Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время все большую актуальность приобретает диагностика различных заболеваний на основе биологических маркеров. Набор известных биомаркеров на уровне клеток и субклеточных структур пополняется таковыми на уровне генома. Создание комплекса новых биохимических и молекулярно-генетических маркеров должно дать мощный импульс для развития диагностики, позволяющей прогнозировать риски развития заболеваний, обнаружения заболеваний на ранних стадиях, а также прогнозировать течение болезни.
Усилия ученых направлены на идентификацию и характеристику молекулярных биомаркеров и разработку соответствующих тест-систем и методов оценки. Это одна из актуальных задач, решаемых молекулярной медициной. Определение комплекса биомаркеров позволяет выявить молекулярные механизмы возникновения заболеваний, а также находит применение в клинической практике для диагностики широко распространенных социально значимых мультифакториальных заболеваний, таких как онкологические и сердечно-сосудистые заболевания.
Ранняя диагностика сердечно-сосудистых заболеваний и необходимость создания систем быстрого определения риска их развития приобретают в последнее время все большую актуальность. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), в частности ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ее осложнение – инфаркт миокарда (ИМ), продолжают оставаться главной причиной смертности мужчин и женщин экономически развитых стран Европы и США (Рагино Ю.И. и соавт., 2008; Шевченко О.П., Мишнев О.Д., 2005; Tsimikas S., Mooser V., 2004). Ежегодно в странах Западной Европы они становятся причиной смерти у 4 млн. человек. У половины, или почти у 2 млн. человек, смерть наступает в результате ИБС (Шевченко О.П., Мишнев О.Д., 2005). Болезнь коронарных сосудов – ведущая причина смертности среди населения США, составляющая более 25% смертей людей старше 35 лет (Kannel W.B., 2005). В Российской Федерации в 90-е гг. в целом заболеваемость ИБС возросла на 24%, заболеваемость стенокардией – на 41%, острым инфарктом миокарда – почти на 16%. Ежегодно в России от ССЗ умирает более 1 млн. человек. По данным ВОЗ, в структуре смертности от ССЗ на долю ИБС приходится 47% (Щепин О.П. и соавт., 2009).
Многочисленные исследования в последние годы ознаменовались определенными достижениями в изучении механизмов развития и прогрессирования ИБС. Создание новых групп фармацевтических препаратов и внедрение их в клиническую практику позволили снизить риск развития острой кардиоваскулярной патологии. Тем не менее, ИБС и прогрессирование коронарного атеросклероза остаются главными причинами смертности и инвалидизации населения. Современная стратегия ведения пациентов с ИБС включает в себя раннюю и точную диагностику заболевания, стратификацию риска и прогноза, что требует поиска новых биологических маркеров и оценки их ассоциации с заболеванием. Наиболее важным представляется поиск ранних чувствительных и специфичных маркеров развития нестабильности атеросклеротических бляшек, изменение уровня которых можно обнаружить до или в отсутствие повреждения клеток миокарда (Bayes-Genis A. et al., 2001).
Частота онкологических заболеваний неуклонно растет и начинает теснить сердечно-сосудистые. Так, показатель заболеваемости злокачественными новообразованиями на 100 тыс. населения в Российской Федерации в 2001 г. составил 312,3 чел., в 2006 г. – 332,2 чел. (Щепин О.П. и соавт., 2009).
Исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака - одна из наиболее актуальных проблем современной молекулярной медицины. Основной причиной злокачественной трансформации клетки являются генетические факторы. Молекулярно-генетические исследования генома злокачественной опухоли представляют собой фундаментальную проблему, разрешения которой требует клиническая практика. В связи с тем, что частота онкопатологии постоянно растет, а возраст манифестации заболевания уменьшается, большую актуальность приобретает проспективная диагностика онкопатологии в рамках ежегодных диспансеризаций и в группах риска.
Поиск и характеристика молекулярной патологии в злокачественных опухолях является самостоятельным и очень важным направлением в молекулярной диагностике, так как позволяет расшифровать механизмы канцерогенеза, определить прогноз заболевания, тактику лечения и осуществлять мониторинг рецидивирования. Разработка методов обнаружения молекулярных маркеров дает возможность создавать эффективные диагностические системы. Нами разработаны и описаны в данной работе системы молекулярных маркеров для диагностики рака почки, предстательной железы, цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки, увеальной меланомы.
Злокачественная трансформация клетки является процессом многоступенчатым, включающим накопление структурных и функциональных изменений в геноме клетки. К структурным, или генетическим маркерам относят все нарушения, которые изменяют структуру ДНК. В первую очередь, это крупные аномалии, такие как делеции целых хромосомных районов, содержащих гены-супрессоры опухолевого роста и дупликации или амплификации районов, содержащих клеточные протоонкогены, факторы роста и др.; транслокации и инверсии хромосомного материала, в результате которых могут образовываться химерные гены, имеющие онкогенные функции. Другим результатом структурных перестроек может оказаться ситуация, когда клеточный протоонкоген получает дополнительные активирующие регуляторные элементы и начинает гиперэкспрессироваться. И, наконец, к структурным аномалиям относят различные типы мутаций, которые могут активировать протоонкогены или инактивировать гены-супрессоры (Залетаев Д.В. и соавт., 2009).
К функциональным маркерам относят все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям в уровне экспрессии генов, участвующих в процессах канцерогенеза. Профиль экспрессии генов в опухоли кардинально изменен по сравнению с нормальной тканью, поэтому определенные сочетания генов, теряющих свою экспрессию, или, наоборот, гиперэкспрессирующихся в определенном типе опухоли, могут являться диагностическими и прогностическими маркерами. Изменения в экспрессии гена без изменения его нуклеотидной структуры относятся к эпигенетической регуляции. К таким функциональным нарушениям в первую очередь относят метилирование регуляторных районов генов-супрессоров опухолевого роста, что приводит к их полной инактивации (Залетаев Д.В. и соавт., 2009).
Каждая конкретная опухоль уникальна по набору патологических изменений, так же как и геном каждого конкретного пациента. Для каждой опухоли существуют наиболее характерные пути регуляции и молекулярные маркеры, которые специфичны для начала заболевания, его прогрессии и терминальных стадий. Молекулярные маркеры позволяют четко определить стадию злокачественного процесса и проследить молекулярную эволюцию опухолевого процесса. Для опухолей различных тканей и органов такие маркеры могут значительно отличаться.
Мониторинг молекулярных маркеров, которые обнаруживаются задолго до клинических проявлений, позволяет вовремя начать более тщательную диагностику и превентивную терапию. Определенные биологические и молекулярно-генетические маркеры или их сочетание позволяют определить начальные стадии, прогноз развития заболевания, подобрать оптимальную тактику лечения и разработать таргетные терапевтические средства. Поэтому важнейшей практической задачей является разработка алгоритма исследования диагностических маркеров социально значимых заболеваний.
Цель исследования
Поиск и характеристика ключевых молекулярных маркеров сердечно-сосудистых и некоторых онкологических заболеваний с целью разработки лабораторно-диагностических систем для ранней диагностики, прогноза развития и оценки эффективности терапии этих заболеваний.
Задачи исследования
-
Провести сравнительный анализ уровня экспрессии активатора плазминогена урокиназного типа (uPA) и ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) в моноцитах периферической крови больных со стабильным течением ИБС и больных с острым коронарным синдромом (ОКС) для выявления связи уровня экспрессии этих белков со степенью тяжести заболевания.
-
Определить уровни С-реактивного белка (СРБ) и адипонектина в крови больных со стабильным течением ИБС и с ОКС для оценки взаимосвязи этих показателей с риском возникновения ОКС.
-
Исследовать аллельные делеции генов-супрессоров VHL, RASSF1 и FHIT и метилирование гена CDH1 при светлоклеточном раке почки (СРП) с целью поиска прогностических критериев этого заболевания; исследовать мутации и метилирование гена VHL для определения эффективности назначения таргетной терапии светлоклеточного рака почки.
-
Изучить полиморфные варианты генов ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR для определения предрасположенности к развитию спорадического рака почки.
-
Исследовать потери гетерозиготности и микросателлитную нестабильность хромосомных районов 13q14 и 16q23 при раке предстательной железы (РПЖ) с целью поиска диагностических и прогностических критериев данного заболевания.
-
Оценить частоту образования химерных транскриптов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 при раке предстательной железы и определить их диагностический потенциал.
-
Исследовать нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов-супрессоров на ранних стадиях канцерогенеза шейки матки и определить маркеры, имеющие диагностический потенциал.
-
Исследовать аллельные делеции в хромосомах 3 и 1р36 при увеальной меланоме с целью разработки диагностических и прогностических критериев данного заболевания.
-
Изучить морфологическую и молекулярно-генетическую внутриопухолевую гетерогенность колоректальных аденокарцином.
Научная новизна
Важное значение имеют впервые полученные методом проточной цитофлуориметрии данные о характере изменения уровня экспрессии PAI-1 в моноцитах периферической крови больных ИБС, так как одним из патогенетических факторов ИБС является снижение фибринолитической активности крови.
Впервые разработан метод определения молекулярно-генетических маркеров для оценки прогрессии первичной опухоли при светлоклеточном раке почки, а также метод выявления среди пациентов с метастатическим светлоклеточным раком почки лиц, в отношении которых наиболее эффективно назначение таргетных препаратов, действие которых связано с VHL-зависимыми патогенетическими механизмами.
Нами предложена молекулярно-генетическая методика выявления среди пациентов с различными заболеваниями предстательной железы лиц с РПЖ, а также прогноза гистологически подтвержденного РПЖ. Методика основана на определении потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13q14 и 16q23 в ткани ПЖ. Впервые продемонстрировано, что при раке предстательной железы наличие химерного онкогена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухолеспецифическим событием, коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером этого рака, а также маркером андрогенчувствительности опухолевых клеток и оценки ответа опухоли на гормональную терапию. Нами предложен способ определения экспрессии химерного онкогена TMPRSS2/ERG4 методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров.
Впервые предложены методики определения молекулярных маркеров метилирования при ряде онкологических заболеваний. Нами разработана система ДНК-маркеров (маркеры метилирования генов р16, MLH1 и N33) для ранней диагностики рака шейки матки (РШМ), имеющая высокую чувствительность и специфичность. Полученные результаты позволяют считать, что исследование гиперметилирования генов-супрессоров вместе с цитологическим исследованием и тестированием вируса папилломы человека может служить основой для мониторинга женщин с высоким риском развития рака шейки матки. Разработан метод определения метилирования генов N33 и GSTP1 при аденокарциномах предстательной железы, что может помочь в диагностике данного заболевания.
Нами разработан метод выявления специфических молекулярных маркеров при увеальной меланоме, который может использоваться для верификации диагноза «увеальная меланома», а также метод оценки прогрессии первичной опухоли при данном заболевании.
Впервые продемонстрирована молекулярно-генетическая внутриопухолевая гетерогенность колоректальных аденокарцином.
Работа по определению молекулярно-генетических маркеров перечисленных онкологических заболеваний удостоена премии Правительства РФ 2009 года в области науки и техники для молодых ученых («Разработка и внедрение методов ДНК-диагностики для раннего определения и прогноза некоторых онкологических заболеваний»).
Практическая значимость
Настоящая работа представляет практический интерес для диагностики и оценки прогноза таких социально значимых заболеваний, как ИБС и ряд злокачественных новообразований. Проведенное исследование позволило на основании полученных данных выделить маркер развития острого коронарного синдрома, который можно определить в моноцитах периферической крови, а также биомаркеры, которые можно использовать для дополнительной оценки степени тяжести воспалительного процесса у больных со стабильным течением ИБС. Это позволяет предложить более тщательную программу диагностических мероприятий и своевременно скорректировать проводимую терапию.
Исследование аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в коротком плече хромосомы 3, и метилирование гена CDH1 представляет собой метод оценки прогрессии и способности к метастазированию первичной опухоли при светлоклеточном раке почки. Полученные результаты легли в основу новой медицинской технологии. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/150.
Разработанная нами медицинская ДНК-технология позволяет выделять VHL-зависимые и VHL-независимые группы пациентов со светлоклеточным раком почки и, соответственно, оптимизировать тактику и эффективность лечения таргетными препаратами, действие которых связано с VHL-зависимыми патогенетическими механизмами. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/152.
Для выявления пациентов с начальными стадиями РПЖ, а также для прогноза гистологически подтвержденного РПЖ в целях подбора наиболее оптимальных вариантов терапии нами разработана медицинская ДНК-технология, направленная на определение делеций хромосомных районов 13q14 и 16q23 в биопсийных образцах больных. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/151.
При РПЖ разработанная методика позволяет определять наличие химерного онкогена в ткани опухоли. Поскольку он служит маркером неблагоприятного прогноза и андрогенчувствительности опухоли, появляется возможность оптимизировать тактику и эффективность лечения рака предстательной железы. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/153.
Молекулярные маркеры метилирования (при раке шейки матки, раке предстательной железы) позволяют выявить начальные стадии злокачественного процесса еще до того, как обнаруживаются морфологические изменения. Это позволяет начать терапию заболевания на ранних сроках и избежать высокодозной химиотерапии, тяжелой инвалидизации и летального исхода. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/154 (ранняя диагностика рака шейки матки).
При увеальной меланоме разработанный метод исследования аллельных делеций в хромосоме 3 позволяет выявлять специфические молекулярные маркеры для верификации диагноза «увеальная меланома» в дополнение к применяемым в настоящее время диагностическим методам. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2009/319.
Описанное в данной работе исследование потери гетерозиготности в хромосомах 3 и 1р36 представляет собой метод оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2009/318.
Личный вклад автора
Автором проведен подбор возможных молекулярных маркеров для диагностики и прогноза исследуемых онкологических заболеваний и ишемической болезни сердца. Автором осуществлены лабораторные исследования с использованием иммуноцитохимического, иммуногистохимического, цитофлуориметрического и иммуноферментного методов определения биомаркеров ишемической болезни сердца. Проведена статистическая обработка всех полученных данных. Автором проанализированы полученные результаты исследования ключевых молекулярных маркеров ишемической болезни сердца и ряда онкологических заболеваний; сформулированы выводы и практические рекомендации.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в клинико-диагностическую работу в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена, Российском научном центре хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН.
Полученные практические и теоретические выводы применяются в учебном процессе кафедры биохимии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М.Сеченова, кафедры биохимии МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедры клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипломного образования.
Апробация работы
Апробация диссертации проведена 18 ноября 2010 г. на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики, кафедры биохимии ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава, кафедры биохимии, лаборатории молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ, лаборатории эпигенетики ГУ Медико-генетический научный центр РАМН (протокол № 19).
Материалы диссертации доложены на 20-м Европейском Конгрессе Патологии (Париж, Франция, 2005 г.), Российском медицинском форуме (Москва, 2007), Конференции для молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), на съездах Европейского общества генетиков человека ESHG (Ницца, Франция, 2007 г. и Барселона, Испания, 2008 г.), 7-м Международном симпозиуме по множественным факторам риска сердечно-сосудистых заболеваний (Венеция, Италия, 2008 г.), 6-м Конгрессе по метаболическому синдрому, диабету II типа и атеросклерозу (Берлин, Германия, 2009 г.), 6-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 25 печатных работ. Из них - 12 статей и 11 тезисов, глава в книге «Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний», глава в книге «Введение в молекулярную диагностику». Получено 7 разрешений на применение новых медицинских технологий (ФС №2008/150, ФС №2008/152, ФС №2008/151, ФС №2008/153, ФС №2008/154, ФС №2009/319, ФС №2009/318). Работа «Разработка и внедрение методов ДНК-диагностики для раннего определения и прогноза некоторых онкологических заболеваний» отмечена премией Правительства РФ 2009 года в области науки и техники для молодых ученых (распоряжение Правительства Российской Федерации от 1 марта 2010 года № 248-р г.Москва).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 235 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 2 глав результатов собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Текст иллюстрирован 24 таблицами и 34 рисунками. Указатель литературы содержит 289 источников, из них 26 - отечественных.
Положения, выносимые на защиту
-
Фактором риска развития ОКС у больных ИБС является нарушение регуляции гемостаза, обусловленное ростом уровня экспрессии ключевого компонента системы фибринолиза PAI-1 в моноцитах периферической крови.
-
Изменение соотношения уровня СРБ и адипонектина в плазме крови больных со стабильным течением ИБС, а именно рост уровня СРБ при снижении уровня адипонектина свидетельствует о развитии воспаления и, как следствие, осложнений ИБС.
-
Структурная и функциональная патология генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT и CDH1 имеют существенную диагностическую, прогностическую и терапевтическую значимость при СРП.
-
Аллельные делеции локуса 16q23, метилирование генов GSTP1 и N33 и экспрессия химерного гена TMPRSS2/ERG4 являются ключевыми нарушениями при РПЖ и могут быть использованы в качестве маркеров для диагностики, прогноза течения и оценки эффективности лечения заболевания.
-
Система эпигенетических маркеров (аномальное метилирование Р16, MLH1 и N33) имеет 85%-ю чувствительность и специфичность и может быть использована для ранней диагностики рака шейки матки.
-
Моносомия по хромосоме 3 и аллельные делеции хромосомного района 1р36 при увеальной меланоме позволяют определять пациентов с агрессивным течением и высоким риском метастазирования первичной опухоли.
