Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
Глава 1.1. Определение и классификация атопического дерматита 10
Глава 1.2. Патогенез атопического дерматита 12
Глава 1.2.1. Наследственная предрасположенность к атопии 12
Глава 1.2.2. Роль иммунорегуляторных клеток и цитокинов в патогенезе атопического дерматита 26
Глава 1.2.3. Участие клеток Лангерганса и макрофагов в патогенезе атопического дерматита 35
Глава 2. Материалы и методы 43
Глава 2.1. Характеристика клинической группы генетических и клинико иммунологических исследований 43
Глава 2.2. Методы исследования 46
Глава 2.1.1.Генотипирование на наличие мутаций R501X и 2282del4 в гене филаггрина 46
Глава 2.2.2. Кожное окно 50
Глава 2.2.3. Определение концентрации цитокинов в экссудате «кожного окна» 51
Глава 2.2.4. Иммуногистохимическое определение CD la, CD68 в биоптатах кожи 52
Глава 2.2.5. Электронная микроскопия 54
Глава 2.2.6. Методы статистической обработки 55
Глава 3. Клинические особенности пациентов с делецией 2282del4 и мутацией R501X в гене филаггрина при атопическом дерматите 56
Глава 4. Цитокиновый профиль «кожного окна» и иммуногистохимические аспекты местного иммунитета кожи пациентов с делецией 2282del4 и мутацией R501X в гене филаггрина при атопическом дерматите 71
Глава 4.1. Особенности показателей цитокинов "кожного окна" у пациентов с атопическим дермтаитом с мутациями в гене филаггрина 71
Глава 4.2. Исследование количества клеток Лангерганса и макрофагов в биоптатах кожи методом иммуногистохимии у пацинтов с атопическим дерматитом с мутациями в гене филаггрина 85
Глава 4.2.1. Особенности локализации и количества клеток Лангерганса и их отростков в эпидермисе у пациентов с мутациями в гене филаггрина при атопическом дерматите 85
Глава 4.2.2. Особенности количественного состава макрофагов в дерме у пациентов с мутациями в гене филаггрина при атопическом дерматите 92
Глава 4.3. Особенности электронной микроскопии кожи у пациентов с мутациями в гене филаггрина при атопическом дерматите 96
Глава 5. Обсуждение результатов 98
Выводы 116
Практические рекомендации 117
Список литературы 118
- Наследственная предрасположенность к атопии
- Клинические особенности пациентов с делецией 2282del4 и мутацией R501X в гене филаггрина при атопическом дерматите
- Особенности показателей цитокинов "кожного окна" у пациентов с атопическим дермтаитом с мутациями в гене филаггрина
- Особенности количественного состава макрофагов в дерме у пациентов с мутациями в гене филаггрина при атопическом дерматите
Введение к работе
Актуальность темы. Рост заболеваемости, хроническое, с частыми рецидивами течение, недостаточная эффективность существующих методов лечения и профилактики ставят атопический дерматит (АтД) в ряд наиболее актуальных проблем современной медицины. Среди взрослого населения заболеваемость в развитых странах составляет 2-10% [Herd R. M., 1998].
Признание иммунологической концепции развития АтД послужило поводом для всестороннего изучения его иммунных механизмов. Однако в последнее время обосновывается представление об атопии как феномене, в развитии которого принимают участие как иммунные, IgE-опосредованные, так и многочисленные неиммунные механизмы [Пыцкий В. И., 2005]. К последним, в частности, относится повышение проницаемости кожи при АтД, связанное с нарушением процесса кератинизации вследствие дефекта синтеза филаггрина [Barker J. N., 2006; Broen S. J., 2008]. Филаггрин является ключевым белком, участвующим в конечной дифференцировке кератиноцитов и образовании кожного барьера [Korge B., 2009]. По результатам недавних исследований была доказана ассоциация мутаций в гене филаггрина с развитием АтД [C. N. Palmer et al., 2006].
По данным литературы изучение частоты мутаций в гене филаггрина у пациентов с АтД в России не проводилось. Поэтому представляется интересным исследование частоты данной мутаций среди пациентов с АтД и влияние генетического дефекта на клиническую картину заболевания.
Вероятно, ослабление барьерной функции кожного покрова у пациентов с мутациями в гене филаггрина способствует повышенному проникновению аллергенов трандермальным путем. Следствием этого могут являться изменения показателей атопического воспаления в коже, в частности цитокинов, как основных регуляторов атопического процесса на местном уровне [Фрейдлин И.С., 2001; Симбирцев А.С., 2004; Маянский А.Н., 2005].
По результатам научных работ, проведенных иностранными исследователями, нарушение кожного барьера вследствие дефекта синтеза белка филаггрина, способствует активации особого подтипа клеток иммунной системы Th17 и определяет темпы хронизации аллергического воспаления [Oyoshi M., 2009]. M. D. et al. [2007] показали, что изменение экспрессии белка филаггрина у мышей влияет на цитокиновый профиль в коже.
Вследствие этого, представляет научный интерес изучение у пациентов с мутациями в гене филаггрина при АтД содержание ключевых цитокинов основных субпопуляций Т-лимфоцитов на местном уровне (IFN-, IL-4, IL-10, IL-17).
В проведенном исследовании у пациентов с мутациями в гене филаггрина при вульгарном ихтиозе, ассоциированным с АтД, выявлено увеличение количества клеток Лангерганса (КЛ) в эпидермисе, что может быть обусловлено нарушением барьерной функцией кожи и возможностью проникновения аллергенов через кожу [Oji V., 2009]. Количество КЛ в эпидермисе при АтД повышается при процессах ремоделирования кожи, вызванных длительными воспалительными процессами [Leung D.Y.M., 2000]. Установлено, что при ремоделировании кожи также наблюдается увеличение содержания макрофагов в дерме. Исследование количественного состава данных клеток у пациентов с мутациями в гене филаггрина позволит оценить являются ли мутации в гене филаггрина фактором ремоделирования кожи у пациентов при АтД.
Важность детального изучения патогенетического значения нарушенной барьерной функции кожи, вызванной мутациями в гене филаггрина, в развитии АтД создает предпосылки для более точного понимания тех биологических механизмов, которые лежат в основе патологического процесса. Это является важным фактором для последующего развития более эффективных методов контроля АтД, разработки новых подходов к диагностике и может оказаться концептуальной основой для новых направлений терапии.
Цель работы: исследовать концентрацию цитокинов в экссудатах «кожного окна» и оценить содержание антигенпредставляющих клеток в коже у больных с атопическим дерматитом в сочетании с мутациями в гене филаггрина.
Задачи:
-
Исследовать частоту мутаций 2282del4 и R501X в гене филаггрина в обследуемой группе пациентов с атопическим дерматитом и изучить особенности клинической характеристики у больных атопическим дерматитом в сочетании с мутациями в гене филаггрина.
-
Определить концентрации IL-4, IFN-, IL-10 и IL-17 в кожных экссудатах больных атопическим дерматитом.
-
Охарактеризовать особенности концентраций IL-4, IFN-, IL-10 и IL-17 в экссудате «кожного окна» у пациентов с мутациями в гене филаггрина.
-
Определить количество CD1a+ клеток Лангерганса в эпидермисе и CD68+ клеток (макрофагов) в дерме у пациентов с атопическим дерматитом.
-
Оценить особенности содержания CD1a+ клеток в эпидермисе и CD68+ клеток в дерме у пациентов с мутациями в гене филаггрина.
Научная новизна работы
Впервые получены данные по частоте встречаемости мутаций R501X и 2282del4 в гене филаггрина у пациентов с АтД в Западной Сибири. Впервые отмечены особенности клинико-анамнестических данных пациентов АтД с мутациями в гене филаггрина.
Определены концентрации ключевых цитокинов основных адаптивных иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов на локальном уровне (в экссудатах «кожного окна») у пациентов с мутациями R501X и 2282del4 в гене филаггрина при АтД. Выявлены особенности количества CD1a-положительных КЛ и CD68-позитивных клеток у пациентов с мутациями в гене филаггрина в разные периоды АтД.
Теоретическая значимость
Исследование содержания цитокинов в «кожном окне» и характеристика CD1a- и CD68-позитивных клеток в коже у пациентов с мутациями R501X и 2282del4 в гене филаггрина при АтД вносят вклад в понимание особенностей патогенеза этой болезни при данном генетическом дефекте.
Практическая значимость
Определение концентрации цитокинов в «кожном окне» и количества CD1a- и CD68-позитивных клеток в коже у пациентов АтД с мутациями R501X и 2282del4 в гене филаггрина позволяет оценить интенсивность атопического воспаления на местном уровне. Наличие резидуальной воспалительной активности в коже в период ремиссии предполагает включение в поддерживающую терапию АтД нестероидных противовоспалительных препаратов типа ингибитора кальциневрина (пимекролимус) длительными интермитирующими курсами.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Мутации 2282del4 и R501X в гене филаггрина являются предрасполагающим фактором для развития атопического дерматита. Пациенты с мутациями в гене филаггрина имеют клинические особенности болезни, обусловленные нарушениями барьерной функции кожи.
-
У пациентов с атопическим дерматитом с мутациями в гене филаггрина наблюдается повышение содержания IL-4 в кожных экссудатах и увеличение количества CD1a+ клеток Лангерганса и их отростков в эпидермисе как отражение более высокого уровня воспалительной активности и готовности к инициации иммунных ответов в коже.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (г. Омск, 2007, г. Томск, 2008), на XI Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), на VII Российской конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010), на заседании проблемной комиссии по иммунологии и инфекционным болезням Сибирского государственного медицинского университета (Томск, 2010).
Публикации. По материалам исследования было опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук, и 1 медицинская технология "Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии" ФС№2010/217 от 10.06.2010.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 151 странице. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «материалы и методы исследования», результатов собственных исследований, отраженных в двух главах, заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 29 таблицами, 17 рисунками. Список литературы включает 323 источника, из них 81 - отечественных и 242 зарубежных.
Наследственная предрасположенность к атопии
АтД является мультифакториальным заболеванием. Существенную роль в развитии этого заболевания играют генетические факторы. Уже с 60-х гг. прошлого столетия было известно, что АтД относится к группе так называемых комплексных генетических заболеваний, в основе которых лежит генетическая предрасположенность, но без менделевского типа наследования. То есть, начало заболевания (а также его течение и степень тяжести) обусловлено взаимодействием предрасполагающих генов и триггерных факторов окружающей среды [116].
Позднее были проведены множественные семейные, близнецовые, генетические, эпидемиологические и математические методы исследования с целью выявления наследственных закономерностей в развитии АтД [6, 72, 129, 173, 193, 197, 199, 281, 318]. В результате было установлено, риск развития АтД наибольший у детей, в семье которых оба родителя страдают каким-либо аллергическим заболеванием. АтД развивается у 81% детей, если больны оба родителя, у 59%, если АтД болен один из родителей, а другой имеет признаки атопического заболевания дыхательных путей и у 56%, если болен только один из родителей [6, 197]. Вероятность развития АтД у ребенка выше, если атопическим заболеванием страдает мать [281]. Эпидемиологические исследования больных аллергией в России показывают, что наличие аллергических заболеваний у более двух поколений родственников доводит вероятность проявления аллергии у ребенка почти до 100% [72].
Таким образом, многочисленные данные, полученные в эпидемиологических исследованиях, однозначно свидетельствуют о генетической предрасположенности к атопии, а современные геномные работы конкретизируют, какие именно наследственные факторы имеют для этого наибольшее значение.
Самым важным результатом этих исследований является тот факт, что гены расположены на разных хромосомах [173]. Отсюда вытекает другое фундаментальное положение, что эти гены передаются по наследству независимо друг от друга. Следовательно, каждый потомок получает различный набор генов из атопических генотипов своих родителей. Это подтверждается исследованиями близнецов. У гомозиготных близнецов совпадение проявлений атопического заболевания отмечено в 80% случаев, в то время как у гетерозиготных - лишь в 20% [193, 318].
В 80-90-х годах XX века были проведены многочисленные исследования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в целях позиционного клонирования и изучения генов кандидатов. Позиционное клонирование представляет собой исследование сцепления фенотипа с известными маркерами в геноме человека. К настоящему моменту опубликованы результаты 12 полногеномных ассоциативных исследований для атопии, АтД и бронхиальной астмы (БА) с тестированием большого количества маркеров, равномерно распределенных по всем хромосомам человека [115]. Согласно результатам этих работ, гены атопии и связанные с ними заболевания расположены в нескольких участках генома человека (табл. 1).
Важно отметить ряд обстоятельств в связи с широкогеномными исследованиями атопии. Во-первых, наиболее высока повторяемость результатов этих работ для регионов 5q23-31, 6р21.1-р23, llql3, 12ql4-24.33 и 13qll-32. По-видимому, именно здесь расположены наиболее значимые гены атопии. Во-вторых, имеет место этническая специфика в детерминации этого состояния, что доказывается различием некоторых участков сцепления в этнически дифференцированных популяциях. Эти различия могут лежать в основе межпопуляционной вариабельности заболеваемости атопическими патологиями. В-третьих, подтверждается известная идея о различных молекулярных основах атопии и специфических признаков, свойственных конкретным атоническим заболеваниям. Например, локусы, сцепленные с БА или бронхиальной геперреактивностью (повышенная чувствительность бронхов к констрикторным стимулам), в ряде случаев не проявляют сцепления с уровнем IgE и наличием специфической сенсибилизации по данным кожного тестирования [199, 281].
Генетическим исследованиям мультифакториальных заболеваний во многом способствует детальное описание патогенеза изучаемых болезней. Зная молекулярные механизмы формирования заболеваний, можно наметить гены, белковые продукты которых имеют в этом наибольшее значение. Такие гены будут являться «кандидатами» на роль генов подверженности к заболеванию. Изучение их изменчивости в связи с патологическими состояниями позволит выявить наследственные молекулярные особенности, предрасполагающие к развитию болезни.
Учитывая достижения современной молекулярной медицины можно выделить несколько групп кандидатных генов, контролирующих возможность формирования АтД[116]:
1 класс - гены, предрасполагающие к атопии (увеличение общего IgE);
2 класс - гены, влияющие на IgE-ответ;
3 класс - гены гиперреактивности кожи, не зависимой от атопии;
4 класс - гены, формирующие воспаление путем взаимодействия «воспалительных» цитокинов независимо от IgE.
Первые две группы относятся к специфическим "(иммунным) механизмам, а другие две - неспецифическим (неиммунным) механизмам развития АтД [61, 70]. Причинно-значимые в развитии АтД гены могут отличаться у разных индивидуумов, что свидетельствует о генетической гетерогенности данного заболевания [64]. Отсутствие одного из звеньев такой предрасположенности уже может обеспечить отсутствие заболевания или слабую выраженность его клинических проявлений.
Количество генов, вовлеченных в развитие атопических заболеваний, можно только предполагать. К настоящему моменту опубликованы исследования ассоциаций атопии примерно с 80 генами-кандидатами, практически для половины из них получены согласованные, воспроизводимые результаты [116].
Гены иммунных механизмов.
Признание иммунологической концепции развития АтД послужило поводом для всестороннего изучения не только его иммунных механизмов, но и генов, кодирующих эти механизмы.
Интерлейкины (ИЛ) играют ключевую роль на всех стадиях реализации атопических реакций [32, 58, 59, 65, 197, 199]. Особенно важными являются IL-4, переключающий В-лимфоциты на производство IgE; IL-5, привлекающий эозинофилы в очаг воспаления; IL-9, активирующий тучные клетки; IL-13, дублирующий функции IL-4. Интересно, что все эти ИЛ расположены в одном кластере на хромосомном участке 5q24-31, для которого неоднократно было показано сцепление с атопическими заболеваниями и признаками. В связи с этим гены ИЛ активно исследуют в связи с атопией.
В недавнем масштабном исследовании с использованием дизайнов «случай-контроль» и семейных тестов на ассоциацию установлена связь гаплотипа, сформированного полиморфизмами — 589С/Т гена IL-4 и миссенс-варианта Argl30Gln гена IL-13, с Б А, АтД и атопией, определяемой по кожным аллерготестам [84, 92, 150,201,240,266,270,307].
Еще более интересные результаты получены при анализе ассоциации атопии с полиморфизмом генов рецепторов ИЛ, которые осуществляют трансмиссию сигналов этих лигандов в клетки-мишени. Исследователи установили статистически значимую ассоциацию аллеля Arg551 с атопией и представили возможный механизм для ее объяснения [155]. В противоречии с данными G. К. К. Hershey et al. [1999] было показано, что аллель Arg551 ассоциирован с пониженной концентрацией IgE [155, 190, 200]. При исследовании Ile50Val варианта IL4RA, который в отличие от Gln551Arg локализован в экстраклеточном домене рецептора, у японцев показано, что вариант Ие50 ассоциирован с атопической Б А и с повышением уровня общего и специфичного к аллергенам домашней пыли IgE [220, 221].
В НИИ медицинской генетики совместно с Сибирским Государственным Медицинским Университетом (СибГМУ) были проведены работы по генетике БА и атопии, посвященные изучению полиморфизма генов интерлейкиновых лигандов и рецепторов [60, 74]. Было изучено восемь SNP шести генов ИЛ (IL-4, IL-5, IL-9, IL4RA, IL5RA, IL5RB) в родословных с семейным накоплением атопической БА и впервые в мире установлена ассоциация полиморфизма -703С/Т гена IL-5 с этим заболеванием [73].
Клинические особенности пациентов с делецией 2282del4 и мутацией R501X в гене филаггрина при атопическом дерматите
Всего было обследовано 143 пациента с АтД в возрасте от 9 до 47 лет. Средний возраст был 23,8±8,7. Из них 98 женщин (68%) и 45 мужчин (32%) (табл. 4).
После проведенного генотипирования наличие мутаций 2282del4 и R501X в гене филаггрина было обнаружено у 17 человек, что в процентном отношении соответствует 11,8% (рис. 8)
При разделении выборки по полу частота мутаций среди женщин сильно превалировала над частотой среди мужчин и составила 94%, а среди мужчин - 6% (табл. 5).
В выборке пациентов с мутациями в гене филаггрина встречались разные генотипические варианты: гетерозиготы и гомозиготы по делеции 2282del4 и по мутации R501X, а также компаунд-гетерозиготы по двум мутациям (табл. 6).
Из 143 больных с АтД 13 человек оказались гетерозиготными носителями делеции (9,1 %) и 2 человека - гомозиготы по делеции 2282del4 (1,4 %). Общее количество пациентов с данной мутацией составило 15 человек (10,5%). Представителями этой группы оказались только женщины (100%) (табл. 7)
Из 143 обследованных 3 пациента были гетерозиготами по мутации R501X (2,1 %) и 1 пациент (0,7%) - гомозиготой. Общее число больных по данной мутации составило 4 человека (2,8%). Одна из гетерозигот была представителем мужского пола (табл. 8).
Распределение частот делеции 2282del4 и мутации R501X в выборке обследуемых больных АтД г. Томска и среди больных АтД в Западной Европе показано на рис. 9 и 10 [313].
Для проведения анализа клинико-анамнестических данных все пациенты были поделены на две группы. Основная группа была представлена пациентами с мутациями в гене филаггрина (2282del4 и/или R501X) при АтД. В группу сравнения вошли пациенты с АтД без мутаций в гене филаггрина.
Средний возраст пациентов основной группы составил 22,4±4,2 года. В данной группе продолжительность АтД варьировала от 12 до 29 лет, средний показатель был 20,9±4,1 года. У большинства пациентов основной группы дебют АтД приходился на возрастной период до трех лет (88%) (табл. 9).
При анкетировании всех пациентов на выявление факторов, приводящих к обострению заболевания, около 70% обследуемых указали на нарушение диеты, как в основной группе, так и в группе сравнения. Около 60% пациентов группы сравнения связали обострение кожного процесса с эмоциональными переживаниями, а 44% пациентов основной группы отметили ухудшение заболевания при контакте с причиннозначимыми аллергенами. В группе сравнения только 11% больных определили контакт с аллергеном, как провоцирующий фактор (табл. 10).
У 80% представителей основной группы выявлена сезонность заболевания, чаще обострение отмечалось в осенний период года. У пациентов группы сравнения сезонность определялась в 65% случаев, период обострения чаще приходился на осенне-зимнее время года.
При сравнении обследуемых групп пациентов не было отмечено отличий по тенденции развития АтД. Около 40% больных как в основной группе, так и в группе сравнения определили, что течение АтД было стабильное за последние пять лет. Прогрессирование патологического процесса было выявлено у около 40% пациентов в обеих группах. Остальные пациенты из двух групп (около 20%) определили динамику основного заболевания как положительную, т.е. уменьшение площади и тяжести АтД в последнее время.
При анализе первичной медицинской документации у большинства пациентов основной группы (около 65%) было обнаружено документально подтвержденное осложнение основного заболевания в виде присоединения вторичной инфекции в анамнезе заболевания АтД. В группе сравнения документально подтвержденное осложнение АтД встречалось редко - не более чем у 10% больных (табл. 11).
Для определения риска развития осложнения вторичной инфекцией в группе пациентов с мутациями по отношению к группе сравнения был произведен расчет отношения шансов: OR=(a\b)\(c\d) , где а - количество пациентов основной группы с осложнением, b - количество пациентов основной группы без осложнения, с -количество пациентов группы сранения с осложнением, d - количество пациентов группы сравнения без осложнения. OR = (11\6)\(10\116)=21,27 Возможность возникновения вторичного осложнения у пациентов основной группы в 20 раз больше, чем у пациентов группы сравнения.
После проведенного генеалогического анализа было отмечено, что у около 80% пациентов основной группы была выявлена наследственность по атопии (табл.12).
По данным анамнеза у 11 пациентов (65%) основной группы был выявлен документально подтвержденный диагноз сопутсвующей аллергопатологии, КАР выявлялся в большинстве случаев (табл. 13).
Скарификационное аллерготестирование с использованием диагностических аллергенов бьшо проведено у всех пациентов основной группы (п=17) и у 109 больных из группы сравнения, а у остальных пациентов данные были взяты из первичной медицинской документации. В диагностике бьши применены аллергены разных групп: бытовые (аллерген клеща Dermatophagoides pteronissimus и домашней пыли), эпидермальные (аллерген волоса человека, пера подушки, перхоти лошади, шести овцы, шерсти кролика, шерсти морской свинки, шерсти собаки), пыльцевые (микст аллергены пыльцы деревьев, пыльцы сорных трав и подсолнечника, пыльцы луговых трав) и пищевые (аллерген апельсина, говядины, свинины, мяса утки, мяса курицы, белка и желтка куриного яйца, коровьего молока, ржаной и пшеничной муки, трески).
Особенности показателей цитокинов "кожного окна" у пациентов с атопическим дермтаитом с мутациями в гене филаггрина
АтД рассматривается как хроническое аллергическое воспалительное заболевание кожи, триггерами которого являются аллергены, но воспалительный процесс в коже запускается, поддерживается и заканчивается благодаря цитокинам [7, 25, 32, 47, 65, 68].
Развитие аллергического воспаления при АтД связано с нарушением баланса иммунорегуляторных лимфоцитов Thl/Th2 с преобладанием Т1і2-клеток и секрецией соответствующих цитокинов, в частности EL-4 [7, 25, 35, 31, 46, 48, 65, 78, 198, 215, 319]. На фоне повышенной активности Тп2-клеток происходит угнетение функциональной активности ТЫ-лимфоцитов и снижение продукции ими IFN-y [24, 30, 31, 35, 46, 59, 64, 65, 68, 142].
Полноценными участниками в аллергическом воспалении являются и другие цитокины, способные активно влиять на формирование и течение АтД. Сравнительно недавно открыты ТЫ 7- и Тп22-субпопуляции лимфоцитов, продуцирующие соответственно цитокины IL-17 и IL-22, чья роль в патогенезе атопических заболеваний остается до конца не изученной [109, 123, 181, 308].
Большинство цитокинов обладают короткодистантным механизмом действия [32, 65, 76, 199]. Соответственно, изучение цитокинов при АтД на системном уровне не всегда отражает истинную картину происходящего, что определяет актуальность их изучения на локальном уровне — в коже.
Особый интерес представляет изучение цитокинового профиля атопического воспаления на локальном уровне у пациентов с АтД при наследственно обусловленных патологиях белка филаггрина. Филаггрин представляет собой ключевой белок, который участвует в конечной дифференцировке эпидермиса и образовании кожного барьера [132, 273, 279]. У пациентов с мутациями в гене, кодирующем филаггрин, происходит нарушение барьерной функции кожи, которое облегчает поступление аллергена в организм через кожу (эпикутанная сенсибилизация), запуск и поддержание аллергического воспаления в коже [89, 91, 98, 152, 188, 212, 216, 217, 228, 252, 272, 293, 311, 313].
По данным зарубежной литературы выявлены некоторые особенности иммунного ответа при нарушении синтеза белка филаггрина у пациентов при АтД [163, 247]. Однако, особенности цитокиновой продукции у этих пациентов мало изучены, что делает актуальным наше исследование.
На первом этапе научной работы проводился сравнительный анализ цитокинов «кожного окна» в стадии ремиссии АтД. Основную группу составили пациенты с АтД с мутациями в гене филаггрина. В группу сравнения вошли пациенты с АтД в стадию ремиссии без мутаций в гене филаггрина. Группа контроля была представлена здоровыми донорами-добровольцами.
В таблице 25 представлены данные по содержанию IL-4, IFN-y, IL-10 и IL-17 в кожном экссудате в периоде ремиссии АтД.
Из данных, приведенных в табл. 25 видно, что содержание IL-4 в экссудатах «кожного окна» в период ремиссии составило 1,0 (0,6-1,2) пг/мл в основной группе и 0,8 (0,4-0,97) пг/мл в группе сравнения, что достоверно (р 0,05) выше (в 2 раза) уровня контрольной группы. В контрольной выборке уровень данного цитокина был 0,45 (0,4-0,7) пг/мл. Показатель IL-4 в период ремиссии у пациентов с мутациями в гене филаггрина оказался достоверно выше (р 0,05), чем в группе сравнения.
В отношении IFN-y отмечалось достоверное снижение (р 0,05) уровня данного цитокина в период ремиссии в основной группе по отношению к контролю, и составило 11 (8 - 21) пг/мл и 46 (35,5-51,75) пг/мл соответственно. В группе сравнения в период ремиссии концентрация IFN-y также была достоверно ниже (р 0,05) показателей контрольной группы. В период ремиссии показатель IFN-y у пациентов с мутациями в гене филаггрина (основная группа) был ниже, чем в группе сравнения, но достоверность различий между двумя сравниваемыми группами не было выявлено.
Низкий уровень IFN-y совпадает с высоким уровнем IL-4 в период ремиссии, что указывает на развитие дисбаланса Thl/Th2 в сторону избыточной активации Th2-клеток [6, 7, 31, 35, 46, 64, 65, 68, 142, 198, 199]. Данный факт может свидетельствовать о том, что у пациентов в стадии ремиссии АтД даже при наличии клинической ремиссии в коже присутствует резидуальная воспалительная активность, регулируемая Тп2-лимфоцитами. Кроме того, инициация вторичного иммунного ответа у данных пациентов будет протекать на фоне исходно измененного баланса Thl/Th 2.
В период ремиссии у пациентов с мутациями в гене филаггрина было выявлено достоверное повышение (р 0,05) показателя IL-4 по отношению к пациентам без мутаций в гене, кодирующем белок филаггрин (группа сравнения). Вероятно, это можно объяснить повышенной антигенной нагрузкой, связанной с нарушением барьерной функцией кожи при дефектах синтеза белка филаггрина, и, как следствие, постоянной готовностью организма к активации иммунного ответа на поступающий аллерген [163]. Как видно из табл. 25, у здоровых лиц колебания IL-10 были 3,5-13,5 пг/мл с медианой 7 пг/мл. У пациентов основной группы уровень данного цитокина в период ремиссии достоверно превышал (р 0,05) аналогичные показатели в контроле в 4 раза, и его содержание составило 31,5 (12,5 - 45,3) пг/мл. Достоверное повышение IL-10 (р 0,05) в период ремиссии по отношению к контролю было выявлено и у пациентов группы сравнения - 27 (20 - 35) пг/мл. Концентрация IL-10 в стадию ремиссии у пациентов с мутациями в гене филаггрина была выше, чем в группе сравнения, однако, достоверных различий между двумя сравниваемыми группами не обнаружено.
Показатель IL-10 у пациентов двух обследуемых групп в период ремиссии при АтД значительно превышает контрольные цифры. Известно, что IL-10 продуцируется другой иммунорегуляторной субпопуляцией Т-клеток — Trl, а также дендритными клетками, ТЪ2-лимфоцитами и др [192, 223, 227]. Можно предположить, что Trl могут препятствовать развитию АтД на различных патогенетических этапах, включая сенсибилизацию, ремоделирование и персистенцию аллергического воспаления [93, 219, 223, 227, 263, 265, 291, 316]. Таким образом, IL-10, как противовоспалительный цитокин, супрессируя продукцию провоспалительных цитокинов и антигенпредставляющую функцию дендритных клеток, вероятно, является одним из факторов стабилизации ремиссии болезни [120, 223, 265].
Концентрация IL-17 в основной группе в период ремиссии составила 32 (29,25-41,25) пг/мл, что было достоверно выше аналогичного показателя в группе сравнения - 24 (13,5 - 36,7) и достоверно выше уровня IL-17 в контрольной группе - 23 (7,75 -34,55) пг/мл.
Повышение IL-17 в экссудате «кожного окна» у пациентов с мутациями в гене филаггрина при АтД, возможно, связана с нарушением кожного барьера. Следствием этого является колонизация кожи золотистым стафилококком, грибковой инфекцией, которая способствует активации Тп17-клеток, продуцирующих IL-17. Клинически это подтверждается более частыми гнойничковыми инфекциями кожи в анамнезе у данной группы пациентов с АтД. Кроме того, высокий уровень IL-17 на фоне дефекта синтеза белка филаггрина по данным литературы определяет темпы хронизации кожного процесса, приводящие к ремоделированию кожи [247]. На втором этапе исследования были проанализированы данные по содержанию цитокинов «кожного окна» у пациентов в стадии обострения АтД. При этом каждая группа была поделена на 3 подгруппы в зависимости от степени тяжести заболевания с учетом индекса SCORAD. Полученные результаты сравнивались с предыдущими показателями, которые были выявлены у тех же пациентов в стадию ремиссии АтД (табл. 26).
По результатам полученных данных при легкой степени тяжести АтД в период обострения в двух сравниваемых группах концентрация IL-4 была ниже, чем в ремиссию и составила 0,5 пг/мл, что было не намного выше уровня контроля. Достоверности между полученными данными не выявлено.
При утяжелении кожного процесса уровень IL-4 по сравнению с группой контроля увеличился (р 0,05) в 2 раза и составил в основной группе 1,0 пг/мл и 0,95 пг/мл, в группе сравнения - 0,95 пг/мл и 1,0 пг/мл, соответственно средней и тяжелой степеням тяжести АтД. Повышение уровня IL-4 в период обострения можно объяснить тем, что этот цитокин относится к основным пусковым медиаторам атопического воспаления, регулируемого Th2-клетками и выполняет ключевую роль в продукции IgE [35, 48, 65, 78, 198, 319]. При корреляционном анализе была выявлена сильная положительная связь между показателем индекса SCORAD и уровнем IL-4 в период обострения у пациентов с мутациями в гене филаггрина при АтД (г=0,88, р 0,05). Как видно из полученных данных, динамика локальной секреции IL-4 отражала степень тяжести заболевания.
Особенности количественного состава макрофагов в дерме у пациентов с мутациями в гене филаггрина при атопическом дерматите
Поскольку в патогенезе АтД лежат воспалительные явления в коже, существенное значение придается оценке состояния иммунокомпетентных структур и обусловленных ими патогистологических изменений в дерме при АтД. Нарушение кожного барьера у пациентов с мутациями в гене филаггрина сопровождается постоянным проникновением антигенов через кожу и, как следствие, длительными воспалительными процессами в коже. В результате кожа подвергается тканевому ремоделированию, т.е. происходят такие изменения, которые обусловливают нарушения ее функциональных и морфологических свойств [34, 46, 199, 262, 303]. Клеточная характеристика инфильтрата при ремоделировании в дерме представлена в основном макрофагами [34, 46, 199, 262, 303].
Представляет научный интерес исследование количества макрофагов в клеточном инфильтрате дермы с применением маркеров моноцитарно-макрофагального ряда (CD68+) для определения морфо-функциональных изменений в коже больных АтД с мутациями в гене филаггрина.
В рамках исследования был использован иммуногистохимический анализ срезов кожи, в котором выявлялись клеточные элементы, экспрессирующие CD68. Подсчет данных клеток проводился в 1 мм дермы. В основную группу вошли пациенты с мутациями в гене филаггрина при АтД. Группу сравнения составили пациенты без мутаций в гене филаггрина при АтД. Исследования двух групп пациентов проводились в периоды обострения и ремиссии АтД. Контрольная группа была представлена здоровыми донорами-добровольцами (табл. 29 и рис. 16).
Как видно из табл 29, количество CD68 положительных клеток в дерме у пациентов из основной группы в стадию обострения АтД было 6,8 (5,4 - 11,1) клеток в 1мм, что достоверно (р 0,05) выше показателя контрольной группы, составляющего 1,7 (0 - 2,6) клеток в 1мм2, и выше группы сравнения - 3,8 (2,2 - 8,0) клеток в 1 мм2. Достоверных различий между основной группой и группой сравнения по этому показателю не было выявлено (р 0,05).
Число CD68+ клеток в клеточном инфильтрате дермы у пациентов с мутациями в гене филаггрина в период ремиссии АтД продолжало повышаться до 17,5 (9,35 -24,5) клеток в 1мм , что было достоверно (р 0,05) выше уровня контрольных величин. В группе сравнения данный показатель имел сходную динамику и составил 11,8 (4,4 - 14,85) клеток в 1 мм , что меньше количества макрофагов в дерме у пациентов из основной группы. Достоверности данных различий в двух группах не отмечалась (р 0,05).
По результатам проведенного исследования можно отметить тенденцию к более повышенному содержанию клеток, экспрессирующих CD68, у пациентов из основной группы, как в период обострения, так и в период ремиссии.
Патогенетическая сущность АтД заключается в атопическом воспалении кожи, интенсивность которого варьирует от выраженного в период обострения до минимального в период ремиссии, а также процессах ремоделирования кожи [34, 46, 47 199, 262]. Возможно, повышенная проницаемость кожи, наблюдаемая у пациентов с мутациями в гене филаггрина, сопровождается более выраженными воспалительными процессами в коже, что находит отражение в более высоких показателях распределения CD68+ клеток. Таким образом, клеточная картина инфильтрата при ремоделировании в эпидермисе представлена увеличением количества КЛ, а в дерме - повышением макрофагов.
Резюме. При АтД в периоды обострения и ремиссии отмечается повышение CD68+ клеток (макрофагов) в дерме по сравнению со здоровыми лицами. У пациентов с мутациями в гене филаггрина отмечается тенденция к увеличению CD68+ клеток по отношению к больным с АтД из группы сравнения.
