденальной области вирусами группы герпеса.. 96
3.4. Определение уровня экспрессии мРНК цитокинов в слизистой оболочке гастродуоденальной области при хеликобактерном, вирусном и смешанном инфицировании... 100
Глава 4. Системные реакции макроорганизма на инфекционные агенты, обуславливающие поражение слизистой оболочки гастродуоденальной области ...111
4.1. Анализ основных классов иммуноглобулинов IgM, IgA, IgG...111
4.2. Исследование гуморального иммунного ответа к Н. pylori и вирусам группы герпеса 113
4.3. Фенотип лимфоцитов периферической крови при хронических воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области 120
4.4. Оценка провоспалительных цитокинов ИЛ-1(3, ИЛ-2, Ифу периферической крови при хронических воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области. 123
4.5. Исследование характера инфицирования мононуклеарных клеток периферической крови ...125
Глава 5 Способ диагностики ифекции, обусловленной Н. Pylori и рациональный алгоритм диагностики воспалительных заболеваний гастродуоденальной области .131
5.1. Способ диагностики ифекции, обусловленной Н. pylori и примеры его применения 133
5.2. Рациональный алгоритм диагностики воспалительных заболеваний гастродуоденальной области при бактериально-вирусном инфицировании 155
Заключение и обсуждение полученных результатов ...160
Выводы 189
Практические рекомендации .191
Список литературы. ...192
- Иммунопатогенез хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области
- Определение инфекционных агентов в нативном субстрате методом полимеразной цепной реакции
- Зависимость патологических изменений слизистой оболочки от степени обсеменения Н. pylori...
- Исследование гуморального иммунного ответа к Н. pylori и вирусам группы герпеса
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время большую проблему представляют вялотекущие хронические воспалительные процессы, связанные с персистенцией микробных агентов. В их числе заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), ассоциированные с инфицированием Helicobacter pylori (H. pylori). Этому вопросу уделяется пристальное внимание на протяжении более чем 25 лет. H. pylori является ключевым фактором в патогенезе большинства клинически значимых нозологических форм заболеваний ЖКТ, в число которых входят: хронический гастрит, дуоденит, язвенная болезнь, аденокарцинома и В-клеточная MALT-лимфома желудка и другие заболевания (Григорьев П.Я, Исаков В.А., 1990; Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А., 1998; Исаков В.А., Домарадский И.В., 2003; Warren J.R., Marshall B.J.1983; Bjorkholm B. et al., 2000; O’Brien D. P. et al., 2006 и др.).
Актуальна эта проблема и для детей, поскольку заражение часто происходит в раннем детском возрасте и затем достигает уровня инфицированности взрослого населения (Щербаков П.Л., 1991; Корниенко Е.А. с соавт.,1998; Li Z.Y., 2005 и др.). Инфицированность населения H. pylori по различным регионам составляет от 20 до 90 %. В среднем среди взрослого населения эта цифра колеблется от 40 до 70 %.
Кроме того, на сегодняшний день существует целый ряд клинических и экспериментальных данных свидетельствующих о том, что микроорганизм H. pylori помимо поражения ЖКТ способен вызывать ряд патологических изменений со стороны других органов и систем. К внежелудочным проявлениям инфекции, которые может вызывать H. pylori, в настоящее время относят анемии, аутоиммунную патологию, поражения сердечно – сосудистой системы, головного мозга, суставов, желез внутренней секреции, глаз, кожных покровов и некоторые другие заболевания (Рудык Ю.С. с соавт., 2000; Исаков В.А., Домарадский И.В., 2003; Фадеенко Г.Д. , 2004; Кратнов А.Е. , 2006; . Циммерман Я.С., 2006; van der Weg B. et al., 2006; Corcoran PA, et al, 2007; Kpeli S. et al , 2007; Ferreri AJ. et al,, 2008 и др.).
Экспериментальные и клинические исследования последних лет установили, что при развитии хронических воспалительных заболеваний ЖКТ, в частности гастродуоденальной области, помимо основного этиологического фактора H. pylori, в слизистой оболочке (СО) обнаруживаются вирусы группы герпеса: Epstein-Barr virus, Cytomegalovirus, Human herpes virus VI, VII, VIII (Randhawa PS, Jenkins FJ, Nalesnik MA, 1997; Gonelli A., Boccia S., Boni M. et al. 2001; Ogata T, Yoshimura A, Kurihara Y, et al. 2002; Tsamakidis K., Panotopoulou E., Demitroulopoloulos D. et al., 2005). В связи с этим можно предположить, что в развитии поражений слизистой ЖКТ непосредственное участие принимают вирусы, в частности группы герпеса (Herpesviridae). Это, в свою очередь, существенно меняет подходы к этиологической диагностике воспалительных заболеваний ЖКТ и требует коррекции применяемых схем лечения этой группы заболеваний.
До сих пор не ясны аспекты иммунопатогенеза рассматриваемой гастродуоденальной патологии. В связи с этим, новым направлением в исследовании патогенного действия на СО H. pylori и вирусов Herpesviridae стало изучение местной цитокиновой регуляции иммунного ответа. Экспериментальных и клинических данных о влиянии вирусов группы герпеса в сочетании с H. pylori на синтез цитокинов в месте воспаления слизистой ЖКТ недостаточно.
В современных методических руководствах по диагностике воспалительных заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки описываются различные методы диагностики. Однако нет четких указаний, какие из них наиболее эффективны и рациональны при проведении лабораторной диагностики этой группы заболеваний.
Цель исследования:
Изучить иммунопатогенетические особенности развития хронического воспаления у больных с гастродуоденальной патологией, обусловленной инфицированием H.pylori и вирусами Herpesviridae.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи.
Задачи исследования:
-
Выявить инфицированность СО штаммами H. pylori и вирусами Herpesviridae при воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области и определить зависимость степени поражения СО (по данным эзофагогастродуоденоскопии, цитологии и гистологии) от степени инфицирования микроорганизмами.
-
Изучить местную иммунную реакцию в очаге воспаления по уровню экспрессии мРНК цитокинов в СО гастродуоденальной области.
3) Оценить проявления генерализованной иммунной реакции организма при изучаемой патологии, сопоставив эти данные с наличием инфекционных агентов в биопсийном материале СО.
4) Выявить возможное присутствие ДНК H. pylori в мононуклеарных клетках периферической крови при гастродуоденальной патологии.
5) Разработать способ диагностики инфекции, обусловленной H. pylori, путем определения фрагментов ДНК микроорганизма в мононуклеарных клетках периферической крови.
6) Предложить рациональный алгоритм диагностики воспалительных заболеваний гастродуоденальной области при бактериально-вирусном инфицировании.
Научная новизна:
Получены новые данные о бактериально-вирусном инфицировании СО гастродуоденальной области. В период обострения хронических воспалительных заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки СО может быть контаминирована патогенными штаммами H. pylori, цитомегаловирусом, вирусами Эпштейна-Барр, варицелла зостер, герпеса человека 6-го, 7-го, 8-го типов. Если ранее в литературе встречались сообщения об участии отдельных представителей вирусов группы герпеса в патологии желудка и двенадцатиперстной кишки, то полученные результаты свидетельствуют о неслучайном присутствии представителей Herpesviridae при патологии ЖКТ.
Получены новые данные о состоянии местной иммунной реакции в СО гастродуоденальной зоны ЖКТ при воспалительной реакции, обусловленной патогенными штаммами H. pylori и вирусами Herpesviridae. Экспрессия мРНК цитокинов в очаге поражения носит различный характер при бактериальном, вирусном и смешанном инфицировании. При инфицировании только H. pylori местная реакция развивается с экспрессией преимущественно мРНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФ- и ФНО- . При вирусном инфицировании преобладает сдвиг преимущественно в сторону Тh1 с экспрессией мРНК ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФ- и ФНО- . При смешанном инфицировании иммунопатологический процесс в очаге воспаления СО имеет разнонаправленный характер и прогрессивно развивается по «расходящейся спирали».
Показана связь между характером инфицирования СО гастродуоденальной области, уровнем экспрессии мРНК цитокинов в очаге воспаления и провоспалительных цитокинов в сыворотке крови. Выявлена четкая прямая зависимость между степенью повреждения слизистой оболочки и уровнем ИФ в периферической крови.
Показан дисбаланс в соотношении CD3+4+/CD3+8+ клеток при деструктивном характере поражения СО, заключающийся непропорционально большом количеством CD3+8+ клеток при бактериально-вирусном инфицировании.
Впервые обнаружен феномен персистенции участков ДНК H. pylori в мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови при воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области. Установлена его прямая зависимость от степени повреждения СО.
Впервые установлен факт наличия в МНК генов ureC, cagA, vacAs1, vacAs2, vacAm2, iceA1, iceA2, babA H. pylori, кодирующих факторы патогенности микроорганизма.
Разработан новый способ диагностики инфекции, обусловленной H. pylori, осуществляемый путем определения методом ПЦР участков генома микроорганизма в МНК периферической крови.
Обоснована общая схема иммунопатогенетических процессов, происходящих в слизистой оболочке, при бактериально-вирусном инфицировании (H. pylori и Herpesviridae).
Разработан и обоснован алгоритм этиологической диагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области бактериально-вирусной природы.
Практическая значимость.
Разработан и предложен новый способ диагностики инфекции, обусловленной H. pylori, основанный на определении фрагментов ДНК микроорганизма в МНК периферической крови.
Предложен комплекс лабораторных исследований и иммунодиагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области. Разработан алгоритм применения этого комплекса при обследовании больных с целью выявления комбинации патогенных микроорганизмов при хронических заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки.
Даны рекомендации по диагностике и лечению заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированных с H. pylori и вирусами группы герпеса. В схемы лечения изучаемой патологии наравне с классической эрадикационной терапией рекомендовано включение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов, как составляющей этиотропного лечения.
Внедрение результатов работы в практику.
Получен Патент РФ на изобретение № 2265219 «Способ диагностики Helicobacter pylori – инфекции». Изобретение внедрено в практику работы клинико-диагностических лабораторий: НУЗ «Центральная клиническая больница № 6 ОАО «Российские Железные Дороги», г.Москва; МУЗ Городская поликлиника г. Краснознаменск, Московская область, ФГУ 150 Центральный военный госпиталь Космических Войск, Московская область; ООО «Национальное агенство клинической фармакологии и фармации» (НАКФФ), г.Москва; ООО «Медицинский центр Авиценна», г.Москва; МУЗ «Городская клиническая больница № 4», г. Пермь.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на циклах тематического усовершенствования, проводимых на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ «Российская медицинская академия последипломного образования», г. Москва.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Выявленный спектр микроорганизмов, инфицирующих СО при воспалительных процессах гастродуоденальной области, свидетельствует, что изучаемая патология обусловлена не только бактерией H. pylori, но и вирусами группы герпеса.
2. Степень деструктивных изменений СО и характер местной клеточной реакции зависит от сочетания инфекционных агентов, присутствующих в очаге воспаления. При моноинфицировании H. pylori или вирусами Herpesviridae местная реакция носит различный характер. При бактериальном инфицировании экспрессируются преимущественно мРНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФ- и ФНО-. При вирусном – реакция развивается по Тh1 – типу с экспрессией мРНК ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФ- и ФНО-. При микст инфицировании местная иммунопатологическая реакция приобретает разнонаправленный характер и развивается по «раскручивающейся спирали», в результате чего в очаге воспаления преобладают деструктивные процессы.
3. Определение IgA к H. pylori, фенотипа лимфоцитов периферической крови и сывороточных цитокинов, в частности ИФ, могут явиться дополнительным показателем в определении активности инфекционного процесса и степени повреждения СО.
4. Впервые обнаруженный феномен персистенции фрагментов генома H. pylori в МНК периферической крови свидетельствует о том, что инфекционный процесс не ограничивается местными изменениями СО, но при длительном течении вызывает иммунопатологические реакции на уровне целого организма. Определение специфических участков ДНК H. pylori в МНК периферической крови методом ПЦР можно использовать в комплексной диагностике хеликобактериоза.
5. Для достоверной и эффективной первичной диагностики воспалительных заболеваний гастродуоденальной области необходимо проведение ЭГДС с обязательным взятием биопсийного материала и определением наряду с H. pylori возможного присутствия вирусов группы герпеса.
6. Включение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов в схемы этиотропной терапии воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, обусловленных инфекцией H. pylori и вирусами герпеса, обеспечит достижение более эффективных результатов лечения данной патологии.
Апробация материалов диссертации.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Российских Национальных конгрессах «Человек и лекарство» в г. Москве: VIII, 2001, IX, 2002, XV, 2008 гг.; Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002); V Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002); Всероссийском Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С-Петербург, 2006); VIII Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологи» (Москва, 2007); 2-ом заседании Клуба профессиональных иммунологов (Анталия, Турция, 2007), Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология – междисциплинарные проблемы», 26-27 февраля 2008 г. (Москва); 2-ом Съезде врачей железнодорожной медицины (2008), Объединенном иммунологическом форуме в г.Санкт-Петербурге (2008); Международном симпозиуме «Иммунитет и инфекции» 5 – 12 октября 2008г. (Кемер, Турция, 2008); 6-ом Всемирном Форуме по клиническим испытаниям в кардиологии, 3-5 декабря, 2009 г. (Париж, Франция); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология – практическому здравоохранению», 25-26 февраля 2010 г. (Москва), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», 24-26 ноября 2010 г. (Москва).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 50 научных работ, в том числе 1 монография, получен патент Российской Федерации на изобретение.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на страницах, включает в себя 18 таблиц, 32 рисунка и состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы». Указатель литературы содержит источника, из них отечественных и зарубежных.
Иммунопатогенез хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области
Пограничное положение слизистых оболочек между внешней средой и организмом, делающее их входными воротами для инфекций и местом персистенции возбудителя определяет значимость изучения иммунной системой слизистых оболочек во взаимосвязи с иммунной системой всего организма.
В 1907 г. И.И. Мечников высказал предположение, что причиной возникновения многих болезней человека является действие на клетки и ткани макроорганизма разнообразных токсинов и множества других метаболитов, продуцируемых микробами в процессе своей .,; , жизнедеятельности [56]. Однако впоследствии внимание исследователей к изучению этиопатогенетической роли микроорганизмов в развитии многих болезней снизилось. Благодаря достижениям в области генетики, молекулярной биологии, экспериментальной иммунологии в 60-80-е гг. стал очевиден вклад наследственности и иммунитета в развитие заболеваний. Сегодня предположения И.И. Мечникова получили дальнейшее развитие.
Так M.Blaser (1997) считает: «...клинически проявляющаяся болезнь (в отличие от морфологических изменений слизистой оболочки желудка) является не естественным исходом, а случайным дисбалансом между паразитом и хозяином. С «точки зрения» микроба вызываемая им болезнь является частью платы за поддержание нишы, в которой существует вид. Важно, что неоднородность популяции Н. pylori сама по себе или
В 1929 г. A.M. Безредка применил термин «местный иммунитет» для определения индивидуальной невосприимчивости органа или ткани к инфекционному агенту в восприимчивом организме. В 1968 году T.Tomasi и J.Bienenstock предложили гипотезу о существовании особой иммунной системы слизистых оболочек, в которой ведущая роль отводилась секреторному IgA (slgA). Процессы его синтеза, иммунные реакции, опосредованные slgA, часто именовались «секреторный иммунитет». По мере накопления фактов сложилось представление о местном гуморальном и местном клеточном иммунитете, структурной ОСНОВОЙ; ;.:-которых является мукоза-ассоциированная лимфоидная ткань (МАЛТ) - \ лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистыми оболочками [12, 48]. Окончательно современные представления об иммунной системе слизистых оболочек были сформированы в работах Хаитова P.M., Пинегина Б.В.(1997, 2001) и Тепловой С.Н., Алексеева ДА. (2002) [86, 89, 90].
Лимфоидная ткань слизистой оболочки желудка функционально сходна с периферической лимфоидной тканью селезенки и лимфатических .. узлов. Она представлена солитарными лимфоидными фолликулами, локализующимися в норме под мышечной пластинкой, в подслизистом слое, и диффузно расположенными в собственной пластинке лимфоцитами и плазматическими клетками, а также межэпителиальными лимфоцитами. В норме в слизистой фундального отдела клеточная инфильтрация выражена слабо (59,4±5,1 лимфоцитов на 1000 эпителиоцитов), в отличие от антрального отдела и двенадцатиперстной кишки (173±16,6 лимфоцитов на 1000 энтероцитов) [6].
В иммунной системе слизистых оболочек (ИССО) выделяют эффекторные и индуктивные отделы. Подобное деление условно, потому что МАЛТ-лимфоциты постоянно мигрируют, заселяя характерные для= каждой популяции зоны обитания — хоминг-эффект. Следствием этого :: является одновременное включение иммунного ответа во всех; СЛИЗИСТЫХ ; оболочках, вне зависимости от очага антигенного стимула [3, 90, Г83]І"
В индуктивных зонах происходит презентация антигена.;-, Антигенпрезентирующие клетки и антиген-реактивные Т- и В-лимфоцитьг. ; .; поступают в лимфоциркуляцию, затем попадают в кровь, а оттуда :ял-мигрируют в собственную пластинку слизистой оболочки (эффёкторныщ: отдел) [89]. Направленная миграция осуществляется с помощью хоминг- У рецепторов, аналогичных MEL-14-позитивным рецепторам постка-: ;V пиллярных венул с высоким эндотелием паракортикальной; зоньг ;;. лимфатических узлов.
Плазматические клетки собственной пластинки и пейеровых бляшек ; синтезируют димерную молекулу IgA, которая связывается на базальной л?: поверхности эпителиальной клетки с трансмембранным белком, имеющим ,:;; в своем составе гликопротеид — секреторный компонент; Благодаря;, v,;/4 секреторному компоненту молекула иммуноглобулина приобретает устойчивость к протеолизу, что необычайно важно, поскольку slgA / ; оказывается в просвете органа в энзиматически чуждом окружении: ; Располагаясь в надэпителиальной слизи и встраиваясь в гликокаликс, slgA препятствует адгезии микроорганизмов, их токсинов, пищевых аллергенов на эпителии слизистых оболочек. И тем самым блокирует их проникновение во внутреннюю среду организма [5, 48, 96].
Т-лимфоциты собственной пластинки слизистой оболочки (lamina propria) представлены популяцией CD8+- лимфоцитов, составляющих основную массу межэпителиальных лимфоцитов, NK-клетками и Т-хелперами, имеющими иммунофенотип CD3+4+8\ Среди последних выделяют Txl, вырабатывающие провоспалительные цитокины (ИФу, ИЛ-2, ИЛ-12 и др.), Тх2, синтезирующие противоспалительные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 и др.) и ТхЗ, также экспрессирующие противоспалительные цитокины (ТФРР и др.). Тх2 и ТхЗ инициируют высокоаффинный IgA-ответ [46, 183, 187].
Определение инфекционных агентов в нативном субстрате методом полимеразной цепной реакции
Выделение ДНК H.pylori из биоптатов и МНК осуществляли ; наборами реагентов НПФ «ЛИТЕХ», Москва, Россия. Для проведения ПЦР использовали коммерческие тест-системы и праймеры (таблица 4), разработанные на базе Института общей генетики РАН, Москва, Россия (разработчик д.б.н., Шейхаев Г.О.). ПЦР проводили в объеме 30 мкл. Реакционная смесь содержала 10 мМ Трис НС1 рН 8.3, 50 мМ КС1, 2 мМ MgCb, 50 мкМ каждого дНТФ, 10 пкМ каждого праймера, 1 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл анализируемого очищенного образца. После проведения амплификации по стандартной программе (таблица 5), продукты амплификации идентифицировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Кроме этого, методом ПЦР исследовали биопсийный материал слизистой оболочки на наличие участков генома вирусов группы герпеса: вируса простого герпеса I и II типов (ВГЧ 1 и 2), вируса варицелла зостер (ВГЧ-3), Эпштейн-Барр вируса (ВГЧ-4), цитомегаловируса (ВІГЧ-5), вируса герпеса человека VI, VII, VIII типов (ВГЧ-6,7,8). Для этого использовали готовые наборы отечественных фирм-производителей: «Амплисенс», «Биоком», «Литех», «ДНК-технология», (г. Москва); «Вектор-Бест», (г. Новосибирск). Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик», производства НПФ «ДНК-технология», г. Москва. В таблице 6 представлены характеристики конечного продукта амплификации при определении вирусов герпеса. Разделение клеток с фенотипом CD4+, CD8+, CD14+ из мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных на градиенте плотности фиколл - верографин (р - 1,077) проводили методом иммуномагнитной сепарации (Dynal, Норвегия согласно ршструкциям, прилагаемым к наборам реагентов, по следующей схеме:
Мононуклеарные клетки ресуспендировали в фосфатно солевом буфере с 2% фетальной телячьей сывороткой (ФСБ с 2% ФТС) до п " .... концентрации 0,5x10 клеток/мл; Добавляли к образцу необходимое количеством-ферромагнитных частиц Dynabeads CD4+ (CD8+, CD14+), рассчитанное исходя из того, чтобы соотношение частиц к целевым клеткам составляло 4:1, а концентрация частиц 1x10 частиц/мл; Инкубировали 20 минут при 2-8С в перемешивающем устройстве и помещали пробу в магнитный штатив на 2-3 минуты, чтобы частицы, связавшиеся с клетками, притянулись к стенке пробирки; Удаляли супернатант, промывали выделенные клетки с частицами 5 раз в буфере ФСБ с 2% ФТС. По окончании процесса промывки ресуспендировали клетки в среде RPMI 1640 с 1% ФТС до концентрации 10 клеток на 100 мкл; Инкубацию и процедуры разделения проводили на холоду (2-8С) во избежание неспецифического связывания ферромагнитных частиц Dynabeads фагоцитирующими клетками. Определение гематологических показателей проводили на гематологическом анализаторе «Cell-Dyn 1700», фирмы «Эбботт», США. Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови определяли методом лазерной проточной цитофлуориметрии на цитометре «Coulter Epics XL», фирмы «Beckniari Г Coulter», США антителами против CD 3+4+, 3+8+, 5+19+, 16+56+ ("Caltag Laboratories", США) по известной методике [35]. Скорость пролета образца составляла 12 мл/мин в режиме скорости счёта 103 клеток/с.
Подсчёт встречаемости клеток производился на 2000. ; клеток. Абсолютные величины рассчитывались исходя из известного общего количества лимфоцитов, определяемого в клиническом анализе крови по стандартной методике. Гуморальный иммунный ответ оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали комплект оборудования для проведения полуавтоматического варианта ИФА: ридер «Multiskan EX», фирмы « Labsystems», Финляндия; вошер «Fluido», фирмы «Antos», Нидерланды; термошейкер «Sky Line», фирмы «ELMI», Латвия. Определяли уровни сывороточных антител класса А и G к Н. pylori тест — системами, производства «Euroimmune», Германия. Суммарные антитела к Cag А белку тест — системами, производства «Вектор Бест», Россия. IgG к ВПГ-1, ВПГ-2, ВЗВ, ЦМВ «Diagnostic system laboratories», США, IgG к VCA-, EA-, EBNA- белкам ВЭБ «Gen Bio», США, IgG к ВГЧ 6 и ВГЧ 8 «Вектор Бест», Россия. Определение провоспалительных цитокинов ИЛ-13, ИЛ-2, ИФу в сыворотке крови проводили с использованием наборов «Cytimmune», США. Все операции проводили согласно прилагаемым инструкциям с постановкой контроля качества исследований. Матричные РНК цитокинов: ИЛ-lp, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ- і 18, ИФу, ФНОа определяли на базе НПФ «ДНК-технология» методом ПЦР в реальном времени (Real — time PCR) на термоциклере «IQ Cycler 5», фирмы «Bio-Rad Laboratory», США. Использовали опытные тест-системы, ; разработанные научным коллективом под руководством к.б.н. Трофимова Д.Ю. В качестве субстрата использовали биопсийный материал визуально неизмененной слизистой оболочки, кусочки ткани из очагов воспаления, и мононуклеарные клетки периферической крови. Количественные значения мРНК цитокинов получали по скорости нарастания интенсивности свечения флуоресцентной метки. Результаты выражали в виде десятичных логарифмов от репортерной интесивности свечения флуоресцентной метки.
Зависимость патологических изменений слизистой оболочки от степени обсеменения Н. pylori...
Изучение состояния слизистой оболочки гастродуоденальной области: наличие воспаления, его активность, степень атрофии и1 метаплазии по данным гистологического и цитологического исследований;: биопсийного материала, показало, что существует прямая корреляционная ;: связь выраженности воспалительной реакции ткани, ее активности ;6T-; V степени обсеменения Н. pylori (табл.7). Чем выше степень обсеменения микроорганизмом, тем более : " выражена воспалительная реакция в слизистой оболочке и ее активность. На процессы атрофии и метаплазии клеток слизистой оболочки степень ;/ обсеменения Н. pylori существенно не влияла. ; ; Таким образом, проведенное исследование влияния степени :v обсеменения Н. pylori на процессы, происходящие в слизистой оболочке; J: показали, что воспалительная реакция напрямую зависит- от количестваI ; микробных тел, находящихся на ней. В то же время, обнаружение атрофических и метапластических процессов не зависело от степени обсеменения. Этот факт подтверждает положение о том, что на процессы трансформации слизистой оболочки влияет, в первую очередь, тип штамма, а не количество микроорганизма. Данный раздел исследования был посвящен ; выявлению У этиологической взаимосвязи различных по характеру воспалительных изменений со стороны слизистой оболочки гастродуоденальной области и f вирусов семейства Herpesviridae.
При изучении методом ПЦР биопсийного материала слизистой оболочки на наличие вирусов группы герпеса было обнаружено, что представители семейства Herpesviridae встречаются с различной степенью; частоты (табл.8). С наибольшей частотой обнаруживали- -/.; .- - цитомегаловирусы, а также вирусы герпеса человека 6, 7, 8 типов, при этом вероятность их обнаружения была значительно выше в деструктивно измененной слизистой. Вирусы простого герпеса 1-го и 2-го типов не были обнаружены ни в одном из 104 образцов биоптатов слизистой оболочки гастродуоденальной области. Вирус варицелла зостер и вирус Эпштейна- ; Барр были обнаружены лишь в единичных случаях и только при деструктивном воспалении слизистой оболочки. Вирус герпеса человека 8-го типа - только при хронических воспалительных заболеваниях. Цитомегаловирус, вирусы герпеса человека 6-го и 7-го типов чаще всего регистрировали в деструктивной слизистой оболочке, но в отдельных случаях и в другой группе.
При более детальном анализе частоты встречаемости исследуемых /; : микроорганизмов в биопсийном материале оказалось, что можно выделить несколько вариантов сочетания патогенных агентов в биоптате слизистой оболочки (рис.3). При поверхностном воспалении: первый вариант " — ... ,/-моноинфицирование только Н. pylori — регистрировался в 58 % случаев (патогенные штаммы); второй вариант — моноинфицирование только вирусами группы герпеса - был отмечен в 11 % случаев; третий вариант — микст-инфицирование Н. pylori и вирусами семейства герпеса — в 31 % случаев. При деструктивных процессах в слизистой оболочке в отсутствии Н. pylori обнаруживали ЦМВ, ВГЧ - 6,-7,-8 в 18 % случаев. В случаях микст Г инфицирования можно было выделить ещё два подварианта. Первый — наличие Н. pylori и какого либо одного из представителей Herpesviridae -в 31 % случаев микст-инфицирования. В этом случае с наибольшей частотой определяли ВГЧ-7. И второй - наличие Н. pylori и сочетание двух или более вирусов группы герпеса - в 79 % случаев. В этом подварианте с / большей частотой определяли ВЭБ, ВГЧ - 6, ВГЧ - 7 и ВГЧ - 8. Проведенные исследования по определению микроорганизмов, Д инфицирующих слизистую оболочку тастродуоденальной области при!V ; различной степени ее повреждения показывают, что при деструктивных процессах в очаге воспаления чаще и в более широком спектре , встречаются вирусы группы герпеса. При этом выявлены случаи деструктивного воспаления слизистой оболочки, вызванного вирусами герпеса в отсутствии Н. pylori.
Исследование гуморального иммунного ответа к Н. pylori и вирусам группы герпеса
При оценке популяционного и субпопуляционного; состава лимфоцитов периферической крови были получены следующие -данные. Следует отметить выявленное повышение уровня СВЗ+ клеток, как при поверхностном, так и при деструктивном повреждении слизистой оболочки по сравнению с контрольной группой. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий в абсолютных значениях, то же происходило при подсчёте как GD3+CD4+ лимфоцитов, так и, CD3+CD8"b : лимфоцитов. И было выявлено значимое снижение абсолютного числа ;. CD16+ CD56+ клеток при воспалительных процессах в слизистой оболочки. В абсолютных значениях числа В-лимфоцитов не было выявлено значимых ;, различий, хотя обращает на себя внимание некоторое увеличение числа этих /.; клеток при поверхностном воспалении. При оценке относительного состава лимфоцитов периферической крови была выявлена незначительные тенденции к росту Т-лимфоцитов и . снижению NK-клеток при обеих нозологических формах хронического воспаления слизистой оболочки гастродуоденальной области (рис. 11, табл. 15).
Сравнение абсолютных значений количества лимфоцитов различных: ..; субпопуляций периферической крови (табл: 15): показало статистически . значимый рост общей субпопуляции Т-лимфоцитов (CD3+) при, :: отчетливой тенденции к росту одновременно субпопуляций Т-хелперов (CD3+4+) и цитотоксичесх Т-клеток: (CD3+8+), при снижение чйслаШК- клеток (GDI6+56+), которое при деструктивном воспалении становилось статистически достоверным. По количественным значениям субпопуляции В-лимфоцитов (CD19+) между группами достоверных различий не Ч выявлено. Таким образом, в периферической крови наблюдался сдвиг ;: , содержания лимфоцитов в сторону увеличения клеток Т-лимфоцитов, : регулирующих иммунные реакции, а так же снижения числа естественных киллеров (CD 16+56+), что может свидетельствовать о дисбалансе систем врожденного и адаптивного иммунного ответа на инфекционные агенты. При количественной оценке уровня провоспалительных цитокинов ИЛ-ір, ИЛ-2, ИФу периферической крови было обнаружено существенное увеличение их уровней у пациентов с патологией слизистой гастродуоденальной области (рис. 12). Статистически значимых различий-в количестве сывороточных ИЛ-1(3, ИЛ-2, при поверхностном и деструктивном воспалениях выявлено не было.
Однако при деструктивных процессах уровень сывороточного ИФу : : значительно превышал аналогичный показатель в группе сравнения и в і;. труппе с поверхностным воспалением слизистой оболочки(р 0,05)1 При сопоставлении этих данных с данными по количеству лимфоцитов в периферической крови была обнаружена обратная ;;" зависимость между концентрацией провоспалительных цитокинов и числом В-лимфоцитов при инфицировании вирусами герпеса (г = 0 64), а-- .-. ;.. , также было обнаружено, что наименьшие концентрации этих цитокинов;/ ; были зарегистрированы при Н. pylori-моноинфекции., Также была выявлена тенденция к росту уровня ИЛ-1 (3 и ИФу при; микст-инфицировании Н. pylori и вирусами Эпштейна-Барр и герпеса 6-го, 7-го, . 8-ГО ТИПОВ.
