Введение к работе
ктуальность темы.
Наиболее обиая и, видимо, наиболее важкая концепция, диитув-ая необходимость детального исследования роли МНС в восприимчк-эсти, развитии и конечном результате инфекционных заболеваний, -го распознавание различными типами Т-клеток любых антигенных мо-зкул только при условии 4-зической связи их процессированных родуктов с молекулами МНС (вииз S. et al. , 1987; Poljak R. , Эет)..-^Различкя в эффективности связывания антигенных пептидов эзбудителя продуктами разных аллелей МНС, их презентации продук-ши ШС Т-клеткам и зависящем от ШС репертуаре рецепторов Т-кле-ж могут заметно влиять на общий уровень восприимчивости к ин-зкции, поскольку последний зависит как от факторов естественной ззистентности (контролируемых не-ШС генами), так и от реакций зиобретенного иммунитета, контролируемых ШС.
Кроме того, .ирсжое распространение получил популяционный семейный анализ ассоциаций широкого спектра злокачественных, ггоиммунных, инфекционных и других заболеваний с наследованием 1ПЛ0ТИ1105 МНС человека - комплекса HLA . Дяя некоторых заболе-іний, в том числе инфекционных, установлен достоверный уровень ісоциации (сцепления) восприимчивости с конкретными аллеляыи ге->в или гаплотипов Н1А (Pine P. , 1981; De Vriea R. et al. , )88). В частности, это касается значительного увеличения часто-I аллеля №2 у больных туберкулезом по сравнению с контрольной >уппой в разных популяциях человека (Khomenko A. et al. , 1990), о указывает на зависимость предрасположенности к этой инфекции ШС.
-2.-
Несмотря на очевидные предпосылки к всестороннему изучению
роли комплекса Н-2 в генетическом контроле восприимчивости к ин
фекциям, в частности - микобахтериальным, у мышей, подобных ис
следований крайне мало. Изучение контроля иммунного ответа на
антигены микобактерий комплексом Н-2 ( Ivanyi J., Sharp к. ,
1986; Huygen К. et al, 1988) показали зависимость уровня Т-
и В-клеточных ответов от генов Н-2, но не позволила с уверен
ность» судать об их связи с протективным иммунитетом и типом вос
приимчивости к икбекту (чувствительный/резистентный). Свой вклад
в подобную неопределенность вносит крайне сложная антигенная ком
позиция возбудителя и, по-видимому, дихотомия в типе ответа на
разные антигены - индукторные реакции на одни антигены и супрес-
сорные на другие ( Oliveira D., Mitchison її. , 1989). Все хе,
сцепление контроля восприимчивости с комплексом Н-2 при микобак-
ТйрИОЗах бЫЛО установлено З ОТНОШеШШ М. lepraemurium ( Curtis
j. et al. ,1982), но картирование генов класса I и II, контролирующих инфекцию, проведено не было.
Необходимость получения четких данных о контроле комплексом Н-2, гомологом комплексе тл человека, такой.важной инфекции как туберкулез и отсутствие сколько-нибудь надежной оценки корреляции мевду иммунным ответом и восприимчивостью при большинстве инфекций обусловливает актуальность темы исследования и диктует необходимость комплексного подхода к проблеме: изучение генов класса I и класса II, иммунного ответа in vivo и in vitro , восприимчивости и иммунного ответа, вакцинации и заражения. ]1ет> и :здачи исследования.
Целью исследования был всесторонний анализ регуляции взаимо-.х. действия перазит-хозямн комплексе, Н-2 нз модели эксперимента ль-
го туберкулеза. На основании изучения роли генов- комплекса Н-2 формировании противотуберкулезного иммунитета, вкладе этих IOB - в зависимости от аллельной композиции у хозяина - в вос-іимчивость к инфекции (определение аллелей "чувствительности" 'резистентности"),влияния комплекса Н-2 на »ффективность вак-іации, связи между уровнем ответа и сопротивляемостью к инфекции га разработана концепция генетической регуляции балансовых отнг-»1й между паразитом и хозяином, осуществляемой генами МНС. Б [зи с зтим были поставлены следующие задачи:
-определить уровень восприимчивости к туберкулезу у сирокой іели линий мышей, конгенных по Н-2;
-картировать на рекомбинвнтных по Н-2 линиях предполагаемые їличия з уровне восприимчивости;
-проверить наличие корреляции между степенью чувствитель-ти к инфекции и уровнем Т-иммунитета in vivo ;
-проанализировать генетическую рестрикцию ответов не мико-териальные антигени, в том челе на уровне клонов Т-клеток; -изучить возможную связь супрессии ответа при эксперименталь-туберкулезе с генетической композицией комплекса Н-2; -установить наличие или отсутствие корреляции меаду уровнем і ета Т-клеток и синтезом аигимикобактериальных антител у мышей, генных по Н-2. чная новизна.
Впервые установлены достоверные различия по уровню оопро-лясмости к туберкулезной инфекции у мншей в зависимости от зльней структуры комплекса Н-2. Показано, что от генов комл-:э Н-2 зависит не только восприимчивость к инфекции, но и фор-эвзние протективного действия живой вакцины bcg , поскольку
носители гаплотипа Н-2 вообще не обнаруживают эффекта вакцинами. Доказана корреляция мезду способностью к развитию реакции ГЗТ на антигены ыикобактерий после заражения и сопротивляемостью к инфекции.
Впервые на инфекционной модели удалось показать, что гены класса П комплекса Н-2 не только являются 1т -генами, контролирующими реакции Т-клеток на антигены возбудителя через механизмы презентации, но и представляют собой 1г -гены протективного иммунитета in vivo . Показано, что при прочих равных условиях аллель I-Ak выступает в роли "резистентного", а аллель I-Ab -"чувствительного" Ir-гена, хотя это не всегда коррелирует с их активность» в качестве 1г -генов реакций иммунитета. На уровне популяций иммунных лимфоцитов и Т-клонов установлена генетическая рестрикция ответов на антигены ыикобактерий по обоим генам класса П, 1-А и 1-Е, и приведены данные и соображения о вероятных физиологических различиях значения этих двух типов рестрикции в формировании противотуберкулезного иммунитета.
С помощью полученных оригинальными методами аллоантисыворо-ток (авт.свидетельство Я 1470059) установлено, что супрессия иммунного ответа, чрезвычайно характерная для тяжелой туберкулезной инфекции у мыши и человека, помимо других факте-ров, обусловлена I-J-положительными клетками. Впервые на vor.-.ти туберкулеза показані важная роль локуса 1-Е в формировании супрессии ответа. В частности, для снижения синтеза антител к антигенам микобакте-р-й, являющегося благоприятным фактором для появления относительно реь.істентшх фенотипов, необходима полноценная экспрессия молекул І-В . Это позволило подтвердить концепцию О НЄ'.'бхолИК'ОС-ти балансовых отношений меяюу индукцией отчета і: супрессии пр>-
утриклеточных инфекциях.
Разработана новая модель для изучения роли цитотоксических еток против инфицированных микобактериями макрофагов в течении фекции. Установлено,что даже при первичной локализации вирулент-х микобактерий исключительно в аллогенных по продуктам класса I крофагах, безусловно разрушаемых з организме хозяина, течение фекции столь же неблагоприятно, как при обычном типе заражения/ л данные позволяют сделать вывод, что действие цитотоксических етрк, в том числе рестриктированньпс по продуктам класса I Т-кил-ров CD8+ на инфицированные клетки-мишени, не участвует (или :ьма малозначимо) в формировании протективного иммунитета при 5еркулезе. іктическая значимость.
Хотя работа носит экспериментальный характер, ее практичес-i значимость определяется, во-первых, важностью для здравоохра-іия самой изучаемой инфекции (по данным ВОЗ, туберкулезом пора-ггся не менее 30 миллионов человек в год и до 3-х миллионов че-іек в год умирает от этой болезни)> и, во-вторых, высоким уров-I эволюционной, структурной и функциональной гомологии между ! человека - комплексом HLA - и мыши - комплексом Н-2. Впер- ! і выполненное комплексное исследование участия комплекса Н-2 «зличных аспектах регуляции взаимоотношении организма-хозяина іикобактериямн іюдиодит теоретическую базу под интенсивно изу-мую проблему " нla и туберкулез" и намечает пути дальнейших ледовчний. Особенно важной может оказаться связь конкретных . лотипов с отсутствием эффекта вакцинации. Кроме.того, заслу-ает внимания особая роль продукта 1-Е в формировании баланса ду супрессией и ответом при туберкулезе, поскольку с аналогом
.-6 -
гена 1-Е у человека - локусом щ - сцеплены (ассоциированы) уровень резистентности к туберкулезу и лепре и клинические про явления этих инфекций. Большая часть проведенных исследований финансировалась ВОЗ.
Материалы диссертации вошли э монографии "Иммуногенетика инфекционных заболеваний" (Авербах М.Ы, с соавт., 1985), "Проб лемы наследственности при легочной патологии" (1990) и в "Руко водство по инфекционной иммунологии", готовящееся к печати. Крч ме того, эти материалы используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИГ и курсантов ЩУ. Материалы диссертации неоднократно использовались в разработках ВОЗ. Ряд методов излс жен автором в "Практических рекомендациях по проведению иммунологических исследований при туберкулезе и других заболеваниях легких" (1985), рекомендованных Минздравом СССР к внедрению на всесоюзном уровне. Апробация работы.
Основные положения работы были заложены на Пленумах пробле ной комиссии АМН СССР "Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология" в Саратове (1987) и Ленинграде (1990), на ХУШ Всемирном генетическом конгрессе в Торонто (1989), на международно! конференции по фтизиатрии в Москве (1990). По материалам диссертации делались доклады на научных конференциях и межлаборагорны? семинарах в ЦНИИ туберкулеза (1985-1990), Центре по изучению генетики реэистента хозяина Университета Мак Гилла в Монреале (1990) и Исследовательском центре по туберкулезу Хаммерсмитов-ского госпиталя в Лондоне (1989).
По темо диссертации опубликовано 20 статей и одів моногргфи
Збъем работы.
Диссертация изложена на 270 страницах машинописи и состоит -із введения, обзора литературы (2 главы), изложения собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и библиографического указателя, включающего ссылки на 18 отечественных и 478 иностран іьк работ. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками.
Животные. Работа была проведена на 29 независимых инбред-№, конгенных, рекомбинантных и мутантной по Н-2 линиях мышей, і также гибридах Р1 и потомках возвратных скрещиваний ВСІ.
Названия линий, гаплотипы и генотипы Н-2 приведены в табли jax при изложении собственных результатов. В экспериментах ис-гальзованы животные в возрасте 2-4 месяцев, которые содержались і стандартных условиях. Поддержание инбредных линий осуществляюсь братско-сестринскими скрещиваниями с ведением родословных і племенного журнала, согласно рекомендациям, изложенным в руко-юдствах Н.Н.Медведева (1968) и З.К.Блондовой и соавт. (1983).
Микобактерии. В работе использованы два штамма микобактерий:
шрулентный Ы. tuberculosis H37Rv И вакцинный И. bovls ВСЯ.
)ба они поддерживались и готовились к введеш» в стандартных ус-гавиях. После 3-х недель культивирования на среде Левенштейна-Існсена собранная бактериальная масса подсушивались на фильтре, ізвешивалась, суспендировалась в физиологическом растворе з коч-іентрации I мг/мл и хранилась лри -70С до использования.
Заражение и вакцинация. Культура М. tuberouloeis H37Rv изодилась в латеральную хвостовую вену в дозе 25 мкг/мышь (соот-етстнует 2x10 КОЭ на среде Левенштейнд-йенсена) в объеме 0,5 мл
.-8-
физиологического раствора (Авербах М.М. с соавт., 1980). Регистрация гибели мышей проводилась ежедневно, начиная с 15 дня после заражения.
Культура и. bovis BGG вводилась подкожно в две точки спины в дозах, указанных при изложении результатов. Оптимальны! интервал для получения вакцинного эффекта между вакцинацией и заражением составил, по результатам предварительных опытов, 4-і недель, поэтому культура BCG вводилась впоследствие за 5 недел до заражения.
Иммунизация микобактериальными антигенами. Для получения иммунных лимфоцитов без предварительной системной вакцинации ил заражении, мышам вводили в подушечки задних лап один из слздуюіш препаратов: полный адъювант Фрейнда, содержащий убитые микобакті рий H37Ra - при исследовании супрессии отаета клетками заражение го легкого; дезинтегрированный ультразвуком растворимый препарат (соникат) H37Rr в неполном адьюванте Фрейнда - для определения уровня антител и пролиферативного ответа клеток регионарных лимфоузлов; аналогичный препарат BCG - для получения Т-клонов из регионарных лимфоузлов. Концентрация ыикобактериального материала составляла: І мг/пл І1АФ, I мг/мл H37Rv , V мг/мл BGG
Реакция ГЗТ, Прямое измерение туберкулиновых проб (реакция ГЗТ в подушечке лапы) проводился по описанному ранее методу (Авербах М.М. с соавт., 1980).
Лекальный перенос ГЭТ проводили путем введения 40 мкл полу-
ценной суспензии неприлипающих клеток (2x10 /мышь) в правую заднюю лапу интактных реципиентов, добавляя в среду 10 мкг/мл PPD (Никоненко Б.В. с соавт., 1989). Контрлатерально вводились такие же клетки без антигена.
Антитела к клеточным маркерам и обработка клеток. Гипериммунные- антисыворогки AKR va СВА, aHTH-Thy1.2, И 3R vs 5И> анти- l-Jk , были приготовлены с помощью 6-7-кратных внутрибрю-аинных иммунизации реципиентов, в первом случае клетками селезенки, а во втором случае - КонА-бластами тимоцигов доноров, с качельными интервалами, в дозе 10-15x10 клеток на мышь, по ранее описанным методам (Апт А,С. с соавт., 1984; Загретдинова З.М. : соавт., 1990).
В работе были использованы также моноклональные антитела
>
(мЛт) против продуктов класса П комплекса Н-2 и маркеров CD4 и. CD8 : I0-2-I6, анти-1-Ак, и 13/4, анти-1-Ек, ( Oi V. et al., ГС78); анти-ЬЗТ4 (?itch J., 1981); Н35-Ї7.2, aHrw-Lyt2 (Pier-гее M. et al. , 1982); 13V18 , анти- Lyt2.1 ( Cederlane).
Цитотоксическая обработка клеток проводилась в 2 этапа с інкубированием суспензий при 4С с антителами и при 37С с комплектом по I часу с последующей отмывкой.
Пролитеративные тесты. Клетки лимфоузлов зараженных или им-іунизированннх мышей культивировали 72-96 часов в лунках 96-лу-гочного плоскодонного планшета в атмосфере 5% СОр при 98% влаж-гости в полной культуральной среде при концентрации 2x10 клеток I мл (4x10 клеток на лунку) в объеме 200 мкл. В качестве ис-очника микобактериальных антигенов использовался РРВ в конеч-ои концентрации в культуре 10 мкг/мл или (при анализе Т-клонов) оникат BCG в той же концентрации. Контролем служили культуры ез добавления антигена или с добавлением убитой облучением 2,5 Мрад) культуры s. nureuo , или овальбумина (,0VA ) в той е концентрации. Пролиферация оценивалась по включению радиопк-ивной метки (синтезу ДНК). Интенсивность пролиферации виражали
-.10 -
либо ь абсолютных цифрах (число распадов в минуту) либо в виде индекса стимуляции.
Клонирование Т-лимфоцитов. Мыши СМ иммунизировались сони-катом BCG в неполном адьюванте Фрейнда в подушечки обеих задні лап. Через 9-14 дней регионарные лимфоузлы удалялись, готовшш суспензия клеток в полной кульгуральной среде, и клетки культиі
с.
ровали в концентрации 5-8x10 /мл в 7-Ю мл среды во флаконах w. 25 мл в вертикальном положении с антигеном в концентрации 10 мкг/мл. Через 48 часов часть клеток, обогащенная бластами на градиенте Фиколла 1,077, 20 мин., 2000 g, титровалась лимитирук щими разведениями до концентрации 5-50 клеток в I мл (1-Ю клеї на лунку) в полной культуральной среде, содержащей антиген, 2x1 облученных (2 Гр) сингенных клеток селезенки без эритроцитов и 15 "кондиционированной" полной среды в качестве источника ИЛ2.
Через 14-18 дней клоны с наиболее выраженным ростом ресги-мулировали в тех же лунках (с заменой 75$'среда) фидерными клет ками, антигеном и ИЛ2. Через 10-14 дней растущие клоны переноси ли в лунки 24-луночного планшета с одновременной стимуляцией (I ыл полной среды с ИЛ2, 1,5x10- клеток фидера, 10 мкг антигена на лунку), и затем повторяли циклы стимулирования с периодическим переносом клеток в новые лунки по мере роста клона кажды 10-16 дней.
Определение уровня антител к микобактериальным антигенам в сыворстке крови. Мышей разных линий иммунизировали в подуиечк. обеих задних лап соникатом H37Rv и на 14 день забирали кровь из ретроорбитального синуса. После отделения сыворотки в ней он ределялн содерх&ние антител к микобактериальным антигенам метод; иммушфєріекгного анализа (USA) ( Engvar В. , Perlrcan P. ,17
- II -
Статистическая обработка проводилась общепринятыми методами вариационной статистики (Плохинский Н.А., 1970), используя критерий Стыодента для оценки достоверности различий.
