Сравнительная характеристика иммунологических параметров мышей инбредных линий с генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу и их сверхрезистентных гибридов Радаева Татьяна Вячеславовна

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Радаева Татьяна Вячеславовна. Сравнительная характеристика иммунологических параметров мышей инбредных линий с генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу и их сверхрезистентных гибридов : диссертация ... кандидата медицинских наук : 14.00.36 / Радаева Татьяна Вячеславовна; [Место защиты: Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН"].- Москва, 2002.- 103 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность проблемы. Многочисленные исследования последних лет ясно показали, что контроль восприимчивости к туберкулезной инфекции и ее течение в организме-хозяине - полигенно контролируемые признаки. Влияние конкретных генов, их аллелей и взаимодействие между ними реализуется через экспрессию определенных фенотипов. При микобактериальной инфекции физиологически значимы фенотипические характеристики Т-лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов как основных эффекторов антимикобактериальной защиты (Orme I.M.et al., 1992, 1993; Kaufmann S.H.E., 2001).

В настоящее время уже картированы гены главного комплекса гистосовместимости и гены первой хромосомы Nramp и sst-1 (Kramnik I. et al., 2000), участвующие в определении уровня чувствительности к туберкулезу у мышей. Гомолог гена Nramp мыши, ген NRAMP 1, найден во второй хромосоме человека и его роль в контроле туберкулеза интенсивно изучается (Skamene Е., Schurr Е., Gros Ph., 1998; Liu J. et al., 1995; Bellamy R.J. and Hill A.V.S., 1998; Bellamy R.J. et al.,1998). Недавно появились данные о роли локусов ТИ, Tlr2, ТІгЗ, расположенных, соответственно, в 1, 3 и 7 хромосомах мыши (Mitsos L.M., et al. 2000) в контроле резистентности к туберкулезу, вызванного вирулентным штаммом М. tuberculosis -H37Rv.

В лаборатории иммуногенетики ЦНИИ Туберкулеза РАМН была исследована чувствительность к летальной туберкулезной инфекции мышей более 30 линий. Среди них были обнаружены сверхчувствительная к туберкулезу линия I/St, чувствительная линия C57BI/6 и ряд резистентных линий - A/Sn, СВА, AKR (Nikonenko В. V. et al. 1985; 2000). Недавно на мышах линии I/St было показано сцепление скорости гибели и потери веса у зараженных животных с локусами tbs-1 и tbs-2, расположенными в 3 и 9 хромосомах, соответственно (Lavebratt С, et al. 1999; Sanchez F.O. et al., 2002). Есть основания полагать, что именно эти локусы являются одними из наиболее мощных генетических факторов, определяющими течение туберкулезной инфекции в нашей модели (Nikonenko В. V. et al., 2000).

Вместе с тем, большой интерес вызывает изучение наследования чувствительности к туберкулезу и проявления фенотипических различий (разнообразные параметры противотуберкулезной резистентности и антимикобактериального иммунитета) в сочетании линий инбредных мышей I/St и

C57B1/6. Обе эти линии чувствительны к туберкулезу, при этом, гибриды F1 между ними оказались гораздо резистентнее не только обоих родителей, но и других исследованных мышей. Мы полагаем, что это - проявление комплементации между независимыми генетическими локусами, контролирующими течение туберкулезного процесса. Подобные межгенные взаимодействия принципиально важны для эффективного контроля инфекции, однако пока они остаются совершенно неизученными.

Для выявления дефектов в системе противотуберкулезной защиты у родительских линий и анализа межгенной комплементации у гибридов F1 на иммунологическом уровне было решено исследовать основные параметры Т-клеточного и макрофагального ответа на микобактерии у мышей чувствительных родительских линий I/St и C57BI/6, а также их резистентных гибридов F1.

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось выявление дефектов в системе иммунологических механизмов антимикобактериальной резистентности у мышей с генетически детерминированными различиями по чувствительности к туберкулезу и анализ компенсации этих дефектов за счет генетической комплементации.

Задачи исследования.

Определить характер генетического расщепления и количество основных генов, участвующих в контроле туберкулеза в выбранной модели.
Определить динамику нарастания и степень кахексии у мышей линий I/St, С57В1/6 и гибридов (l/StxC57BI/6)F1 после инфицирования.
Сравнить мышей чувствительных родительских линий и их резистентных гибридов по способности контролировать размножение микобактерии в органах.
Сравнить особенности патоморфологических изменений в легких у изучаемых мышей.
Оценить функциональную активность Т-лимфоцитов мышей чувствительных родительских линий и резистентных гибридов F1 по антиген-специфической пролиферации, продукции ИФН^у, ИЛ-10, ИЛ-5, ФНО-а и экспрессии поверхностных маркеров активации.
Оценить антимикобактериальную активность макрофагов легких родительских линий I/St, C57BL/6 и гибридов F1 по интенсивности образования активных форм азота, ограничению роста микобактерии в культуре и цитопатическому действию микобактерии на сами макрофаги.

Научная новизна.

Впервые изучена динамика развития кахексии у чувствительных и резистентных животных, инфицированных М.tuberculosis H37Rv. Показано, что чувствительные к туберкулезу мыши теряют 20% веса в течение 15-25 дней после заражения, тогда как резистентные животные начинают терять вес не ранее, чем через 2 месяца после заражения. Вместе с тем, несмотря на разную динамику развития кахексии, ее абсолютный уровень к моменту гибели одинаков у чувствительных мышей I/St и C57BL/6 и резистентных гибридов F1.
У мышей инбредной линии Вб показано наличие ранее неизвестного локуса, контролирующего течение туберкулезного процесса. Этот локус не сцеплен с локусами, определяющими чувствительность к туберкулезу у мышей I/St.
Впервые показано, что тяжесть патоморфологических изменений в легких после заражения туберкулезом может не зависеть от бактериальной нагрузки, а определяться генетически детерминированной реактивностью организма.
Установлено, что Т-лимфоциты лимфоузлов мышей I/St характеризуются сниженной продукцией цитокинов 1 типа, особенно ИФН-у, что может объяснять низкий уровень противотуберкулезной резистентности у этих мышей.
На данной генетической модели впервые удалось показать, что макрофаги резистентных (F1) и чувствительных (I/St) мышей при низком соотношении микобактерия : макрофаг могут обладать одинаковой антимикобактериальной активностью, но отличаться по устойчивости к цитопатическому действию микобактерий.

Практическая значимость. Данные о генетически детерминированных различиях в реактивности к микобактериям у мышей чувствительных и резистентных к инфекции и сегрегационный анализ в новом сочетании инбредных линий мышей показали наличие ранее неизвестного(ых) гена(ов), контролирующего(их) резистентность к туберкулезу. Поскольку генетический контроль чувствительности и резистентности к микобактериям осуществляется у человека и мыши гомологичными генами (Liu J. et al., 1995), наши исследования могут служить основой для поиска новых генов, участвующих в контроле туберкулеза у человека. Сходство между мышью и человеком на уровне генетического контроля чувствительности и резистентности к туберкулезу позволяет думать и о сходстве механизмов противотуберкулезной защиты. Исследования работы различных звеньев иммунитета при туберкулезной инфекции на экспериментальной модели позволяют

выделить те иммунологические реакции, которые определяют высокую индивидуальную чувствительность к туберкулезной инфекции, что потенциально важно для установления групп высокого риска заболеваемости туберкулезом, а также для контроля за лечением и вакцинацией.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на 5^ой Международной иммунологической школе им. Джона Хамфри (Пущино, 2000), научно-практической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы туберкулеза и других гранулематозных заболеваний" (Москва, 2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (9 глав), материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (2 главы), заключения, выводов и библиографического указателя, включающего ссылки на 17 отечественных и 144 иностранных работы. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками и 6 таблицами.

Лабораторные животные. Исследования выполнены на мышах инбредных линий І/StSnEgYCit (I/St) и C57BL/6YCit (В6), поддерживаемых в питомнике ЦНИИТ РАМН путем инбридинга по общепринятым правилам (Бландова и др. 1983). Гибриды (l/StxC57BL/6)F1, (l/StxC57BL/6)F2 и потомки возвратного скрещивания [C57BL/6x(l/StxC57BL/6)]BC1 получены в этом же питомнике. Всего в работе было использовано 650 мышей. В экспериментах использовались мыши обоего пола, весом 21-24 грамма, в возрасте 2-4 месяцев.

Микобактерии. В работе использовали вирулентный штамм М. tuberculosis H37Rv (Pasteur), полученный из института Пастера (Paris). Наработанную культуру аликвотируют. Аликвоты хранят при -80 С до использования. Перед заражением суспензию трижды отмывают центрифугированием (ЗОООд, 15 мин, 4С) и ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе.

Экспериментальная туберкулезная инфекция. Для индукции летальной туберкулезной инфекции мышам в латеральную хвостовую вену вводят 5x10^е КОЕ H37Rv в 0,5 мл физиологического раствора (Apt A. S. et а!., 1993). Выживаемость

мышей контролируют ежедневно, начиная с 15 дня после заражения. Данные приведены в виде среднего времени выживания (СВЕЗ).

Высеваемость микобактерий из органов зараженных животных. Органы инфицированных животных гомогенизируют в стерильном физиологическом растворе и делают серию 10-и кратных разведений каждой суспензии. На пластиковые чашки Петри с агаром Дюбо наносят по 100 мкл суспензии каждого разведения. Чашки гермитично закрывают и инкубируют при 37С 18 дней. Затем производят подсчет колоний и пересчитывают количество микобактерий на целый орган.

Получение суспензии клеток лимфоузлов. Суспензии клеток готовят в стерильных условиях на льду. Подмышечные лимфоузлы от инфицированных мышей гомогенизируют в среде 199 с 2% сыворотки крупного рогатого скота, осаждают клетки центрифугированием при 200 g в течение 10 минут. Клетки трижды отмывают центрифугированием и определяют число жизнеспособных клеток по окраске трипановым синим. Затем клетки переводят в среду для культивирования.

Антигенспецифический пропиферативный ответ Т-лимфоцитов. Суспензию, содержащую 3x10⁵ клеток в 200 мл среды для культивирования, вносят в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. В экспериментальные лунки добавляют микобактериальные антигены в виде ультразвукового дезинтеграта М.tuberculosis (сониката). Планшет с клетками инкубируют при 37С, 5% С0₂ в течение 72 часов. На последние 12 часов вносят Н³- тимидин (0,5 мкСі), об уровне пролиферации лимфоцитов судят по включению метки. Подсчет активности проводят на (3- счетчике "Wallac 1409".

Определение продукция цитокинов Т-кпетками. Суспензию клеток лимфоузла (по 3x10⁶ клеток на лунку) культивируют in vitro в лунках 24-луночных плейтов в присутствии антигена (соникат H37Rv в дозе 10 мг/мл) и без него. Супернатанты культур собирают через 48-72 часа после начала культивирования. Содержание в них цитокинов определяют методом ELISA с использованием моноклональных антител фирм PharMingen, Sigma и Genzyme.

Проточная цитофлуорометрия. От 200 тыс. до 500 тыс. клеток осаждают и обрабатывают aHTH-CD16/CD32 антителами для предотвращения неспецифического связывания. Через 5 минут в суспензии добавляют моноклональные антитела, меченые флуоресцентной меткой (из расчета 1 мкг/10⁶ клеток) и инкубируют клетки 30 минут при 4С. Были использованы одинарные, двойные и тройные окраски

моноклональными антитепами (все - Pharmingen), меченные FITC, РЕ и CyChrome.
Окрашенные клетки отмывают и фиксируют в 1% параформальдегиде. Анализ
окрашенных клеток проводили в лаборатории иммунохимии Института
биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова на проточном
цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США). Полученные данные обрабатывали с
помощью программы MultiGraph (Coulter). В каждой пробе анализировали не менее
10 тыс. клеток. ...

Получение легочных макрофагов. Суспензию интерстициальных легочных клеток получали по методу (Holt et al., 1985) в нашей модификации (Lyadova et al., 1998), перевариванием легкого в RPMI 1640, содержащей HEPES, FCS, коллагеназу, ДНК-азу и антибиотики. Дальнейшую отмывку от неприлипших клеток осуществляют адгезией макрофагов к пластику. Прикрепившиеся макрофаги, переводят из монослоя в суспензию раствором Версена.

Взаимодействие макрофагов с микобактериями осуществляют в плоскодонных 96-луночных культуральных планшетах в СОг-инкубаторе в среде без антибиотиков. Суспензию легочных макрофагов переносят в лунки планшета (по 60x10³ клеток/100 мкл/лунку) и инкубируют 60 мин, после чего к сформированным монослоям макрофагов добавляют суспензию М. tuberculosis H37Rv (Pasteur).

Оценка антимикобактериальной активности макрофагов производится по избирательному включению микобактериями [³Н]-урацила.

Секрецию (NQ2>~ макрофагами оценивают по концентрации нитрит-аниона в супернатантах макрофагальных культур, измеренной с помощью колориметрической реакции с реактивом Грисса (Migliorini P. et al,. 1991).

Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) проводят с использованием CytoTox 96 kit (Promega, Madison, Wl). В основе работы этого набора лежит двухступенчатая реакция, приводящая к образованию окрашенного продукта. Интенсивность окраски определяют колориметрически на автоматическом ридере EIA (Sigma) при Л=490нм.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Для оценки статистической значимости различий средних величин применяют критерий Стьюдента. Полученные данные обсчитывают с помощью программы БИОСТАТ (Практика, Россия).