Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу Орлова Марианна Олеговна

Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу
<
Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Орлова Марианна Олеговна. Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу : Дис. ... канд. биол. наук : 14.00.36 Москва, 2004 134 с. РГБ ОД, 61:04-3/1431

Введение к работе

Актуальность проблемы.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения заболевание туберкулезом остается существенной причиной смертности, и количество новых случаев заболевания насчитывает миллионы ежегодно. Росту числа случаев инфицирования Mycobacterium tuberculosis способствует появление новых лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий и распространение иммунодефицитных заболеваний (Leinhardt, 2001; WHO report 2002). При этом, хотя общая инфицированность достигает одной трети всего населения Земного шара, лишь у небольшой части развивается клинический туберкулез. Чувствительность к туберкулезной инфекции определяется многими факторами, в том числе и генетическими (Comstock, 1978; Stead efа/., 1990; McLeodefa/., 1995). Генетические и иммунологические механизмы, лежащие в основе резистентности и чувствительности организма-хозяина к туберкулезу, во много не ясны. Один из прямых путей к пониманию этих механизмов - это картирование и последующее клонирование генов, определяющих уровень чувствительности к инфекции. Второй путь - определение уровня экспрессии генов в клетках, органах и тканях у чувствительных и резистентных особей, а также оценка изменений в уровне экспрессии генов, вызванных самой инфекцией Изучение генетических закономерностей контроля инфекции непосредственно у человека очень осложняется гетерогенностью популяции и сильным воздействием факторов внешней среды. Поэтому широко используются модели на животных и клеточных культурах in vitro, позволяющие упростить систему и уменьшить влияние факторов окружающей среды и клеточного многообразия.

Использование инбредных линий мышей для обнаружения генов, участвующих в контроле чувствительности кмикобактериям, позволило картировать и клонировать ген Nramp 1, контролирующий экспериментальную BCG-инфекцию (Vidalefa/., 1995; Skameneefa/., 1998), а также картировать локусыввг-1 (Kramnikef а/., 2000) и локусы Tlr-1, 2, 3, 4 (Mitsos ef а/., 2000, 2003). В лаборатории иммуногенетики ЦНИИ туберкулеза РАМН была исследована чувствительность к летальной туберкулезной инфекции мышей более 30 линий и среди них была обнаружена сверхчувствительная к туберкулезу линия I/St (Nikonenko etal., 1985, 2000). На мышах линии I/St было лоиааане гцаплеиие скорости гибели и потери

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА I CReit»бург /У л ОЭ МО^аит 0(фО

веса у зараженных животных с локусами tbs1-D3Mit215, tbs2-D9Mit89 и D17Mit175, расположенными в 3, 9 и 17 хромосомах, соответственно (Lavebratt etal., 1999, Sanchez etal, 2003). До настоящего времени оставалось неизвестным, участвуют ли эти три локуса в контроле эффекторных функций макрофагов, во многом определяющих уровень резистентности и чувствительности к микобактериям (Оггпе ef а/., 1993, Kaufmann, 2000) и участвуют ли эти локусы в контроле клеточной инфильтрации легких при туберкулезной инфекции. Этот вопрос стал одним из основных в нашей работе.

Кроме того, применение технологии недавно созданных «больших» олигонуклеотидных микрочипов ДНК создает широкие возможности для исследования генно-экспрессионных профилей макрофагов, участвующих в локальном иммунном ответе на туберкулезную инфекцию (Ragno etal., 2001; Spira etal., 2003). Сравнительный анализ противоинфекционного иммунитета и генной экспрессии в популяции клеток-эффекторов у организмов с различной генетически-детерминированной чувствительностью к возбудителю заболевания формируют одно из перспективных направлений в инфекционной иммуногенетике. Принимая во внимание то, что макрофаги легких являются основными клетками, ответственными за непосредственное уничтожение и элиминацию туберкулезных бактерий из организма, представлялось особенно актуальным провести иммуногенетический анализ именно этих клеток.

Цель исследования.

Целью настоящего исследования стало изучение иммунного ответа и экспрессии генов в макрофагах легких мышей, различающихся по генетическим характеристикам, для установления связи между генотипом и фенотипическими проявлениями туберкулезной патологии.

Задачи исследования.

  1. Определить индивидуальные генотипы по микросателлитным маркерам 3, 9 и 17 хромосом у животных F2 (A/Sn х I/St) и после заражения сопоставить инфильтрацию легких Т-клетками CD4\ CD8*, макрофагами и нейтрофилами с присутствием конкретных генотипов во всех трех локусах.

  2. Определить антимикобактериальную активность легочных макрофагов, индивидуально выделенных от инфицированных животных F2 и провести корреляционный анализ с генотипами трех локусов.

  3. Оценить способность мышей F2 контролировать размножение микобактерии в органах в зависимости от генотипа.

  4. Сравнить пато морфологию легких при туберкулезной инфекции у мышей родительских линий I/St и A/Sn и их гибридов F2, несущих разное сочетание аллелей генов, влияющих на резистентность.

  5. Оценить межлинейные и постинфекционные различия по экспрессии генов в легочных макрофагах мышей линий I/St и A/Sn методом РНК-гибридизации на микрочипах ДНК.

Научная новизна.

Впервые была рассмотрена зависимость инфильтрации легких клетками различных типов от аллелей локусов 3, 9 и 17 хромосом. Установлено, что мощная инфильтрация полиморфоядерными лейкоцитами легких мышей зависит от сочетания рецессивного аллеля / в локусе tb$1 (D3Mit215) и доминантного аллеля / в локусе D17MH175, унаследованных от чувствительных мышей I/St.

Установлено, что антимикобактериальная активность макрофагов мышей F2 зависит от генотипа локуса tbsl; преимущество имеют животные F2 гетерозиготные по данному локусу.

Показано, что интегральная картина патологического процесса и размножение микобактерии в легких мышей F2 контролируется полигенно, но прямая связь с генотипами локусов tbsl, tbs2v\ D17Mit175 не прослеживается.

Впервые исследованы межлинейные различия и изменения генной экспрессии в легочных макрофагах чувствительной и резистентной линий мышей. Показано, что в макрофагах чувствительной линии I/St по сравнению с макрофагами мышей A/Sn достоверно сильнее экспрессируются 35 генов и слабее 18 генов (из 12000 исследованных). При инфицировании макрофагов in vitro межлинейные различия в генной экспрессии увеличиваются, но инфекция регулирует экспрессию генов слабее, чем собственно генотип хозяина.

Впервые продемонстрировано, что легочные макрофаги экспрессируют провоспалительный цитокин IL-11. При этом экспрессия гена IL-11 в 15 раз выше в макрофагах чувствительных мышей I/St. В сочетании с 3-кратной разницей по экспрессии гена IL-6 это может быть причиной неблагоприятного развития патологического процесса при инфекции.

Практическая значимость.

Полученные в работе данные позволили определить, какие именно-механизмы антимикобактериального ответа, зависят от генотипов ранее установленных локусов. Кроме того, анализ результатов генной экспрессии в легочных макрофагах позволил выявить новые, ранее не исследованные гены, влияющие на развитие туберкулезной патологии.

Изучение работы различных звеньев иммунитета при туберкулезной инфекции на экспериментальной модели позволяет выделить иммунологические реакции и контролирующие их гены, которые в совокупности определяют высокую индивидуальную чувствительность и неблагоприятное течение туберкулезной инфекции. Высокая гомология геномов мыши и человека позволяет рассчитывать, что наши исследования могут лечь в основу поиска генов, участвующих в контроле развития туберкулезного процесса у человека. В дальнейшем такие данные могут лечь в основу выявления групп высокого генетического риска заболевания туберкулезом.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Г" Российско-Германском Симпозиуме по туберкулезу (Санкт-Петербург, 2003), международной конференции Annual Meeting, of HHMU International Research Scholars, Таллинн, Эстония 2004.

Диссертация - была апробирована на совместном заседании лабораторно-экспериментального и иммунологического отделов ГУ Центральный НИИ туберкулеза РАМН 18 мая 2004 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (5 глав), материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (2 главы), заключения, выводов и библиографического указателя, включающего ссылки на 16 отечественных и 228 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 3 таблицами.

Лабораторные животные. Исследования выполнены на мышах инбредных-линий 1/StSnEgYCit (I/St) и A/JSnYCit (A/Sn), поддерживаемых в питомнике ЦНИИТ

РАМН путем инбридинга по общепринятым правилам (Бландова и др. 1983). Гибриды F2(A/Sn х I/St) получены в этом же питомнике. Всего в работе было использовано 350 мышей. В экспериментах с мышами F2 использовались животные обоего пола, весом 21 - 25 г., в возрасте 2-4 месяцев. Для экспериментов по оценке генной экспрессии в легочных макрофагах мышей линий A/Sn и I/St использовали самок в возрасте 2-6 месяцев.

Микобактерии. В работе использовали вирулентный штамм М. tuberculosis H37Rv, полученный из института Пастера (Paris). Наработанную культуру аликвотировали и хранили при -80С до использования. Перед заражением суспензию трижды отмывали центрифугированием (ЭОООд 15 мин, 4С) и ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе.

Высеваемость микобактерии из органов зараженных животных. Органы инфицированных животных гомогенизировали в стерильном физиологическом растворе, делали серию 10-и кратных разведений каждой суспензии и наносили на пластиковые чашки Петри с агаром Дюбо по 100 мкл суспензии каждого разведения. Чашки инкубировали при 37С 18 дней, подсчитывали колонии и пересчитывали количество микобактерии на орган.

Гистологическая оценка патологии легких у мышей F?, Легкие, полученные от инфицированных М.tuberculosis H37Rv мышей, фиксировали 1% раствором ПАФ на фосфатном буфере. Полученные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты были сфотографированы на цифровой фотоаппарат Coolpix 990 (Nikon, Japan) и затем обработаны с помощью программного обеспечения для анализа изображений LabWorks4.0 (UVP Ltd., UK).

Получение легочных макрофагов. Суспензию интерстициальных легочных клеток получали по методу (Holt et а!., 1985) в нашей модификации (Lyadova et al., 1998) перевариванием легкого в RPM11640, содержащей HEPES, FCS, коллагеназу, ДНК-азу и антибиотики. Клетки инкубировали на пластиковых чашках и освобождали от неприлипших клеток. Прикрепившиеся макрофаги переводили из монослоя в суспензию, инкубируя в растворе Версена.

Проточная цитофлуорометрия. 500 тыс. клеток на пробу осаждали и обрабатывали aHTH-CD16/CD32 антителами для предотвращения неспецифического связывания. Через 5 минут в суспензии добавляли моноклональные антитела, меченые флуоресцентной меткой (из расчета 1 мкг/106 .клеток) и инкубировали клетки 30 минут при 4С. Были использованы двойные окраски моноклональными

антителами Pharmingen и Caltag, меченные FITC и РЕ Анализ клеток проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur, BD, USA Анализировали не менее 10" клеток каждого образца, данные обрабатывали с помощью программы CellQuest Pro, 40 2 (BD, USA)

Взаимодействие макрофагов с микобактериями проводили в плоскодонных 96-луночных культуральных планшетах в СО г-инкубаторе в среде без антибиотиков Легочные макрофаги (60*103 клеток/100 мкл/лунку) инкубировали в планшете 60 мин, после чего к сформированным монослоям макрофагов добавляли суспензию М tuberculosis H37Rv (Pasteur) Оценка антимикобактериальной активности макрофагов производится по избирательному включению микобактериями [3Н]-урацила (Majorovetal, 2003)

Для анализа экспрессии генов взаимодействие макрофагов с микобактериями проводили в культуральных чашках Петри или 6-луночных плейтах в СО г-инкубаторе в среде RPMI-1640 содержащей 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамином 2%FCS без антибиотиков Суспензию легочных макрофагов переносили в чашку (по 8 5x106 клеток/Ю мл) или в лунку плейта (по 1 5x106 клеток/3 мл) и инкубировали 60 мин, после чего к сформированным монослоям макрофагов добавляли суспензию М tuberculosis H37Rv в соотношении 5 1 В качестве контроля использовались инкубированные, но не зараженные макрофаги Зараженные и контрольные макрофаги культивировали 24 часа до экстракции РНК

Для выделения тотальной РНК из макрофагов и фибробластов легкого использовали набор RNeasy MimKit (QIAGEN, Germany), следуя методике производителя Полученные пробы РНК хранили при -80С

Анализ генной экспрессии макрофагов с использованием микрочипов ДНК Affymetnx. Были использованы микрочипы ДНК Genechip U74Av2 для мышиного генома (Affymetnx Santa Clara. USA, Fodor ef a/, 1991, Lockhart et al, 1996) В Геномном Центре г Монреаль, Канада, были проведены гибридизация проб РНК, полученных из зараженных и контрольных макрофагов самок линий I/St и A/Sn Флуоресценция связавшейся РНК рассчитывалась при помощи Gene Chip

i\Co\ji, cinciiTrio ГЇОЛу"і6ппоіА Даппоїл wdij" ПрСБбДсп С Пимищоїи ItpOlfJdMMbl fVflCfuArfdy

Suite 5 0 (Affymetnx)

Анализ ОТ-ПЦР. Для подтверждения данных, полученных при анализе РНК гибридизацией проб на микрочипах ДНК были использованы методы ПЦР с использованием обратной транскрипции (ОТ) Для получения комплементарных ДНК

использовали Superscript II RNase H* Reverse Transcriptase (Invitrogen, Canada) no методике производителя. Полученную кДНК использовали для дальнейшего ПЦР-анализа. Анализ экспрессии генов 1L-6, IL-11, ММР8, ММР9, ММР10, TIMP-1 проводили параллельно с конститутативно экспрессирующимся геном GAPDH в качестве контроля. Продукты ПЦР анализировали, используя электрофорез в 1,5% агарозном геле. Результаты анализировали либо с помощью системы UVP Biolmaging System (Ultraviolet Products Ltd., United Kingdom), либо с применением программного обеспечения Rotor-Gene 3000, Corbett Research, Australia.

Генотипирование мышей F? с помощью ПЦР. Геномную ДНК мышей F2 выделяли с использованием Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA), следуя методике производителя. Аллельные варианты микросателлитных последовательностей D3MH215, D9MH89 и D17Mit175, расположенных соответственно на 3, 9 и 17 хромосомах определялись методом ПЦР. Полученные ПЦР-продукты анализировали в 8% ПААГ (22,3:1).

Статистическая обработка экспериментальных данных. Данные по генной экспрессии были обработаны с помощью программы SAM (Significance Analysis of Microarrays, Tusher ef a/, 2000). Для оценки статистической значимости различий средних величин применяли непарный критерий Стьюдента (t-тест), критерий Манн-Уитни (U-тест) и Крускаль-Уоллис тест. Полученные данные обсчитывали с помощью программы (nStat(USA). Статистически достоверными считали различия с р<0,05.

Похожие диссертации на Полигенный контроль иммунологических реакций, определяющих чувствительность мышей к туберкулезу