Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Введение 10
1.2. Взаимодействие M.tuberculosis с мононуклеарными фагоцитами хозяина 13
1.3. Нейтрофилы и туберкулез 17
1. 4. Воспаление при туберкулезе 22
1.4. 1. Образование гранулем 22
1. 4. 2. Регуляция воспаления 27
1. 4. 3. Цитокины семейства IL-6 28
1. 5. Заключение 31
2. Материалы и методы 33
2.1. Лабораторные животные 33
2.2. Микобактериальные культуры 33
2.3. Заражением tuberculosis H37Rv 34
2.4. Определение количества микобактерий в органах зараженных животных 35
2.5. Антигены 35
2.6. Среды и растворы 36
2.7. Получение поликлональных антител к IL-11 мыши 37
2.8. Получение суспензии клеток легкого 39
2.9. Получение суспензии клеток костного мозга 39
2.10. Получение культуры ДК 40
2.11. Нагрузка ДК антигеном 40
2.12. Иммунизация ДК 41
2.13. Анализ клеток методом проточной цитофлуориметрии 41
2.14. Определение продукции цитокинов 42
2.15. Выделение суммарной РНК из суспензии клеток 43
2.16. Получение кДНК 44
2.17. Определение продукции цитокинов и хемокинов клетками методом ПЦР в реальном времени 45
2.18. Определение продукции цитокинов и хемокинов клетками легкого методом микроэррей 45
2.19. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 46
2.20. Приготовление компетентных клеток Escherichia coli 46
2.21. Трансформация клеток Е. coli 47
2.22. Проверка индукции синтеза рекомбинантных белков в штамме Ml5 E.coli 48
2.23. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 48
2.24. Определение растворимости белков 50
2.25. Получение препаративных количеств рекомбинантных белков 50
2.26. Выделение и очистка белков методом металл-хелатной хроматографии 51
2.27. Гистологические исследования 52
2.27.1. Приготовление крио-срезов 52
2.27.2. Приготовление парафиновых блоков 52
2.28. Статистическая обработка результатов 53
3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Модулирование воспаления введением диклофенака и выращенных in vitro дендритных клеток 54
3.2. Роль IL-11 в воспалении 58
3.2.1. При туберкулезной инфекции у генетически чувствительных мышей увеличивается уровень IL-11 58
3.2.2. Блокирование IL-11 антителами 61
3.2.3. Клеточная инфильтрация и иммунный ответ в легких 64
3.2.4. Аутокринная регуляция IL-11 на уровне транскрипции 67
3.2.5. Блокировка рецептора IL-11 мутантной формой IL-11 69
3.2.5.1. Получение искусственного гена /7-77 и его мутанта 69
3.2.5.2. Изучение влияния рекомбинантного IL-11 дикого типа и его мутантной формы на течение экспериментального ТБ 73
3.3. Блокировка туберкулезного воспаления ткани легкого пептидом NBD 80
Заключение 89
Выводы 92
Список используемых сокращений 93
Литература 96
- Нейтрофилы и туберкулез
- Получение суспензии клеток легкого
- Приготовление компетентных клеток Escherichia coli
- Изучение влияния рекомбинантного IL-11 дикого типа и его мутантной формы на течение экспериментального ТБ
Нейтрофилы и туберкулез
Значительная часть информации о патогенезе ТБ была получена экспериментальным путем. Как и при многих других медико-биологических исследованиях, основным объектом для изучения экспериментального ТБ служат инбредные лабораторные мыши, что объясняется следующими причинами. Во-первых, человек и мышь характеризуются сходными показателями основных параметров врожденного и адаптивного иммунного ответа на микобактерии, включая протективную роль Т-лимфоцитов CD4 , IFN-у и TNF-a [North RJ and Jung YJ, 2004; Апт AC, Кондратьева TK, 2008; Apt A, Kramnik I, 2009; Orme ГМ et al., 2015]. Во-вторых, правильный подбор линий мышей и их гибридов позволяет получить разнообразные картины ТБ, сходные с многообразием клинических форм ТБ у людей [Apt, 2011]. Представление о том, что модель экспериментального ТБ на мышах неадекватно отражает процессы, происходящие у людей с клиническими формами заболевания, явно теряет актуальность [Radaeva TV et al., 2008; Ehlers S et al., 2001; Kondratieva EV et al., 2007]. Используя генетические особенности специально подобранных линий мышей, оказалось возможным моделировать практически все черты патогенеза ТБ, за исключением образования каверн [Kaufmann SHE, Britton WJ 2008; Apt A and Kramnik I, 2009]. Моделирование туберкулезной инфекции на мышах предоставляет возможность изучать динамику развития этой инфекции от самого момента инфицирования до появления тяжелых патологических процессов в легких. В-третьих, исследования на лабораторных мышах обеспечены бесконечным рынком реактивов и тест-систем для иммунологических и генетических экспериментов, тогда как для других лабораторных животных аналогичный рынок достаточно скуден. Недаром на совещании Nffl по исследованию ТБ было рекомендовано считать моделирование инфекции на лабораторных животных, и, прежде всего на мышах, методом выбора для анализа патогенеза, иммунного ответа и генетического контроля заболевания [Smith et al., 2005].
ТБ является преимущественно легочным заболеванием. Инфицирование Mycobacterium tuberculosis происходит, когда бактерии попадают в организм хозяина воздушно-капельным путем. После попадания микобактерий в организм хозяина через респираторный тракт возможны следующие основные варианты развития событий [Orme IM et al., 2015; Dorhoi A et al., 2011; Dannenberg A. M. et al., 1982, 1993]: 1) первичный ответ может убить все поступившие микобактерий, и туберкулез не разовьется; 2) микобактерий могут начать размножаться, и у пациента проявятся клинические признаки заболевания; 3) какое-то количество микобактерий может пережить эффекторную фазу ответа, и остаться в "спящем" состоянии; 4) латентные микобактерий могут возобновить размножение, что клинически проявится в виде так называемого реактивационного туберкулеза. Клеточный иммунный ответ организма хозяина (врожденный и приобретенный) определяет развитие инфекции. При адекватном иммунном ответе развитие инфекции может быть ограничено вскоре после попадания микобактерий в легкие. Если же клеточный иммунитет не оптимален и не элиминирует инфекцию, фагоциты, содержащие М. tuberculosis, могут выходить из очагов и распространяться по лимфатическим и кровеносным сосудам, результатом чего может быть быстрая диссеминация. При неадекватном ответе иммунная система организма-хозяина постоянно борется с размножающимися микобактериями, что может сопровождаться разрушением легочной ткани, повреждением легких и дальнейшим распространением микроорганизмов через лимфу и кровь.
Неспособность иммунной системы защитить организм хозяина от патогенного воздействия микобактерий зависит от многих причин, однако, можно выделить две основных:
модуляция иммунного ответа самой М. tuberculosis, которая позволяет ей выживать, размножаться и вызывать болезнь [Russel DG, 2007];
различные дефекты самой иммунной системы на различных уровнях [Casanova JL and Abel L, 2002; 2004].
Исследованию механизмов, обеспечивающих развитие защитного или, наоборот, патологического ответа, посвящено большое количество исследований. К ним, в первую очередь, относятся исследования реакций естественного иммунитета, которые могут играть важную роль на ранних этапах туберкулезной инфекции. Поскольку основными клетками, фагоцитирующими микобактерий, являются макрофаги, эти работы базируются, в основном, на изучении активности макрофагов человека и лабораторных животных и их взаимодействия с микобактериями [Wilson et al., 1998; Majorov KB et al., 2003; Gutierrez MG et al., 2004]. Вторая группа работ касается изучения формирования приобретенного иммунного ответа у больных туберкулезом, а также у экспериментальных животных, зараженных микобактериями или иммунизированных микобактериальными антигенами [Dorhoi A et al., 2011; Kapina MA et al., 2007; Orme IM et al., 1999]. Наконец, третья группа работ включает в себя исследования патологических изменений в инфицированных тканях с помощью гистологических
Получение суспензии клеток легкого
В работе использовали клетки Е. coli штамма Ml5. Клетки штамма Ml5 рассевали на твердую среду LB (10 г/л tryptone (helicon), 5 г дрожжевой экстракт (DIFCO Laboratories), 10 г/л NaCl (ICN, США), 15 г/л Bacto agar (DIFCO Laboratories) с антибиотиком, канамицином (Km) (SIGMA), и инкубировали ночь при +37С. На утро следующего дня в пробирку для спектрофотометра со средой LB (10 г/л tryptone (helicon), 5 г дрожжевой экстракт (DIFCO Laboratories), 10 г/л NaCl (ICN, США)) (3,5мл) засевали всю культуру с чашки и суспендировали. Затем измеряли оптическую плотность при длине волны (к) 550нм, засевали колбу со средой для электропорации из расчета 1,5 оптических единицы (D) - 1/100 от объема. В среду добавляли Km. Культуру растили на термостатируемом орбитальном шейкере Enfors НТ Ecotron при +37С, 200 об/мин до значений оптической плотности D=0,3-K),5. Далее переливали культуру в пробирки для центрифугирования и охлаждали во льду в течение 15-20 минут, после чего центрифугировали 1 минуту 2500g и +4С на центрифуге Heraeus Multifuge ls-r. Максимально удаляли супернатант, и суспендировали осадок в равном объеме холодной (+4С) mQ воды. Затем центрифугировали 15 минут при 2500g и +4С. Удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в 0,5 объема холодной (+4С) mQ воды и снова центрифугировали 2500g и +4С. Удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в 1 мл холодного (+4 С) 10% глицерина и центрифугировали 2500g +4С. Снова удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в конечном объеме холодного (+4С) 10% глицерина из расчета 80 мкл на одну пробу. Суспензию клеток хранили при -70С не более 6 месяцев.
Для трансформации клеток Е.соИ использовали метод электропорации. Аликвоту клеток Е.соИ штамма Ml5 размораживали на льду и в охлажденной на льду 1 , 5мл пр о йр ю смешивали 8 0 мкл суспензии клеток и 2 мкл плазмидной ДНК, растворенной в mQ воде, хорошо перемешивали и оставляли на льду на 1-2 мин. Затем переносили смесь клеток и ДНК в охлажденную кювету для электропорации, помещали кювету в камеру и до юдили ее до контактов. После воздействия электрическим током, доставали кювету, добавляли 1 мл среды LB (без антибиотиков) и энергично перемешивали. Далее суспензию клеток переносили в пробирку и «подращивали» 1 час на термостатируемом орбитальном шейкере при 200 об/мин и +37С.
На всех стадиях индукции культуру центрифугировали при 2500g 10 мин. Из культур клеток E.coli, которые были трансформированы рекомбинатными плазмидами, и контрольных клеток (E.coli штамм М 15) готовили по 3,5 мл ночных культур на жидкой среде LB с Km. На следующий день в стерильных условиях каждую пробу ночной культуры смешивали в соотношении 1/10 со средой LB, содержащей Km и выращивали на термостатируемом орбитальном шейкере при 200 об./мин при +37С до значений оптической плотности при длине волны 550 нм Ds5o= 0,9-1,1 о.е. (оптических единиц). Из каждой пробы отбирали по 500 мкл культуры (контроль до индукции), центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость, осадок хранили при - 20С. В остальной объем добавляли раствор индуктора -0,1 М IPTG (1 мкл индуктора на 1 мл среды) и растили пробы на термостатируемом орбитальном шейкере при 200 об/мин 3-4 часа при +37С до стационарных значений оптической плотности (2-4 ч). Из каждой пробы отбирали по 500 мкл культуры (контроль индукции), центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость, осадок хранили при - 20С. Оставшиеся 2,5 мл культуры (контроль растворимости белка) отбирали в чистую пробирку, центрифугировали и хранили сухой осадок при - 20С.
Для обнаружения индуцированных белков в лизатах трансформировнных клеток проводили электрофорез (ЭФ) проб в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ПААГ-SDS) по Лэммли [Laemmli UK, 1970]. Рабочий (разделяющий) ПААГ готовили за несколько дней до ЭФ, в концентрации (10-17%), зависящей от молекулярной массы белков. Состав 10%) ПААГ-SDS на 1 стекло: 3,1 мл д. вода, 1,7 мл 1,5 М трис-HCl рН 8.8, 2,5 мл раствор АА/МБА 30/1, 75 мкл 10% SDS, 10 мкл ТЕМЕД, 80 мкл 10% APS. Соединяли последовательно все компоненты, быстро тщательно перемешивали, заливали стекло. Чтобы исключить контакт с кислородом, на гель осторожно наслаивали бутанол до высоты 3-5 мм; время полимеризации составляло 30-40 минут. Хранили гель при +4С в закрытой влажной камере. Концентрирующий (формирующий) гель готовили непосредственно в день ЭФ. Состав 5% ПААГ-SDS на 1 стекло: 1,8 мл д. вода, 315 мкл 1М трис-HCl рН 6.8, 415 мкл раствор АА/МБА 30/1, 25 мкл 10% SDS, 5 мкл ТЕМЕД, 50 мкл 10% APS. Соединяли последовательно все компоненты, быстро тщательно перемешивали, заливали на стекло с готовым разделяющим гелем, вставляли гребенку. Время полимеризации составляло 15-30 мин, в этот момент готовили пробы.
Осадок клеток растворяли в 1х лизирующем буфере с краской (1 мл 1 М трис-HCl рН 6.8, 4 мл 10% SDS, 400 мклР -меркаптоэтанола, 2 мл краски (4 г глицерина, 25 мг бромфенола, 25 мг ксиленцианола - до 20 мл д. воды) - до 20 мл дистиллированной воды) в объеме, зависящем от показателей оптической плотности выращенной культуры (50 мкл буфера на 1 оптическую единицу), прогревали в термостате 10 мин при +95С. На гель наносили 3-15 мкл пробы, чтобы конечная концентрации белков в лунках не превышала 5,0 мг/мл. Когда краска достигала границы с буфером, гель вынимали из стекол.
Приготовление компетентных клеток Escherichia coli
Затем мы сравнили тяжесть поражения легочной ткани у контрольных и подопытных мышей. У мышей двух контрольных групп на 24 день после инфицирования обнаруживаются диффузные очаги специфического воспаления как вокруг бронхов, так и по периферии. Наблюдается общее полнокровие и умеренный отек ткани (Рис. 16А). Гранулемы у животных контрольной группы, получавшей физиологический раствор, не имеют признаков некроза. У мышей получавших IL-11 дикого типа обнаруживаются участки ткани, содержащие мелкие некротические зоны (рис.16 Б). У группы, получавшей мутантную форму IL-11, уровень воспаления значительно снижен по сравнению с двумя контрольными группами (Рис. 16 В). г.
Различия в уровне инфильтрации и образования очагов воспаления в ткани легкого на 24 день (А-В) и 3 2 день (Г-Е) после инфицирования в контроле (А, Г), при введении IL-11 (Б, Д) и мутантной формы IL-11 (В, Е). Окраска гемотоксилин/эозин, увеличение х90. —- очаги некроза На 32 день после заражения у мышей двух контрольных групп воспаление усиливается, появляются массивные сливающиеся инфильтративные участки (рис. 16 Г, Д). При введении IL-11 дикого типа обнаруживается появление в толще инфильтрата большого количества мелких очагов некроза, а также скопление пенистых макрофагов и нейтрофилов. В легких мышей, получавших мутантныи IL-11, уровень воспаления оказался значительно ниже по сравнению с двумя контрольными группами (Рис. 16Е).
Таким образом, результаты экспериментов с мутантной формой IL-11 дают возможность заключить, что раннее повышение уровня IL-1 1 в ответ на инфекцию оказывает неблагоприятный для хозяина эффект, подтверждая данные, полученные при использовании антител к IL-11.
Анализ клеточного состава легких зараженных мышей также подтверждает этот вывод. Введение мутантного IL-11 приводит к достоверному снижению содержания в легочной ткани основных клеток воспаления -макрофагов и нейтрофилов уже на первый срок наблюдения (Рис. 17). К 32 дню после заражения различия становятся еще ярче. Введение мутантного IL-11 приводит к значительному снижению инфильтрации легочной ткани всеми клетками иммунной системы - нейтрофилами, макрофагами, Т- и В-лимфоцитами - по сравнению с мышами контрольной группы, тогда как введение IL-11 дикого типа приводит к резкому возрастанию инфильтрации, что согласуется с результатами гистологических исследований (рис. 17). Г.
Содержание лимфоидных клеток в легких зараженных мышей. Через 24 и 32 дня после заражения клетки легких контрольных и подопытных мышей инкубировали с антителами CD8L-APC (A), CD4-PerCP (Б), CD19-PE (В), Ly6G-FITC (Г), F4/80-PE (Д) и анализировали на цитофлуориметре. -общий контроль;- IL-11 дикого типа; - мутантный IL-11. Данные двух независимых экспериментов (М ± SD, N=5). Анализ экспрессии в легочной ткани генов, кодирующих основные факторы воспаления, на 32 день после заражения подтвердил результаты физиологических наблюдений. Введение мутантной формы IL-11 привело к снижению экспрессии генов, кодирующих воспалительные и иммуномодулирующие цитокины и хемокины IL-11, IL-6, mmp8, Мір-la, TNF-a, IFN-y и IL-12 (рис. 18). Напротив, введение IL-11 дикого типа привело к увеличению экспрессии провоспалительных факторов Мір-la и IL-6.
Селективный блок рецептора IL-11 приводит к снижению экспрессии генов факторов воспаления. На 32 день после заражения из легких мышей выделяли mRNA и методом ПНР в реальном времени оценивали экспрессию генов для цитокинов и хемокинов. Анализ экспрессии генов проводился с использованием гена GAPDH с постоянным уровнем экспрессии в качестве контроля. - достоверное отличие, р 0,05 - общий контроль; IL-11 дикого типа; - мутантный IL-11. Таким образом, наши исследования роли IL-11 в развитии воспаления при экспериментальной ТБ инфекции дают возможность предположить, что этот цитокин является провоспалительным. Увеличение содержания IL-11 в очаге инфекции при развитии ТБ ведет к прогрессированию воспаления и секреции провоспалительных JL-6 и Мір-1а, что смещает ответ в сторону формирования некротических очагов. Селективный блок рецепторного комплекса IL-llR/gpl30 снижает тяжесть патологии. При этом, блокирование рецептора не влияет на рост микобактерий в легких, что согласуется с некоторыми другими исследованиями, в которых иммунопатология и время выживания мышей не зависили от количества микобактерий в органах [Kaushal D et al., 2002; Lyadova I et al., 2010]. Таким образом, удаление IL-11 или блокирование его сигнала усиливает защитный ответ хозяина при ТБ.
Исследования последних двух десятилетий показали ключевую роль транскрипционного фактора NF-kB в регуляции процессов острого и хронического воспаления [Barnes, Karin М, 1997; Bohrer et al., 1997; Lawrence et al., 2001]. Нарушение активации NF-kB приводит к несбалансированному воспалительному ответу, что имеет тяжелые последствия при самых разных заболеваниях. Например, на модели ревматоидного артрита у мышей, было показано, что селективное ингибирование классического пути активации NF-kB за счет блока у -субъединицы комплекса ГКК (NEMO) пептидом NBD, приводит к подавлению хронического воспаления in vivo [Jimi et al., 2004]. Пептид NBD это искусственно синтезированный фрагмент Р-субъединицы ГКК-комплекса (Т735 — Е745 TALDWSWLQTE), который отвечает за взаимодействие с NEMO. NBD предотвращает образование ГКК-комплекса [May MJ et al., 2000]. В качестве контроля в подобных экспериментах используют контрольный пептид, который не способен блокировать ГКК-комплекс, то есть пептид NBD, несущий аминокислотные замены: два ключевых триптофана заменены на аланины (TALDASALQTE). Для доставки пептидов в цитоплазму эти пептиды синтезировали совместно с последовательностью пептида antennapedia из Drosophilla melanogastra, способного проникать через клеточную мембрану.
Поскольку и при ТБ основным механизмом патогенеза является хроническое воспаление, мы решили изучить влияние селективной супрессии NF-kB на развитие экспериментальной инфекции у мышей. Схема эксперимента представлена на рисунке 19.
Мышей I/St аэрозольно инфицировали вирулентным штаммом М. tuberculosis штамма H37Rv в дозе 100 КОЕ/мышь. В течение третей недели после заражения мышам опытной группы внутритрахеально, аэрозольно, вводили NBD-пептид в дозе 0,01 мкг/25 мкл на мышь трижды за неделю, а мышам контрольных групп - контрольный пептид (NBD-пептид у которого два ключевых триптофана заменены на аланин) в дозе 0,01 мкг/25 мкл на мышь и раствор 0,9MNaCl по аналогичной схеме (рис. 19).
Изучение влияния рекомбинантного IL-11 дикого типа и его мутантной формы на течение экспериментального ТБ
Анализ экспрессии в легочной ткани генов, кодирующих основные факторы воспаления, на 32 день после заражения подтвердил результаты физиологических наблюдений. Введение мутантной формы IL-11 привело к снижению экспрессии генов, кодирующих воспалительные и иммуномодулирующие цитокины и хемокины IL-11, IL-6, mmp8, Мір-la, TNF-a, IFN-y и IL-12 (рис. 18). Напротив, введение IL-11 дикого типа привело к увеличению экспрессии провоспалительных факторов Мір-la и IL-6.
Селективный блок рецептора IL-11 приводит к снижению экспрессии генов факторов воспаления. На 32 день после заражения из легких мышей выделяли mRNA и методом ПНР в реальном времени оценивали экспрессию генов для цитокинов и хемокинов. Анализ экспрессии генов проводился с использованием гена GAPDH с постоянным уровнем экспрессии в качестве контроля. - достоверное отличие, р 0,05 - общий контроль; - IL-11 дикого типа; - мутантный IL-11. Таким образом, наши исследования роли IL-11 в развитии воспаления при экспериментальной ТБ инфекции дают возможность предположить, что этот цитокин является провоспалительным. Увеличение содержания IL-11 в очаге инфекции при развитии ТБ ведет к прогрессированию воспаления и секреции провоспалительных JL-6 и Мір-1а, что смещает ответ в сторону формирования некротических очагов. Селективный блок рецепторного комплекса IL-llR/gpl30 снижает тяжесть патологии. При этом, блокирование рецептора не влияет на рост микобактерий в легких, что согласуется с некоторыми другими исследованиями, в которых иммунопатология и время выживания мышей не зависили от количества микобактерий в органах [Kaushal D et al., 2002; Lyadova I et al., 2010]. Таким образом, удаление IL-11 или блокирование его сигнала усиливает защитный ответ хозяина при ТБ.
Исследования последних двух десятилетий показали ключевую роль транскрипционного фактора NF-kB в регуляции процессов острого и хронического воспаления [Barnes, Karin М, 1997; Bohrer et al., 1997; Lawrence et al., 2001]. Нарушение активации NF-kB приводит к несбалансированному воспалительному ответу, что имеет тяжелые последствия при самых разных заболеваниях. Например, на модели ревматоидного артрита у мышей, было показано, что селективное ингибирование классического пути активации NF-kB за счет блока у -субъединицы комплекса ГКК (NEMO) пептидом NBD, приводит к подавлению хронического воспаления in vivo [Jimi et al., 2004]. Пептид NBD это искусственно синтезированный фрагмент Р-субъединицы ГКК-комплекса (Т735 — Е745 TALDWSWLQTE), который отвечает за взаимодействие с NEMO. NBD предотвращает образование ГКК-комплекса [May MJ et al., 2000]. В качестве контроля в подобных экспериментах используют контрольный пептид, который не способен блокировать ГКК-комплекс, то есть пептид NBD, несущий аминокислотные замены: два ключевых триптофана заменены на аланины (TALDASALQTE). Для доставки пептидов в цитоплазму эти пептиды синтезировали совместно с последовательностью пептида antennapedia из Drosophilla melanogastra, способного проникать через клеточную мембрану.
Поскольку и при ТБ основным механизмом патогенеза является хроническое воспаление, мы решили изучить влияние селективной супрессии NF-kB на развитие экспериментальной инфекции у мышей. Схема эксперимента представлена на рисунке 19.
Мышей I/St аэрозольно инфицировали вирулентным штаммом М. tuberculosis штамма H37Rv в дозе 100 КОЕ/мышь. В течение третей недели после заражения мышам опытной группы внутритрахеально, аэрозольно, вводили NBD-пептид в дозе 0,01 мкг/25 мкл на мышь трижды за неделю, а мышам контрольных групп - контрольный пептид (NBD-пептид у которого два ключевых триптофана заменены на аланин) в дозе 0,01 мкг/25 мкл на мышь и раствор 0,9MNaCl по аналогичной схеме (рис. 19).
Различия в уровне инфильтрации и образования очагов воспаления в ткани легкого на 32 день после заражения. Пептид NBD (В, Е), контрольный пептида (Б, Д) и общий контроль (А, Г). Представлены результаты одного из трех аналогичных экспериментов (окраска гемотоксиллин-эозин). X 22,5 (А, Б, В)и180(Г,Д,Е). Селективный блок «классического» пути активации транскрипционного фактора NF-kB у чувствительных к ТБ мышей I/St привел к возникновению выраженных различий в гистологической картине воспаления ткани легких в отличие от групп сравнения. Так, в контрольной группе воспалительные очаги диффузного характера располагались преимущественно в центральных отделах легочной ткани (рис. 20 А). В группе с контрольным пептидом очаги специфического воспаления сливались между собой, образуя крупные и средние пневмонические фокусы (рис. 20 Б). В группе с NBD пептидом участки воспаления были небольшого размера и хорошо отграничены от окружающей легочной ткани, а степень инфильтрации была ниже (рис. 20 В). Гранулемы в этой группе состояли из крупных макрофагов и эпителиоидных клеток, практически отсутствовали лимфоциты (рис. 20 Е). Напротив, в двух других группах в гранулемах присутствовало большое количество лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов (рис. 20 Г, Д).
Таким образом, селективное ингибирование «классического» пути активации транскрипционного фактора NF-kB при ТБ приводит к снижению степени инфильтрации, и уровня воспаления в легочной ткани. При этом, блокирование NF-kB в легочной ткани никак не влияло на количество микобактерий в легких чувствительных к ТБ мышей (рис. 21). Эти результаты согласуются с данными группы И. В. Лядовой, согласно которым у генетически гетерогенных мышей F2 с различной чувствительностью к ТБ количество микобактерий в легочной ткани не коррелирует с тяжестью течения заболевания [Lyadova IV et al., 2010].
