Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
Часть 1. Полиморфизм генов: понятие, виды, роль в развитии септических состояний 11
1.1.1. Полиморфизм генов рецепторов врожденного иммунитета TLR 11
1.1.1.1. Особенности полиморфизма гена TLR2, роль в развитии сепсиса ...14
1.1.1.2. Полиморфизм гена TLR4, роль в развитии сепсиса 16
1.1.2.Полиморфизм генов цитокинов: особенности, роль в развитии сепсиса 18
1.1.2.1. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей a (TNFa) и сепсис... 19
1.1.2.2. Полиморфизм генов семейства IL-1. Роль полиморфизмов генов IL-ip и IL-IRa в развитии сепсиса 22
1.1.2.3. Полиморфизм гена интерлейкина-10 (IL-10) 27
Часть 2. Особенности экспрессии генов при септических состояниях... 29
1.2.1. Эволюция взглядов на иммунопатогенез сепсиса 29
1.2.2. Концепция "геномного шторма" 31
Глава II. Материалы и методы
2.1. Обследуемые лица 35
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение полиморфизмов 38
2.2.2. Оценка экспрессии генов 42
2.2.3. Статистическая обработка результатов 45
Глава III. Собственные исследования
3.1. Оценка полиморфизма генов цитокинов и рецепторов иммунного ответа 50
3.1.1. Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов IL-lRa, IL-ip, IL-10, TNFa, TLR2 и TLR4 у ожоговых больных по сравнению с выборкой практически здоровых доноров 51
3.1.2. Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов в группах ожоговых больных с различным клиническим течением и исходом 55
3.2. Оценка экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, IL-lp, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 59
3.2.1. Оценка количества мРНК исследуемых генов в группе здоровых доноров и выборке ожоговых больных 59
3.2.2. Оценка экспрессии исследуемых генов в зависимости от клинического течения и исхода ожоговых больных 62
3.2.3. Связь полиморфизма с экспрессией исследуемых генов 65
Заключение 66
Выводы 86
Список используемых сокращений 88
Список литературы
- Особенности полиморфизма гена TLR2, роль в развитии сепсиса
- Полиморфизм генов семейства IL-1. Роль полиморфизмов генов IL-ip и IL-IRa в развитии сепсиса
- Определение полиморфизмов
- Оценка экспрессии исследуемых генов в зависимости от клинического течения и исхода ожоговых больных
Введение к работе
Актуальность проблемы
По данным ВОЗ, ожоги занимают третье, а в некоторых странах (Япония) - второе место по частоте возникновения среди прочих травм, уступая лишь транспортной травме. В последние годы распространенность ожогов в России стала нарастать и составила 294,2 случая на 10 тысяч населения [Афоничев К.А., 2010]. Высокий процент летальности при обширных термических поражениях является одной из главных проблем ожоговых реанимаций.
Считается, что наиболее частой причиной смерти обожженных являются септические осложнения ожоговой болезни, способные развиться в течение нескольких недель после травмы [Алексеев А.А., 2001; Козлов В.К., 2007; Абелевич А.И., 2011; Sheridan R.L., 2005; Barber R.C., 2007].
Важность проблемы сепсиса подчеркивает возникшее в 2002 году международное движение специалистов "Переживем сепсис", поставившее перед собой задачу снижения летальности на 25% в течение ближайших пяти лет [Савельев В.С., 2006]. Несмотря на всю серьезность этой проблемы [Руднов В.А., 2002; Руднов В.А., 2003], до сих пор не существует общепринятой классификации и четкого определения такого понятия как ожоговый сепсис. Данное положение вещей значительно усложняет диагностику и прогноз, а также подходы к профилактике и лечению септических состояний у ожоговых больных [Гординская Н.А., 2008]. Более того, до сих пор не достаточно ясна картина иммунологических особенностей сепсиса, возникающего на фоне ожогов.
В 2001 году группой авторов Levy M.M., Fink M.P., Marshall J.C. и др. была предложена классификационная схема развития сепсиса PIRO (Predisposing factors, Infection, Response, Organ disfunction): синдром системного воспалительного ответа (ССВО), сепсис, тяжелый сепсис, септический шок. В ее основе заложена характеристика определенных персональных свойств больного, а именно: конституционные особенности больного, особенности и локализация повреждающего фактора, системная реакция организма хозяина, выраженность сопутствующей органной дисфункции [Levy M.M., 2001; Levy M.M., 2004]. Экспертиза схемы PIRO позволяет заключить, что различные генетические составляющие индивидуума являются детерминирующими признаками риска развития осложнений и преждевременной смерти, связанной с сепсисом.
И действительно, современная концепция патогенеза инфекционных заболеваний основана на изучении генетических ассоциаций специфических кандидатных генов, вовлеченных в регуляцию иммунного ответа. Согласно этой концепции, генетические факторы человека играют главную роль в исходе инфекционных заболеваний [Holmes C.L., 2003; Цыган В.Н., 2010].
Таким образом, на сегодняшний день одной из задач исследований, при рассмотрении проблемы сепсиса, является поиск генов-кандидатов, определяющих генетическую предрасположенность/устойчивость к развитию сепсиса/осложненного сепсиса лиц с тяжелыми термическими травмами [Stuber F., 2005; Sutherland A.M., 2005; Sipahi T., 2006]. Еще одним приоритетным направлением является индикация специфических маркеров, чётко отражающих степень тяжести заболевания и результативность лечения и позволяющих вовремя диагностировать и прогнозировать развитие ожогового сепсиса. Одним из достоверных показателей происходящих в организме изменений является экспрессия иммунокомпетентных генов. Регистрация изменений в экспрессии генов, продукты которых участвуют в иммунопатогенезе сепсиса, позволяет, в той или иной мере, своевременно оценить состояние больного и спрогнозировать дальнейшее развитие и исход заболевания [Tang B.M.P., 2009]
Все вышесказанное определило направление исследований - анализ распределения полиморфных вариантов генов цитокинов и рецепторов врожденного иммунитета и оценка уровня их экспрессии у больных с ожоговым сепсисом. Цель исследования
Провести сравнительный анализ особенностей распределения аллелей/генотипов иммунокомпетентных генов и уровней их экспрессии у лиц, проживающих в Челябинской области: здоровых и пациентов с тяжелой термической травмой, для выделения генетических маркеров предрасположенности/устойчивости развития сепсиса, прогноза его течения и исхода, которые могут использоваться при дополнительном мониторировании течения ожоговой болезни. Задачи исследования
-
Выявить общие закономерности в распределении аллельных вариантов генов IL-10, TLR2 и TLR4 среди европеоидов Челябинской области и оценить уровни экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, CIITA, цитокинов IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у здоровых лиц различных популяционных групп, проживающих в Челябинской области, для создания групп контроля.
-
Определить особенности распределения генотипов и аллелей генов цитокинов IL-1Ra, IL-ip, TNFa, IL-10 и рецепторов врожденного иммунного ответа TLR2, TLR4 у лиц русской популяции, проживающих в Челябинской области: здоровых и больных с тяжелыми ожогами.
-
Изучить частоты встречаемости аллелей и генотипов генов IL-1Ra, IL- ip, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4 при различных клинических вариантах и исходах септического процесса у ожоговых больных.
-
Определить особенности экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, CIITA, цитокинов IL- 1р, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у ожоговых больных по сравнению со здоровыми лицами.
-
Изучить различия в экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, CIITA, цитокинов IL-1p, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 на различных клинических стадиях септического процесса с учетом исхода у ожоговых больных.
-
Оценить возможную связь особенностей экспрессии генов HLA-DRA, - DMA, CIITA, цитокинов IL-1p, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 с наличием полиморфизмов генов IL-IRa, IL- 1р, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4.
Научная новизна
Впервые установлены распределения частот аллельных вариантов и генотипов генов TLR2, TLR4, IL-10 у европеоидов Челябинской области.
Впервые получены данные об уровнях экспрессии генов HLA-DRA, - DMA, CIITA, IL-1р, TNFa, IFy, IL-6, IL-10, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 среди здоровых индивидов Челябинской области.
Определены полиморфные варианты генов цитокинов и TLR, отвечающих за предрасположенность/устойчивость пациентов с ожоговой травмой к развитию сепсиса и его осложнений.
Показаны особенности экспрессии генов основных цитокинов, рецепторов врожденного иммунитета и генов адаптивного иммунного ответа, отвечающих за презентацию антигена у пострадавших на различных стадиях ожоговой болезни, и представлены предиктовые иммуногенетические маркеры развития сепсиса с синдромом полиорганной недостаточности (ПОН) и его неблагоприятного исхода.
Впервые проведен поиск связи между особенностями экспрессии генов и их полиморфизмом у лиц, проживающих в Челябинской области. Теоретическая и практическая значимость
Данная работа носит фундаментальный характер. Нами установлены общие закономерности распределения частот полиморфных вариантов генов IL-10, TLR2, TLR4 у здоровых представителей русской популяции Челябинской области. Установлены общие закономерности экспрессии генов основных цитокинов IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета HLA-DRA, -DMA, CIITA, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у здоровых представителей населения Челябинской области. Полученные данные могут быть использованы в качестве контроля при решении ряда задач по направлению «иммуногенетика» и «HLA и болезни», а именно: при изучении ассоциации иммуногенетического статуса с предрасположенностью/устойчивостью индивидов к различным заболеваниям, оценки прогноза тяжести течения и их исхода, выбора адекватных методов медикаментозной терапии, мониторинга и разработки современных биотехнологических процессов, в плане создания препаратов группы предиктовой медицины и персонифицированной терапии.
Полученные результаты позволили установить у ожоговых больных наличие генов предрасположенности/устойчивости, определяющих течение ожоговой болезни - развитие сепсиса, осложненного сепсиса и его исход. Следовательно, изучение иммуногенетического статуса индивидов дает возможность своевременно определить риск развития осложнений и индивидуальную тактику лечения при возникновении критических состояний, вот числе таких, как тяжелая ожоговая травма. Положения, выносимые на защиту
1. Предрасположенность и устойчивость к развитию сепсиса у больных с тяжелой термической травмой может определяться особенностями иммуногенетического статуса пострадавших: повышенная частота встречаемости генотипов 2г/2г и 4г/5г гена IL-IRa, аллеля 753*А и генотипа G/A гена TLR2 у ожоговых больных по сравнению с донорами может свидетельствовать о предрасположенности лиц с наличием данных генотипов к развитию сепсиса при ожоговой болезни, а наличие генотипа 2г/4г гена IL-IRa, аллеля 753*G и генотипа G/G гена TLR2 может обеспечить протекторный эффект. Более того, развитие сепсиса с синдромом полиорганной недостаточности четко ассоциировано с гетерозиготностью гена IL-10 в точке - 819 и наличием гаплотипа GTA гена IL-10 -1082/-819/-592.
2. У пациентов с тяжелой термической травмой по сравнению со здоровыми индивидами наблюдаются одновременные изменения в экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов: снижение уровней экспрессии IL-6, IFy, повышение экспрессии IL-1P, TNFa, IL-10, и повышение экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2, TLR4 на фоне снижения экспрессии генов адаптивного иммунитета HLA-DRA, - DMA, CIITA и TREM- 1. Установленные закономерности позволяют прогнозировать развитие сепсиса, сепсиса с синдромом полиорганной недостаточности и его исход на ранних сроках течения ожоговой болезни. Внедрение результатов исследования
Результаты исследовательской работы внедрены в учебный процесс: включены в список обязательной литературы для студентов и в лекционный курс дисциплины "Иммунный гомеостаз в норме и патологии" магистерской программы "Медико-биологические науки" на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет».
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждались в виде научных докладов на конференциях: конференция зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008), XIII Всероссийский форум с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2009), «VIII конференция Иммунологов Урала» (г. Сыктывкар, 2010), научно-практическая конференция «Инфекции кровяного русла» (г. Челябинск, 2011), «IX конференция Иммунологов Урала» (г. Челябинск, 2011), VI международная западно-восточная конференция по иммуногенетике EWIC (Чехия, 2012). Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 19 рисунками. Список литературы содержит 153 источника, в том числе 38 работ отечественных и 115 зарубежных авторов. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Особенности полиморфизма гена TLR2, роль в развитии сепсиса
При возникновении септических состояний первым основным задействованным звеном иммунной системы является врожденный иммунитет, представленный нейтрофилами, моноцитами/макрофагами и дендритными клетками (ДК), распознающими патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (ПАМП) благодаря специализированным рецепторам [83].
Особое место среди патоген-распознающих рецепторов занимают рецепторы, обеспечивающие проведение внутриклеточного активационного сигнала, к которым относятся Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR)[122, 143, 151].
Общим свойством всех TLR является взаимодействие с PAMPs и проведение активационного сигнала, указывающего на присутствие патогена и ведущего к активации защитных реакций.
Показано так же, что ряд TLR могут распознавать и эндогенные лиганды, появляющиеся в результате развития воспаления и повреждения тканей (домен А белка внеклеточного матрикса фибронектина, фибриноген, олигосахариды гиалуроновой кислоты, белок А сурфактанта эпителия легких и белки теплового шока) [54]. То есть при ожоговой травме TLR по идее уже способны генерировать развитие воспаления за счет наличия массивного повреждения тканей, не смотря на наличие или отсутствие инфекционного агента.
Активация клеток после взаимодействия РАМР с TLR приводит к последовательным этапам развития воспалительной реакции, являющейся основным механизмом реализации врожденного иммунитета.
Эффекты TLR опосредуются сетью молекул внутриклеточного сигналинга, которые передают с клеточной поверхности в ядро сигнал, активирующий гены иммунного ответа [36]. Одним из ключевых по значимости событий является синтез комплекса провоспалительных циокинов, стимулирующих большинство дальнейших событий в развитии воспалительной реакции и обеспечивающих веерное расширение активации различных типов клеток, участвующих в поддержании и регуляции воспаления, включая все типы лейкоцитов, ДК, Т- и В-лимфоциты, ЕК-клетки (естественные киллеры), эндотелиальные и эпителиальные клетки, фибробласты и другие.
Нарушение механизмов регуляции врожденного иммунитета часто играет решающую роль в развитии ряда заболеваний, главным образом, таких, где воспаление является ключевым фактором патогенеза. В частности, нарушения активации клеток с участием TLR имеют значение при инфекциях и сепсисе. Одной из основных причин, влияющих на какие-либо изменения в иммунном ответе TLR при сепсисе, считается генетический полиморфизм генов данных рецепторов.
На сегодняшний день существует немалое количество данных о выявлении функционального полиморфизма генов TLR, связанного с заменами единичных нуклеотидов (SNP), вызывающих количественные изменения функционирования соответствующих генов. Общей чертой функционального полиморфизма генов TLR является снижение способности к распознаванию соответствующих лигандов, либо к проведению внутриклеточных сигналов, что приводит к менее выраженной активации клеток после встречи с патогенами [30, 104].
Исходя из выше сказанного в данной работе проводилась оценка полиморфизмов генов TLR2 и TLR4, как основных патоген-распознающих рецепторов, задействованных в распознавании Грам+ и Грам-микроорганизмов при септических состояниях. Поскольку одним из основных результатов активации Toll-like рецепторов является усиление экспрессии и высвобождения многочисленных эффекторных молекул, таких как цитокины, также рассматривались полиморфные участки генов цитокинов, включенных в данное исследование, а так же результаты работ, посвященных поиску ассоциации этих генов с предрасположенностью и с вариабельностью течения ожогового сепсиса. 1.1.1.1. Особенности полиморфизма гена TLR2, роль в развитии сепсиса
Особое место среди всего семейства человеческих TLR занимают TLR2. Общепризнанным является факт, что TLR2 играет ключевую роль в узнававнии Грам+ микроорганизмов и микобактерий. На сегодняшний день считается, что именно Грам+ микроорганизмы являются наиболее частой причиной развития тяжелых инфекций, ассоциированных с органной дисфункцией или септическим шоком в отделениях интенсивной терапии [68].
Экспрессия TLR2 на клетках разных тканей в организме зависит от роли данных клеток в защитных функциях организма [81].
TLR2 кодируется последовательностью ДНК состоящей из 2352 пар азотистых оснований, которые определяют 784 аминокислоты. Хотя информации о биологических эффектах аллельных вариантов гена TLR2 до сих пор очень мало, тем не менее, для этого гена было описано 89 SNP. Из них 26 затрагивают 5 - нетранслируемую область, 17 находятся в 3 -нетранслируемой области, 29 SNP расположены в интронах гена и 17 SNP приводят к замене оснований в третьем экзоне TLR2.
Ген TLR2 человека расположен на хромосоме 4q32 и состоит из трех экзонов. Как известно структура TLR2 представлена внеклеточным (аминокислоты 1-588), трансмембранным (аминокислоты 589-609) и цитоплазматическим (аминокислоты 610-784) доменами. Наибольший практический интерес представляют смысловые замены в участках, кодирующих цитоплазматический домен рецептора. Смысловые замены в цитоплазматическом доменеТЬШ. Шесть смысловых SNP в гене TLR2 приводящих к замене аминокислот в цитоплазматической части рецептора, включают 5 SNP внутри TIR домена (АК 643-784), которые критичны и важны для проведения сигнала и димеризации. Только 2 из них связаны со снижением активации NF-kB и повышают риск развития инфекций.
Первый смысловой SNP представляет собой замену С на Т в нуклеотиде 2029 от стартового кодона TLR2, приводит к замене аргинина на триптофан в позиции 677 рецептора (TLR2 С677Т). Эта аминокислотная замена лежит близко к доминантно-негативной Pro681His мутации TLR2 гена, которая прекращает связывание MyD88 с TLR2. Этот полиморфизм, характерный для популяций Азии и Африки, практически не встречается среди белых популяций. Считается, что данный полиморфизм снижает активацию ядерного фактора-kB на Mycobacterium leprae и Mycobacterium tuberculosis, тем самым усиливая предрасположенность к развитию туберкулеза и лепры [123].
Второй важный функциональный вариант представляет собой замену G на А в 2257 нуклеотиде от стартового кодона TLR2 приводит к замене агринина на глутамин в позиции 753 цитоплазматической части рецептора (TLR2 G753A). Данный полиморфизм обнаружен по разным данным от 3 до 10% среди здорового населения представителей белой расы. Для этого полиморфизма также существуют этнические различия в частотах встречаемости.
Полиморфизм генов семейства IL-1. Роль полиморфизмов генов IL-ip и IL-IRa в развитии сепсиса
Критерий Манна - Уитни является непараметрическим аналогом критерия Стьюдента и применяется для сравнения двух групп. Этот критерий (Т) равен сумме рангов меньшей группы. Объединяют и затем ранжируют по возрастанию данные двух групп. Ранг 1 получает меньшее из всех значений. Вычисляют критерий как сумму рангов членов меньшей группы. При равенстве групп критерий вычисляется для любой из них. Вычисленное Т сравнивают с критическими значениями, представленными парами чисел. Если вычисленное Т меньше или равно первому из них, либо больше или равно второму, то различия значимы. Для оценки значимости различий в нескольких группах применяется критерий Краскела - Уоллиса. Здесь количественные показатели заменяются рангами. Критерий Краскела -Уоллиса Н критерий, основанный на рангах, является аналогом однофакторного дисперсионного анализа, когда имеются результаты измерения одинакового признака в нескольких группах. Н критерий не требует предположения о нормальности распределения измерений признака для каждой из групп. Значение критерия Краскела - Уоллиса является оценкой (мерой) разницы средних рангов групп. Если с помощью непараметрического Н критерия Краскела - Уоллиса выявляется различие нескольких групп, то нужно определить между какими группами есть статистически значимые различия. Для этого используют непараметрическое множественное сравнение (по Коноверу-Инману). Критерий Коновера-Инмана представляет собой ранговый аналог критерия минимальной значимой разницы Фишера в дисперсионном анализе и является наиболее либеральным из всех непараметрических критериев для множественного сравнения [32].
В первой части исследования наше внимание обращено на изучение распределения полиморфизмов иммунокомпетентных генов, продукты которых играют важную роль при септическом процессе. Проведен анализ вклада генов рецепторов TLR2, TLR4 и цитокинов IL-IRa, IL-ip, IL-10, TNFa в предрасположенность, развитие и исход септических состояний у ожоговых больных.
Для формирования группы контроля, соотносимой по национальности с исследуемой выборкой, на первом этапе были определены частоты аллелей и генотипов генов цитокинов и TLRs у практически здоровых лиц, принадлежащих к русской популяции Челябинской области (потенциальные доноры стволовых клеток ОГУП «ЧОСПК»), 213 человек. Далее был проведен анализ частот аллелей и генотипов у ожоговых больных с сепсисом, также принадлежащих к русской популяции Челябинской области. С этой целью среди 81 ожогового пациента, были отобраны 50 человек, соответствующие нашим условиям (русские в третьем поколении, проживающие на территории Челябинской области, на 20-30 сутки после ожога был поставлен диагноз "сепсис").
Исследование ассоциации полиморфизма генов IL-lRa, IL-13, IL-10, TNFa, TLR2 и TLR4 проводилось по следующему принципу: 1. Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов IL-lRa, IL 1(3, IL-10, TNFa, TLR2 и TLR4 у ожоговых больных по сравнению с выборкой практически здоровых доноров Челябинской области. 2. Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов в группах ожоговых больных с различным клиническим течением и исходом. Вначале было проведено сравнение наблюдаемых и ожидаемых частот генотипов, согласно равновесию Харди-Вайнберга. Наблюдаемые в исследовании доли генотипов в выборке здоровых русских соответствуют ожидаемым, популяция находится в состоянии равновесия.
При анализе частот аллелей, генотипов и гаплотипов исследуемых генов среди ожоговых больных, которым на 20-30 сутки был поставлен диагноз сепсис, и здоровых доноров были выявлены следующие закономерности.
В группе ожоговых больных обнаружены достоверные различия в частотах встречаемости генотипов и аллелей генов IL-lRa (VNTR) и TLR2 753G/A (табл. 2, 3). Примечание: далее все ожоговые больные, у которых в последствие развился сепсис обозначены в таблицах как группа "ожоговый сепсис", хотя на момент исследования диагноз сепсис еще не ставился и все исследования являются предиктовыми.
Группа ожоговых больных с сепсисом характеризовалась повышенной частотой генотипа 2г/2г (20% против 7%, критерий %2 с поправкой Иейтса=6,47 р=0,011) и редкого генотипа 4г/5г (8% против 1,9%, критерий Фишера р=0,045). Кроме того среди больных наблюдалась пониженная частота генотипа 4r/2r (18% против 39,4%, %2 с поправкой Йейтса=7,23 р=0,007) по сравнению с группой контроля.
Интересным является тот факт, что при сравнении частот аллелей гена IL-IRa не было обнаружено статистически значимых различий с группой контроля (лишь повышенная частота редкого аллеля 5г на уровне тенденции в группе с сепсисом, р=0,087). Это может свидетельствовать о том, что аллели IL-IRa способны оказывать влияние на развитие заболевания лишь находясь в составе определенного генотипа. Просто же наличие аллеля без учета генотипа, в который он входит, не может говорить в пользу предрасположенности/устойчивости к сепсису.
Критерий отношения шансов для генотипа 2r/2r (OR=3,3 95%ДИ= 1,3 8+7,84) показал статистически достоверный вклад данного генотипа в предрасположенность к развитию сепсиса у ожоговых больных. То есть, для носителей данного генотипа риск развития сепсиса выше в 3,3 раза, по сравнению с неносителями.
В то же время для генотипа 4г/2г критерий отношения шансов (OR=0,33 95%ДИ=0,15+0,72) показал его достоверный вклад в устойчивость к развитию сепсиса при ожоговой травме.
Кроме того в нашем исследовании генотип 4r/5r (OR=4,54 95%ДИ= 1,09+18,75) встречался достоверно чаще среди пациентов с сепсисом, по сравнению с контролем. Согласно литературным данным аллели Зг, 5г и 6г встречаются в популяции крайне редко, поэтому для них не выявлено диагностической значимости в развитии заболеваний. Тем не менее в нашем исследовании генотип с редким аллелем 5г показал достоверно значимый вклад в развитие сепсиса у ожоговых больных.
Определение полиморфизмов
Молекула HLA-DMA, являющаяся продуктом экспрессии гена локуса DM [127], принимает участие в стабилизации молекул HLA II, в освобождении антигенсвязывающей щели от инвариантной цепи, в корректном транспорте молекул HLA II класса из эндоплазматического ретикулума и стабильном связывании альфа-бета гетеродимеров со специфическими пептидами. Предполагается, что молекулы HLA-DM совместно с молекулами HLA-DO принимают участие в генетической рестрикции при распознавании антигена [101, 108]. В группе ожоговых больных нашего исследования так же наблюдается снижение экспрессии гена HLA-DMA.
Как известно экспрессия генов HLA II класса контролируется в основном на уровне транскрипции [109]. Одной из главных молекул регуляторов транскрипции HLA II является трансактиватор II типа СИТА [116, 146], экспрессия которого также оказалась пониженной в группе ожоговых больных нашего исследования.
Экспрессия генов HLA II класса контролируется высоко консервативным регуляторным модулем, который расположен выше сайта инициации транскрипции 150-300 пар нуклеотидов во всех генах МНС II класса. Регуляторный модуль SXY состоит из боксов S, X, Х2 и Y -имеющие строгий порядок, ориентацию и интервалы. Данный модуль обнаружен так же в области промотора генов, кодирующих а- и р-цепи молекул HLA II класса, а также в области промотора генов, кодирующих инвариантную цепь (Ii), HLA-DM, HLA-DO и молекулы HLA I класса. Связываясь с различными факторами модуль формирует мультипротеиновый комплекс - энхансеосому, который является платформой для присоединения СИТА [89].
Стоит так же отметить, что CIITA, помимо регуляции транскрипции генов HLA, осуществляет позитивную и негативную модуляцию экспрессии генов с различными функциями, что определяет характер течения таких важных для организма событий как воспаление, врожденный иммунный ответ, адаптивный иммунитет, в частности, обеспечивает: инициацию хемотаксической активности лейкоцитов и моноцитов, стимуляцию продукции миелопероксидазы, TNFa, тканевого фактора, IL-8 - подобного фактора; активацию клональной экспансии, созревания и дифференцировки Т- и В-клеток; негативную регуляцию продукции IL-4, экспрессии FAS-лиганда при сверх активации гена МНС СИТА; негативную регуляцию генов, не относящихся к системе главного комплекса гистосовместимости.
Таким образом, пониженная экспрессия генов HLA-DR и -DM скорее всего обусловлена низкой экспрессией трансактиватора СИТА, регулирующего их транскрипцию. По всей видимости, при травме снижение количества поверхностных молекул HLA происходит не только за счет их откалывания с поверхности клетки, как полагалось ранее, но и по причине снижения транскрипции генов, кодирующих как сами молекулы HLA, так и регуляторы их транскрипции.
То есть, исходя из полученных нами данных о повышении экспрессии генов TLR и снижении экспрессии генов HLA у ожоговых больных, можно сделать вывод, что наблюдается одновременное вовлечение основных звеньев иммунитета в ответ на травму. Это положение также подтверждается особенностями экспрессии генов цитокинов. У ожоговых больных наблюдается одновременное изменение в экспрессии как про- так и противовоспалительных цитокинов. Если обратиться к данным литературы, то и там можно встретить похожие результаты. В своем исследовании В.А. Cairns и СМ. Barnes продемонстрировали, что комплекс и динамика цитокинового профиля после ожога в результате активации TLR не имеет четкой про- или противовоспалительной направленности и ассоциированы с уникальными изменениями в популяции макрофагов [54].
Исходя из всего вышесказанного, мы посчитали, что самым логичным объяснением нашим результатам может служить феномен "геномного шторма". Данный феномен характеризует ответ организма на любой стресс, будь то травма, инфекция или ожог, и проявляется в одновременном изменении экспрессии генов врожденного и адаптивного иммунитета, про- и противовоспалительной направленности.
Большой интерес представляют результаты, полученные относительно экспрессии гена TREM-1. Как известно, TREM-1 (триггерный рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках) - мономерный трансмембранно активируемый рецептор, который экспрессируется нейтрофилами, моноцитами и различными субпопуляциями макрофагов [72, 106, 112,121]. Во время инфекций, вызванных Грам+ и Грам- бактериями и грибами, экспрессия мембранно-связанного TREM-1 значительно возрастает [125]. Растворимая форма TREM-1 также высвобождается из клеток и может быть количественно определена в биологических жидкостях. TREM-1 является важным регулятором в системе врожденного иммунитета, осуществляя усиление воспаления в ответ на инфекцию [65, 67, 69]. В то же время, существуют данные, указывающие, что TREM-1 не является специфическим маркером инфекционного процесса [64]. Естественный лиганд TREM-1 не известен. Однако, активация TREM-1 на моноцитах агонистом антител в присутствии лиганда Toll-подобного рецептора (TLR) синергистически усиливает продукцию провоспалительных хемокинов и цитокинов, а также снижает продукцию противовоспалительного IL-10.
В нашем исследовании группа больных характеризовалась пониженными уровнями экспрессии гена TREM-1. Возможно, это связано с тем, что мы оценивали экспрессию данного гена в мононуклеарах. Скорее всего, более показательными в отношении экспрессии гена TREM-1 при ожоговой травме являются нейтрофилы (неопубликованные данные).
Оценка экспрессии исследуемых генов в зависимости от клинического течения и исхода ожоговых больных
Две основные группы (I и II группы), то есть ожоговые больные на разные сутки ожога различались между собой по уровням экспрессии генов TLR2 и TLR4. А именно, ожоговые больные на 3-6 сутки ожога экспрессировали более высокие уровни TLR2 и TLR4 по сравнению с больными на 10-17 сутки. Вероятней всего, такие особенности экспрессии генов TLR в первые дни после ожога обусловлены активацией врожденного иммунитета в ответ на травму. Такая активация, как отмечалось ранее, может происходить не только при попадании инфекционного агента, но и при появлении в организме большого количества эндогенных молекул повреждения тканей. Затем в более поздние сроки после травмы происходит снижение уровней экспрессии генов TLR. В литературе так же существуют данные, указывающие на повышение экспрессии TLR2 и TLR4 в ранние сроки после ожога, и затем на снижение их экспрессии в более поздние сроки (после 14 суток), предполагая, что это происходит под воздействием цитокинов ТЪ2, в частности IL-10 [54].
Далее в нашей работе мы сравнивали группы ожоговых больных с учетом клинического течения и исхода сепсиса.
Наибольший интерес представляют результаты, полученные в группе больных с ПОН и летальным исходом.
Уровни экспрессии генов у ожоговых больных на 3-6 сутки имели следующие особенности - группа больных с ПОН и летальным исходом (группа 4) показала пониженные уровни экспрессии гена IL-1 и повышенные уровни TLR2. А группа выздоровевших после ССВО (группа 1) показала пониженные уровни TREM-2 (рис.19) по сравнению с теми, у кого в дальнейшем развился сепсис.
TREM-2 - также является триггерным рецептором на миелоидных клетках [55, 125], однако в отличие от TREM-1, оказывает позитивную регуляцию апоптоза и негативную регуляцию воспалительного процесса. В доступной нам литературе нет данных об экспрессии гена TREM-2 при ожоговой травме. Можно предположить, что в ранние сроки после травмы системное воспаление у ожоговых пациентов еще не было обусловлено наличием инфекции, поэтому экспрессия гена TREM-2 была снижена.
Группа пациентов с летальным исходом (на 10-17 сутки) показала низкую экспрессию генов HLA-DRA, -DMA, IFNy, и повышенную экспрессию генов TNFa, TLR2, TLR4, TREM-2 по сравнению с выжившими. Из полученных нами данных видно, что на 10-17 сутки в группе с летальным исходом увеличивается число показателей, которые имеют значимые различия. Становится видно, что особенностью пациентов с летальным исходом является снижение уровней экспрессии генов адаптивного иммунитета и повышение экспрессии генов иммунного ответа с преобладанием врожденного. Наши результаты соотносятся с концепцией "геномного шторма", которая указывает на одновременные изменения как во врожденном, так и в адаптивном иммунитете при травме. Причем эти изменения имеют ту же направленность, что и в нашем исследовании - гены, экспрессия которых увеличивается, отвечают в основном за врожденный иммунитет, микробное распознавание и воспаление; гены, экспрессия которых снижается, отвечают за Т-клеточную функцию и презентацию антигена.
Исходя из вышесказанного, для прогноза клинического течения и исхода сепсиса у обожженных можно использовать оценку уровней экспрессии в динамике, при этом понижение экспрессии генов HLA и повышение экспрессии генов TLR может говорить о высокой вероятности развития ПОН и летального исхода у обожженных.
6. Шестой задачей нашего исследования было оценить возможную связь особенностей экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-lp, TNFot, IFNy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 с наличием полиморфизмов генов IL-IRa, IL-ip, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4. В результате мы не обнаружили достоверных различий в уровнях экспрессии генов в зависимости от их полиморфизма. В доступной нам литературе не встречалось подобных исследований. В основном представлены работы, где изучалась и была установлена связь полиморфизмов генов с выработкой конечного продукта. Мы не изучали концентрации конечных продуктов исследуемых нами генов в зависимости от их полиморфизма. Возможно, связь продукции цитокинов с полиморфизмом генов существует, однако изучая уровни экспрессии не стоит забывать о посттранскрипционных и посттрансляционных модификациях, которые, безусловно, оказывают влияние на выработку конечного продукта. Возможно, именно с посттранскрипционными модификациями может быть связаны расхождения полученных нами данных об отсутствии зависимости экспрессии от полиморфизмов и данных о связи полиморфизмов с продукцией конечного белка.
Таким образом, в настоящее время пришло понимание того, что сепсис является комплексным, динамичным синдромом с высокой степенью гетерогенности, но не отдельным заболеванием. Сепсис это результат, складывающийся из различных причин, и чувствительность к нему может определяться преморбидными факторами, включая этническую принадлежность, пол, возраст, генетические особенности организма и факторы окружающей среды. Особое место занимают генетические и эпигенетические изменения, такие как мутации в генах, кодирующих паттерн-распознающие рецепторы или медиаторы воспаления и их рецепторы, способные модифицировать иммунный ответ организма. Поскольку подлежащий иммунный ответ в ходе сепсиса носит индивидуальный характер и варьирует между пациентами, то, возможно, в терапии таких состояний было бы эффективно использовать различные подходы. Наиболее правильным кажется то, что пациенты, при оценке полиморфизмов генов и уровней их экспрессии, могли бы подвергаться точному мониторированию для обнаружения изменений в характерных маркерах иммунного ответа, для того чтобы делать прогноз и правильный выбор специфической иммуномодулирующей терапии.
