Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Клинико-патогенетическая характеристика клещевого энцефалита
1.1. Краткая молекулярно-генетическая характеристика флавивирусов .
1.2. Клинико-патогенетические особенности клещевого энцефалита...
Глава 2. Современные представления о врожденных и адаптивных факторах иммунитета при флавивирусных инфекциях
2.1. Роль факторов врожденного иммунитета при флавивирусных инфекциях .
2.2. Роль факторов адаптивного иммунитета при флавивирусных инфекциях .
2.3. Формирование врожденного и адаптивного иммунного ответа под влиянием флавивирусных вакцин
Глава 3. Современные средства этиотропной терапии при флавивирусных инфекциях
3.1. Противовирусные препараты, обладающие прямым этиотропным действием (химиопрепараты и интерфероны) .
3.2. Препараты, обладающие иммуномодулирующими и противовирусными свойствами
3.3.Иммуномодуляторы природного происхождения
Собственные исследования
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Материалы исследования .
4.2. Методы исследования .
Глава 5. Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с антигенемией вируса клещевого энцефалита
5.1. Характеристика уровня антигенемии у пациентов с антигенемией вируса КЭ
5.2. Оценка состояния иммунной системы пациентов с разным уровнем антигенемии вируса КЭ
5.2.1 Характеристика состояния клеточного иммунитета у пациентов с антигенемией ВКЭ .
5.2.2 Характеристика состояния гуморального иммунитета у пациентов с антигенемией ВКЭ .
5.2.3 Цитокиновый статус у пациентов с антигенемией ВКЭ .
Глава 6. Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания
6.1 Характеристика состояния клеточного иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ .
6.2 Характеристика состояния гуморального иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ .
6.3 Цитокиновый статус у пациентов с манифестными формами КЭ
Глава 7. Особенности взаимодействия дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита с клетками иммунной системы ex vivo, in vitro и in vivo
7.1 Динамика экспрессии адгезионных и активационных маркеров на клетках крови ex vivo под влиянием штаммов вируса КЭ .
7.1.1 Динамика накопления штаммов вируса КЭ в пробах цельной крови доноров
7.1.2 Влияние штаммов вируса КЭ на экспрессию молекул адгезии и активационного маркера CD69 клетками врожденного иммунитета .
7.1.3 Влияние штаммов вируса КЭ на экспрессию активационных молекул Т-лимфоцитами и NK-клетками периферической крови человека..
7.2 Динамика продукции цитокинов лейкоцитами крови in vitro под влиянием штаммов вируса КЭ с разной биологической характеристикой
7.2.1 Динамика накопления штаммов вируса КЭ в супернатантах культуры мононуклеарных клеток человека
7.2.2 Влияние штаммов ВКЭ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками крови in vitro .
7.2.3 Влияние штаммов ВКЭ на продукцию интерферонов I и II типов мононуклеарными клетками крови in vitro
7.3 Продукция цитокинов у мышей линии BALB/c, инфицированных разными штаммами вируса КЭ .
7.3.1 Сравнение биологических свойств штаммов вируса КЭ при инфицировании мышей линии BALB/c (вирулентность, репродукция в крови и мозге) .
7.3.2 Динамика продукции цитокинов (TNF-, IL-6, IL-10, IFN-) в крови и мозге мышей BALB/с, инфицированных штаммами вируса КЭ
Глава 8. Изучение противовирусной активности биологически активных веществ морских гидробионтов при экспериментальном клещевом энцефалите
8.1 Изучение активности люромарина и тинростима in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита .
8.2 Изучение активности люромарина и тинростима при экспериментальном клещевом энцефалите .
Заключение
Выводы .
Список литературы
- Клинико-патогенетические особенности клещевого энцефалита...
- Роль факторов адаптивного иммунитета при флавивирусных инфекциях
- Препараты, обладающие иммуномодулирующими и противовирусными свойствами
- Характеристика состояния клеточного иммунитета у пациентов с антигенемией ВКЭ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Многолетнее изучение клещевого энцефалита (КЭ) позволило решить целый ряд фундаментальных вопросов этой патологии. Установлены этиология и основы патогенеза, описаны клинические проявления заболевания, разработаны методы диагностики и лечения, внедрен ряд профилактических мероприятий. Однако до сих пор эта нейроинфекция остается одной из самых актуальных природно-очаговых вирусных инфекций на Евразийском континенте (Злобин В.И., 2010; Погодина В.В., 2010; Ястребов В.К., 2012; Lindquist L. et al., 2008; Weidmann M. et al., 2011).
Несмотря на проводимые санитарно-противоэпидемические мероприятия и на снижение уровня заболеваемости, наблюдаемое с начала XXI века, количество ежегодно регистрируемых случаев заболевания КЭ в Российской Федерации (РФ) остается высоким. Расширяется нозоареал инфекции, увеличивается число случаев КЭ среди городского населения, остаются высокими инвалидизация переболевших и число летальных исходов (Роспотребнадзор по РФ, 2013). В Приморском крае за последние пять лет (2008 – 2012 гг.) уровень заболеваемости КЭ находился в пределах общероссийских показателей – от 1,5 до 2,9 на 100 тыс. населения (Роспотребнадзор по Приморскому краю, 2013), однако показатели летальности в Приморском крае в 2012г. (3,4%) в 2,4 раза превышали таковые по РФ (1,4%). Летальные случаи при КЭ в Приморском крае регистрируются ежегодно и составляют от 3,4% до 15,9%. Необходимо отметить наличие заболеваемости КЭ у лиц, ранее привитых от этой инфекции: в РФ уровень заболеваемости населения, вакцинированного от КЭ, в 2012 г. составлял 3,9%, в Приморском крае – 3,4 % (Роспотребнадзор по Приморскому краю, 2013).
В последнее десятилетие в Приморском крае, как и в целом по РФ, наблюдается изменение клинической картины КЭ, связанное с преобладанием лихорадочных и инаппарантных форм этой инфекции. В 2012 г. число заболевших лихорадочной формой КЭ в крае составило 58,6%, инаппарантной - 17,2%, менингеальной – 13,8%, очаговой – 10,3% (Роспотребнадзор по Приморскому краю, 2013). Кроме того, следует отметить чёткую тенденцию к увеличению случаев длительной персистенции антигена вируса КЭ, выраженность клинических проявлений которой может варьировать от бессимптомного носительства до манифестации процесса (Насырова Р.Ф. и др., 2006; Зима А.П., 2008; Удинцева И.Н., 2010).
Известно, что клинический полиморфизм заболевания и исход патологического процесса во многом обусловлен иммуноопосредованными механизмами, играющими существенную роль в патогенезе инфекции (Ратникова Л.И. и др., 2002; Tigabu B. et al., 2009; Ruzek D. et al., 2010, 2011). Однако, несмотря на проводимые исследования, функциональное состояние врожденного и адаптивного иммунитета на начальном этапе развития различных вариантов инфекционного процесса, вызванного вирусом КЭ, остается недостаточно изученным. Практически не исследованы особенности функционирования иммунной системы вакцинированных пациентов при инфицировании и заболевании КЭ.
Большинство авторов, описывающих явление клинического полиморфизма КЭ, связывают его с генотипической и фенотипической вариабельностью региональных популяций вируса КЭ (Злобин В.И. и др., 2003; Погодина В.В. и др., 2007; Леонова Г.Н., 2007; Карганова Г.Г., 2009). К началу выполнения настоящей работы отсутствовали данные о взаимодействии штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа с рецепторным аппаратом клеток врожденного и адаптивного иммунитета, не было сведений о влиянии этих штаммов на динамику продукции цитокинов. Это обусловило необходимость изучения способности штаммов вируса КЭ к модуляции иммунокомпетентных клеток на начальных этапах инфицирования и их влияния на последующее развитие инфекционного процесса.
Основными нерешенными проблемами этиотропной терапии КЭ в современных условиях являются ее недостаточная эффективность и вероятность развития побочных эффектов (Иерусалимский А.П., 2001; Жукова Н.Г., 2002; Скрипченко Н.В. и др., 2005; Конькова-Рейдман А.Б., 2009). В этой связи, поиск препаратов, которые бы не только ингибировали репликацию вируса и элиминировали его из организма, но и корригировали индуцированное вирусом иммунодефицитное состояние, остается актуальным.
В настоящее время интерес ученых направлен на освоение и изучение морских гидробионтов в качестве источников получения новых биологически активных веществ. Среди природных морских биополимеров несомненный интерес представляют тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister, и люромарин – полифенольный комплекс, выделенный из морских трав семейства Zosteraceae. Эти биополимеры обладают широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами (Беседнова Н.Н., 2004; Эпштейн Л.М. и др., 2004; Запорожец Т.С., 2007; Попов А.М. и др., 2009; Кривошапко О.Н., 2012), что явилось основанием для изучения эффективности люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ и для обоснования возможности их применения в комплексной терапии КЭ.
Вышеизложенное определяет актуальность и необходимость изучения иммунных механизмов начального этапа инфекционного процесса, обусловленного штаммами вируса КЭ, что создает предпосылки для разработки иммунологических подходов к ранней диагностике, прогнозу, лечению и профилактике заболевания.
Цель исследования: изучить клеточные и молекулярные иммуноопосредованные механизмы начального этапа инфекционного процесса, индуцированного штаммами дальневосточного субтипа вируса КЭ и установить роль этих механизмов в последующем формировании противовирусной защиты.
Задачи исследования:
1. Определить варианты развития инфекционного процесса у пациентов с КЭ на эндемичной территории Приморского края Дальнего Востока.
2. Дать комплексную оценку состояния врожденного и адаптивного иммунитета у вакцинированных и невакцинированных пациентов на ранней стадии инфицирования вирусом КЭ и установить иммунологические маркеры риска, предопределяющие длительную персистенцию возбудителя в организме;
3. Провести сравнительное изучение факторов клеточной и гуморальной защиты у привитых и непривитых пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде инфекционного процесса и определить иммунопатогенетические критерии тяжести течения и исхода заболевания;
4. Исследовать в экспериментах (ex vivo, in vitro и in vivo) процесс взаимодействия штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа с разной молекулярно-генетической характеристикой и биологическими свойствами с иммунокомпетентными клетками, используя в качестве критериев оценки экспрессию адгезивных и активационных молекул на поверхности клеток врожденного и адаптивного иммунитета;
5. Изучить на культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров, а также в крови и мозге мышей линии BALB/c инфекционный потенциал и цитокин-индуцирующую способность разных штаммов ВКЭ;
6. Дать сравнительную оценку эффективности некоторых официнальных препаратов и новых биологически активных веществ из морских гидробионтов (люромарин, тинростим) по отношению к вирусу КЭ на экспериментальных моделях in vitro и in vivo.
Научная новизна исследования
На основе комплекса полученных данных существенно расширена концепция иммунопатогенеза КЭ. Представлены данные о роли клеточно-молекулярных иммуноопосредованных механизмов начального этапа инфекционного процесса, индуцированного штаммами вируса КЭ дальневосточного субтипа, и последующего развития и исхода вирусной инфекции.
На раннем этапе инфекционного процесса у пациентов с антигенемией ВКЭ выявлены различия в механизмах элиминации патогена, связанные с величиной антигенной нагрузки и особенностями активации иммунной системы. Установлено, что у невакцинированных пациентов с невысоким уровнем антигенемии ВКЭ происходит активация ключевых эффекторов врожденного иммунитета (NK-, NKT-клеток, IFN), обусловливающая быструю элиминацию патогена, тогда как отсутствие их активации и более высокий уровень антигенемии приводит к длительной персистенции возбудителя.
В остром периоде заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ (лихорадочная, очаговые) выявлены значимые различия в субпопуляционном составе лимфоцитов, степени активации гуморального иммунитета, изменениях цитокинового профиля. Установлены иммунологические критерии, предопределяющие тяжелое течение КЭ: доминирование гуморального иммунного ответа по Th2 типу и снижение количества Т- и NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности.
Показано, что у лиц, ранее вакцинированных против КЭ, различное течение инфекционного процесса (быстрая или замедленная элиминация антигена ВКЭ, или легкое течение лихорадочной формы КЭ) определяется разной эффективностью поствакцинального вирусспецифического иммунного ответа и степенью активации эффекторной фазы адаптивного иммунитета, индуцированной вирусом.
Установлено, что штаммы вируса КЭ, изолированные от пациентов с разными клиническими формами заболевания, в экспериментах ex vivo, in vitro, in vivo проявляют различные биологические свойства (вирулентность, скорость репродукции, нейроинвазивность). Способность штаммов разнонаправленно модулировать ранние этапы активации иммунокомпетентных клеток (экспрессию молекул CD11b, ICAM-1, CD69, CD25, CD95) и последующую продукцию цитокинов (IL-8, IFN, TNF, IFN, IL-6 и IL-10) оказывает существенное влияние на разнообразие течения и исходов инфекционного процесса.
В экспериментах установлена вирусингибирующая и протективная активность в отношении вируса КЭ биополимеров из морских гидробионтов - люромарина и тинростима, обладающих широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами. Их комбинированное применение с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном) усиливает протективный эффект, что свидетельствует о перспективности использования такой терапии при КЭ.
Практическая значимость работы
Полученные данные о начальных этапах иммунной защиты против вируса КЭ позволяют расширить стратегию прогнозирования течения и исхода инфекционного процесса с целью своевременного проведения патогенетически обоснованной терапии иммунных нарушений.
Выявлены иммунологические критерии, позволяющие прогнозировать: на ранней стадии инфекционного процесса у пациентов с антигенемией ВКЭ - замедленную элиминацию возбудителя, а в острой фазе заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ - тяжесть течения и исход вирусной инфекции.
Показано, что наличие высокого уровня вирусспецифического иммунного ответа, обусловленного вакцинацией, является важным фактором, способным предотвратить заболевание КЭ, обеспечить быструю элиминацию вируса или легкое течение этой нейроинфекции.
Полученные данные о различной способности штаммов ВКЭ модулировать рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток и продукцию этими клетками цитокинов не только расширяют знания о патогенезе при разных формах КЭ с учетом гетерогенности популяции, но и открывают перспективы для новых эффективных подходов в терапии данного заболевания. Моделирование ex vivo взаимодействия штаммов ВКЭ с рецепторным аппаратом иммунокомпетентных клеток может быть использовано как при изучении функциональной активности клеток, участвующих в инфекционном процессе, так и для направленного поиска терапевтических средств, влияющих на инфицированные вирусом клетки-мишени. Возможность динамического мониторинга функционального состояния иммунокомпетентных клеток, инфицированных ex vivo, может быть использована и при других вирусных инфекциях.
В экспериментах in vitro и in vivo показана перспективность использования в комбинированной терапии КЭ биополимеров из морских гидробионтов - люромарина и тинростима, обладающих противовирусной активностью в отношении ВКЭ, а также иммуномодулирующими свойствами, что позволяет сочетать этиотропное и патогенетическое лечение данной вирусной инфекции.
Основные положения, выносимые на защиту
1. На ранней стадии инфекционного процесса у пациентов, невакцинированных и вакцинированных против КЭ, выявлены различия в функциональной активности эффекторной фазы врожденного иммунитета: невысокая антигенная нагрузка и активации клеточных и гуморальных факторов врожденного иммунитета способствует быстрой элиминации вируса; высокий уровень антигенемии и отсутствие активации врожденного иммунитета являются предикторами длительной персистенции вируса.
2. При манифестных формах КЭ в остром периоде заболевания умеренная активация клеточного, гуморального и цитокинового иммунного ответа у невакцинированных, а также вакцинированных против КЭ пациентов предопределяет развитие более легкого течения заболевания. Иммунопатогенетическими предикторами развития тяжелого течения КЭ являются: снижение содержания CD3+-, CD4+-Т-лимфоцитов, NK-клеток, иммуноглобулинов (IgG1, IgG3) и повышение количества В-лимфоцитов, увеличение концентраций цитокинов (IL-4, IL-10) и высокий уровень вирусспецифических IgM.
3. Штаммы вируса КЭ, изолированные от больных с разными клиническими формами инфекции, в зависимости от молекулярно-генетической характеристики и биологических свойств разнонаправлено модулируют рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток и продукцию цитокинов. Высоковирулентный штамм ex vivo снижает экспрессию адгезивных (CD11b и ICAM-1) и активационных (CD69, CD25, CD95) молекул на клетках врожденного и адаптивного иммунитета и in vivo индуцирует высокий уровень системного и локального цитокинового ответа (TNF, IL-6, IFN). Слабовирулентные штаммы ex vivo усиливают экспрессию молекул адгезии и активации и in vivo стимулируют высокий уровень продукции IL-10.
4. Биополимеры из морских гидробионтов - люромарин и тинростим с широким спектром биологического действия и иммуномодулирующими свойствами, проявляют in vitro и in vivo вирусингибирующую и протективную активность в отношении вируса КЭ. Экспериментально обоснована эффективность использования этих иммуномодуляторов в комплексной терапии КЭ.
Личный вклад автора
Автором разработан дизайн исследования, проведено изучение иммунного и цитокинового статуса пациентов, выполнены экспериментальные исследования, проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов, подготовлены публикации по теме диссертации.
Апробация материалов диссертации
Основные положения и результаты работы были представлены на межрегиональной конференции с международным участием «Вакцинопрофилактика: проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003), 4-ой межгосударственной научно-практической конференции государств -участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), 6-ом конгрессе Северо-Балтийских стран по инфекционным болезням (Паланга, Литва, 2004), конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004), 4-ой научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 2004), международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Таиланд, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке» (Томск, 2006), X Международном симпозиуме по клещевым заболеваниям (Вена, 2009), III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011), XV Международном конгрессе по вирусологии (Саппоро, 2011), Всероссийских форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2006, 2007, 2008, 2009), юбилейных конференциях, посвященных 75-летию открытия клещевого энцефалита (Иркутск, 2012; Хабаровск, 2012; Москва, 2013).
Апробация диссертации состоялась 22 октября 2013 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» и 10 декабря на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, в том числе 29 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских диссертаций, 2 монографии, получено 3 патента на изобретение.
Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ «Молекулярно-генетическая, биологическая и патогенетическая характеристика популяции вируса клещевого энцефалита» (№ 4006 2010-2012 гг.).
Объем и структура диссертационной работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 497 источников, из которых 175 работ отечественных и 322 - зарубежных авторов. Работа изложена на 271 странице машинописного текста и иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками.
Клинико-патогенетические особенности клещевого энцефалита...
Согласно последней таксономической классификации, род Flavivirus семейства Flaviviridae включает более 70 вирусов. Большинство представителей данного рода относят к группе арбовирусов, т.е. их жизненный цикл включает стадию репликации в организме кровососущих членистоногих. Около 40 флавивирусов передаётся через укусы комаров, 16 - укусы клещей, а для оставшихся представителей рода переносчик неизвестен [369]. Все вирусы данного семейства имеют схожие антигенные характеристики, но на основании типирования поликлональными гипериммунными сыворотками, среди флавивирусов выделяют 4 главных серокомплекса: Денге, клещевой энцефалит, жёлтая лихорадка и японский энцефалит [299]. Данные возбудители вызывают у человека широкий спектр заболеваний, включающий лихорадку, лихорадку с геморрагическими проявлениями и энцефалит. На сегодняшний день флавивирусы продолжают оставаться самыми значимыми для мирового здравоохранения возбудителями эмерджентных инфекций. В первую очередь это касается возбудителей лихорадки Денге (DENV), японского энцефалита (JEV) и жёлтой лихорадки (YFV). Другие представители флавивирусов, такие как вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) и лихорадки Западного Нила (WNV), представляют проблему для эндемичных регионов.
Краткая молекулярно-генетическая характеристика флавивирусов Все флавивирусы имеют сходное строение вириона, организацию генома, стратегию репликации, но вызывают различную патологическую реакцию инфицированного организма [360]. Флавивирусы - небольшие оболочечные частицы сферической формы (40-60 нм), содержащие нуклеокапсид (25-30 нм). Нуклеокапсид состоит из множества копий капсидного белка С и молекулы РНК, окружён липидной мембраной, в которую включены два вирусных белка: маленький мембранный белок М и большой белок оболочки Е [360]. Геном флавивирусов представляет собой одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности около 11 тыс. нуклеотидов [112, 371]. РНК содержит одну открытую рамку считывания, которую окружают с обеих сторон короткие нетранслируемые регионы: 5 - и 3 [454]. В геноме ближе к 5 -концу закодированы структурные белки, С, ргМ и Е, ближе к 3 -концу расположены гены неструктурных белков: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 [360]. Флавивирусы проникают в клетку-мишень после взаимодействия оболочечного белка Е c рецепторами клетки путем клатрин-опосредованного эндоцитоза [234]. Низкий уровень рН в эндосомах инициирует слияние вирусной и клеточной мембран, опосредованное структурной перестройкой белка Е, что приводит к выходу в цитоплазму нуклеокапсида с вирусной РНК [396]. В результате трансляции образуется полипротеин, который подвергается ко- и посттрансляционному процессингу, в котором участвуют вирусная NS2b-NS3 протеаза, а также протеаза клетки – сигналаза. Процессинг приводит к образованию структурных и неструктурных вирусных белков [275]. Сборка вирусных частиц происходит в просвете эндоплазматического ретикулума и дальнейшее созревание этих вирусных частиц происходит в сети транс-Гольджи, где предшественник белка М (prM) расщепляется фурином до зрелого белка М, что приводит к конформационной перестройке Е белка [458]. После реорганизации поверхности вириона зрелый инфекционный вирус выходит из клетки [235]. 1.2.Клинико-патогенетические особенности клещевого энцефалита
До сих пор молекулярные основы патогенеза флавивирусных энцефалитов, в том числе и КЭ, остаются не полностью понятными. Все еще продолжают исследовать многие невыясненные аспекты флавивирусной репликации, инвазии этими вирусами центральной нервной системы (ЦНС) и характера иммунного ответа организма.
В то же время многообразные клинические проявления и течение КЭ достаточно полно описаны в классических руководствах по данному заболеванию как отечественными, так и зарубежными авторами [47, 114, 165, 286, 292]. КЭ может протекать в трех формах: острой (лихорадочная, менингеальная и очаговые формы), хронической и бессимптомной (инаппарантной). Наряду с этим, в комплексных клинико-эпидемиологических исследованиях рядом авторов [40, 73, 79, 262, 436, 467] было установлено, что в различных природных очагах клиника КЭ имеет свои отличительные особенности. При сравнительном анализе клинической картины, характера течения и исходов КЭ [101] в 3-х эндемичных зонах РФ (Дальний Восток, Восточная Сибирь и Северо-Западный регион), где доминируют штаммы ВКЭ разных генотипов (дальневосточный, сибирский и западноевропейский соответственно), отмечены существенные различия. Так, на территории Восточно-Сибирского региона, по сравнению с Дальневосточным регионом, заболевание характеризуется более мягким течением, меньшим числом осложнений и низкой летальностью (2,4% - в Приангарье и 24,4% - на Дальнем Востоке). На Северо-Западе РФ (Ленинградская область) преобладает менингеальная форма (60%), очаговые формы встречаются также часто (19%). В то же время такое генетическое распределение штаммов ВКЭ является достаточно условным, так как на разных территориях одновременно циркулируют варианты одного генотипа вируса с разной степенью патогенности, способные вызывать заболевания различной тяжести [109, 115, 141].
Роль факторов адаптивного иммунитета при флавивирусных инфекциях
В индуктивной фазе гуморального иммунного ответа происходит распознавание рецепторами В-клеток (BCR) внеклеточных патогенов в их нативной, нерасщепленной форме. Для активации В-клеток необходима дополнительная стимуляция со стороны Th2-клеток и секретируемых ими цитокинов. Активированные В-клетки пролиферируют и дифференцируются в плазматические (антителообразующие) клетки, секретирующие антитела, и В-клетки-памяти. Цитокины, помимо действия на пролиферацию и дифференцировку В-клеток, способны влиять на процесс переключения изотипа рецептора В-клетки с IgM на другие классы иммуноглобулинов. Так, IL-4 индуцирует экспрессию IgG4 и IgE; IFN отвечает за переключение изотипов на IgG1 и, возможно, на IgG3; IL-6 усиливает синтез IgM и IgG1; IL-10 стимулирует запуск антител практически всех классов [66].
Гуморальный иммунный ответ важен для контролирования флавивирусных инфекций. Большая часть этого контроля обеспечивается нейтрализующими антителами, которые распознают антигенные детерминанты, расположенные преимущественно в вирусном гликопротеине E, основном иммуногене флавивирусов. Эти антитела нейтрализуют инфекционные свойства флавивирусов с высокой эффективностью, главным образом, вмешиваясь в ранние стадии проникновения вируса, в том числе, прикрепление, интернализацию и/или репликацию внутри клеток [163, 243, 445, 446]. Антитела образуются и против многих неструктурных белков флавивирусов, но наибольший интерес представляет белок NS1, который не только продуцируется в инфицированных клетках в сравнительно больших количествах, но и секретируется за пределы зараженной клетки. Было показано, что высокое содержание NS1 в сыворотке крови пациентов, инфицированных DENV, коррелировало с тяжестью заболевания [303]. Установлено, что антитела против NS1 защищают от индуцированных флавивирусами заболеваний [163, 341, 425]. Предполагается, что анти-NS1 антитела могут осуществлять защиту, как через комплемент-опосредованный цитолиз, так и напрямую влиять на снижение титров вируса в инфицированных клетках [197, 351].
Быстрое нарастание нейтрализующего ответа антител представляет собой ключевой фактор выживания при инфекции острыми цитопатическими вирусами [297]. Поскольку для активации CD4+Т-хелперного ответа требуется несколько дней, то быстрая индукция раннего ответа нейтрализующими IgM антителами, независимая от помощи Т-клеток, заполняет этот промежуток. Было показано, что большинство цитопатических вирусов, в том числе и флавивирусы, могут индуцировать независимый от Т-клеток ответ нейтрализующими IgM антителами [65, 129, 319, 449]. Выявление этих вирусспецифических антител класса IgM в крови пациентов является основой для верификации диагноза заболевания. Клинические и экспериментальные данные показали, что быстрое переключение изотипа антител, зависимое от Т-клеток, имеет огромное значение для поддержания высокого защитного уровня антител, необходимого для продолжительного контроля флавивирусных инфекций [163, 263, 319, 355]. Это обусловлено тем, что антитела класса IgG обладают большим сродством к соответствующим антигенным эпитопам, а также более действенны как эффекторные молекулы, чем IgM-антитела. Более высокая функциональная эффективность IgG-антител связана с тем, что к этим антителам на поверхности эффекторных клеток врожденного иммунитета есть рецепторы – FcR, тогда как рецепторы для Fc-части молекулы IgM – отсутствуют [153]. Взаимодействие подклассов IgG (IgG1 - IgG4) с рецепторами Fc запускает эффекторные механизмы иммунной защиты: фагоцитоз, эндоцитоз, опосредованную антителами клеточную цитотоксичность, высвобождение ряда медиаторов воспаления, а также удаление иммунных комплексов. В целом, считают, что противовирусные антитела у человека в основном принадлежат к IgG1 и IgG3 [103].
Однако известно, что нейтрализующие антитела не всегда полностью препятствуют распространению флавивирусов в организме [129, 205, 297]. Так, рядом авторов [65, 163] при КЭ была выявлена длительная циркуляция вирусспецифических IgM-антител и задержка переключения их на синтез IgG- антител, что свидетельствовало о дефекте системы Т-лимфоцитов. Однако, при КЭ, также как и при других флавивирусных инфекциях, существуют, вероятно, и другие механизмы, реализующие уклонение флавивирусов от элиминирующего действия вируснейтрализующих антител и поддерживающие как репликативную, так и персистентную инфекции. Так, флавивирусы могут использовать мутацию вируснейтрализующих детерминант как стратегию, позволяющую избегать распознавания антителами [205, 297]. Наиболее яркий пример этого механизма уклонения демонстрирует HCV. Изменения в гипервариабельной области иммунодоминантного поверхностного вирусного белка E2 развиваются в течение HCV-инфекции и связаны с вирусной персистенцией и снижением эффективного ответа нейтрализующих антител [227, 437]. У других флавивирусов антигенные вариации в E белке также могут иметь отношение к уклонению от гуморального иммунного ответа, поскольку большинство нейтрализующих моноклональных антител связываются с эпитопами в этом регионе. Было показано, что флавивирусы (WNV, DNV, JEV, YFV, ВКЭ) с мутациями в домене III белка Е эффективно избегают нейтрализации антителами [181, 209, 226, 366, 389].
Препараты, обладающие иммуномодулирующими и противовирусными свойствами
При изучении В-клеточного звена иммунитета количество CD3–CD19+-лимфоцитов не изменялось только у невакцинированных пациентов 1-ой группы. У вакцинированных лиц 1-ой группы и пациентов 2-ой и 3-ей групп регистрировалось значимое увеличение относительного содержания и абсолютного количества этих клеток по сравнению с показателями в группе здоровых доноров. Исследование субпопуляций NK- и NKT-клеток, обладающих цитотоксической активностью, показало, что изменения количества этих клеток носили разнонаправленный характер в зависимости от формы заболевания КЭ (табл.8). У пациентов с лихорадочной формой КЭ в остром периоде заболевания относительное содержание и абсолютное количество CD3–CD16+CD56+- и CD3+CD16+CD56+ -лимфоцитов было значимо повышено по сравнению с таковыми показателями у здоровых лиц (p0,05). У пациентов с очаговыми формами заболевания наблюдалось снижение числа этих клеток, наиболее выраженное у лиц 3-ей группы (p0,05). В острый период заболевания у пациентов с лихорадочной формой КЭ выявлялось значимое увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние активационные антигены (CD3+CD25+, HLA-DR+, CD3+CD95+). В то же время у пациентов с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом признаки Т-клеточной активации отсутствовали (p 0,05), с летальным исходом – экспрессия активационных маркеров была снижена (p0,05). Показатели, отражающие соотношение пролиферативных и элиминационных процессов (CD25+/CD95+), у обследованных пациентов различались. Так, у пациентов 1-ой группы это соотношение, будучи выше аналогичного показателя у здоровых доноров, оставалось в пределах нормативных значений (1,0 – 2,0). Снижение показателей этого соотношения при неблагоприятном исходе у больных очаговыми формами КЭ (0,76 – 0,80) свидетельствовало о выраженной вирусиндуцированной супрессии клеточного звена иммунитета этих пациентов.
Установленные в настоящем исследовании изменения в субпопуляционном составе Т-лимфоцитов не только подтверждают наличие Т-клеточного дефицита у невакцинированных пациентов с разными формами КЭ, но и позволяют рассматривать эти изменения как дополнительные лабораторные критерии, указывающие на прогрессирование заболевания. Наиболее важным в плане прогноза течения КЭ является определение изменений относительного содержания и абсолютного количества следующих популяций лимфоцитов: CD3+, CD4+, CD8+, NK, NKT, CD25+, CD95+ (табл.8). Снижение показателей CD4+/CD8+ и CD25+/CD95+ является прогностически неблагоприятным признаком течения заболевания КЭ. 6.2 Характеристика состояния гуморального иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ Для верификации КЭ в остром периоде решающее значение имеет обнаружение в крови больных вирусспецифических антител класса IgM. В наших исследованиях у всех пациентов с лихорадочной формой КЭ в этот период уровень вирусспецифических IgM был невысоким (табл.9). Содержание антител у вакцинированных и невакцинированных пациентов этой группы значимо различалось (1,2±0,3 и 2,0±0,5, p=0,004). Уровень антител класса IgM у пациентов с очаговыми формами КЭ было значимо выше (8,6 ± 1,8 и 8,9±2,1), чем у лиц 1-ой группы (p=0,000). В то же время только у пациентов 1-ой группы, ранее вакцинированных против КЭ, в остром периоде выявлялись вирусспецифические антитела класса IgG и вируснейтрализующие антитела (СГТА составила 45±11) (табл.9).
Примечание: КП (коэффициент позитивности); ИА – индекс авидности антител; ВН – вируснейтрализующие антитела. Значения IgG и ВН представлены в обратных величинах титров антител. - значимость различий между показателями в группе невакцинированных пациентов с очаговыми формами и лихорадочной формой КЭ (p0,05); (U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок).
Исследование содержания общих сывороточных иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) показало, что уровень этих иммуноглобулинов в сыворотке крови пациентов с лихорадочной формой КЭ в острый период заболевания находился в пределах вариабельности нормальных значений (табл.10). Таблица 10
Показатели Единицы измерения Здоровые доноры (n=25) Пациенты с лихорадочной формой КЭ Пациенты с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом (n=16) Пациенты с очаговыми формами КЭ с летальным исходом (n=6)
Примечание: M± – среднее ± стандартное отклонение; Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); p – значимость различий между показателями в группах здоровых и инфицированных ВКЭ пациентов; (U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок).
У пациентов с очаговыми формами КЭ отмечалось значимое повышение уровня IgM по сравнению с таковым у здоровых доноров (p0,05). При этом концентрации общего IgG у пациентов 2-ой и 3-ей групп были ниже аналогичных показателей у здоровых доноров (p0,05). При изучении продукции отдельных подклассов IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) установлено, что у пациентов 1-ой группы содержание IgG1, IgG2 и IgG4 не отличалось от такового у здоровых доноров (табл.10). В то же время у этих пациентов зарегистрировано значимое повышение концентраций IgG3 (p0,05), играющего важную роль в противовирусном иммунитете. Показатели IgG1/IgG3, характеризующие соотношение Th2-зависимых IgG1-антител и Th1-зависимых IgG3-антител, у пациентов 1-ой группы были ниже, чем таковые у здоровых доноров (p0,05), что можно расценить как раннюю поляризацию иммунного ответа в сторону Th1-типа. В этот же период у пациентов 2-ой и 3-ей групп отмечено снижение содержания подклассов IgG1и IgG3 по сравнению с таковыми показателями у здоровых доноров (p0,05), что может рассматриваться как один из критериев, характеризующих тяжесть течения заболевания. Исследование процесса иммунокомплексообразования у пациентов с манифестными формами КЭ показало, что в остром периоде заболевания у всех обследованных лиц уровень ЦИК был значимо выше, чем в группе здоровых доноров (p0,05). Следует отметить, что у пациентов с разными формами КЭ были выявлены различия качественного состава ЦИК (рис.6). Так, у вакцинированных и невакцинированных пациентов 1-ой группы размеры иммунных комплексов значимо не отличались от таковых у здоровых лиц.
Анализ качественного состава ЦИК у пациентов с очаговыми формами КЭ показал изменение размеров иммунных комплексов в сторону снижения количества крупномолекулярных ЦИК и увеличения средне- и низкомолекулярных ЦИК (рис.6).
Характеристика состояния клеточного иммунитета у пациентов с антигенемией ВКЭ
Судя по этим данным, можно сказать о том, что высоковирулентный штамм Dal (из кластера Sofjin-подобных штаммов) быстро проникает в мононуклеарные лейкоциты и активно реплицируется в них на протяжении 24 час, и затем вирус из клеток поступает в культуральную жидкость, где происходит его быстрое накопление. Штаммы Kip-94 (из кластера Oshima-подобных штаммов) и P-196 (из кластера Senzhang-подобных штаммов) накапливались в культуральной жидкости гораздо медленнее. Вероятно, несхожесть механизмов накопления штаммов внутри клеток и в культуральной жидкости сопряжена с их особенностями молекулярно-генетической характеристики. Также для других вирусов (WNV и вируса гриппа А) было показано, что ускоренная репликация вируса является одной из вирусных стратегий избегания иммунного, в том числе IFN ответа организма [253, 278, 332, 412].
Влияние штаммов ВКЭ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками крови in vitro
Цитокин IL-8, относящийся к группе СХС-хемокинов, продуцируется многими видами клеток под действием разных флавивирусов, в том числе и вируса КЭ [203, 255, 349, 404]. Нами было установлено, что штаммы вируса КЭ активно индуцируют in vitro продукцию IL-8 мононуклеарными лейкоцитами во все сроки наблюдения. Цитокининдуцирующая активность штамма вируса Dal была значимо выше, чем у штаммов Kip-94 и P-196 (p0,05), в то же время значения показателей продукции IL-8, индуцируемых штаммами Kip-94 и P-196, не отличались между собой (p 0,05) (табл.14). Уровень продукции IL-8 клетками, инфицированными штаммом Dal, повышался ко 2-м суткам культивирования, достигая пика на 3-и сутки, и оставался на высоком уровне до конца срока наблюдения. Максимальные значения показателей продукции исследуемого цитокина при инфицировании клеток штаммом Dal (1360 (1260-1400) pg/ml) были в 2,6 раза выше, чем в неинфицированной культуре клеток (515 (450-585) pg/ml). Наибольшая цитокининдуцирующая активность штамма Kip-94 зарегистрирована на 4-е сутки культивирования клеток (990 (926-1155) pg/ml, в контроле - 550 (495-600) pg/ml, p=0,002), а у штамма P-196 – на 5-е сутки (790 (705-950) pg/ml, в контроле – 580 (510-645) pg/ml, p=0,043).
Полученные нами данные совпадают с результатами исследований других авторов [233, 242, 377, 428], показавших, что белок NS5 флавивирусов DENV и HCV индуцирует экспрессию IL-8 в культуре дендритных и мононуклеарных клеток человека. Кроме того, этими авторами была выявлена нейтрализация IL-8, индуцированным флавивирусами, противовирусного действия IFN, что способствовало усилению вирусной репликации.
TNF продуцируется, главным образом, активированными моноцитами и макрофагами в ответ на воздействие различных флавивирусов как in vitro, так и in vivo [46, 217, 233, 319, 387, 428]. Мы установили, что исследуемые штаммы вируса КЭ стимулировали in vitro продукцию TNF с первых суток культивирования их с мононуклеарными лейкоцитами (табл.14). Однако интенсивность продукции этого цитокина, вырабатываемого клетками под воздействием вируса, отличалась у разных штаммов. Наиболее высокую цитокининдуцирующую активность проявлял штамм Dal. Для этого штамма была характерна следующая динамика индукции TNF: показатели продукции цитокина невысокие в 1-е сутки культивирования клеток резко увеличились ко 2-м суткам, достигли своего пика к 3-м суткам, затем постепенно снижались к 5-м суткам наблюдения. При этом максимальные значения показателей продукции цитокина при инфицировании клеток штаммом Dal (62,9 (54,0-71,3) pg/ml) были в 10 раз выше, чем в неинфицированной культуре клеток (5,4 (4,0-6,8) pg/ml). Динамика индукции TNF штаммами Kip-94 и P-196 была иная: показатели продукции цитокина увеличивались постепенно, достигая своего
Примечание: Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); р1 - значимость различий между показателями продукции цитокинов мононуклеарными клетками, неинфицированными (контроль) и инфицированными штаммами вируса; p2 - значимость различий между показателями продукции цитокинов мононуклеарными клетками, инфицированными штаммом Dal, и другими штаммами вируса; (критерий Вилкоксона для связанных выборок); n=10 доноров. максимального значения к 4-м суткам культивирования клеток со штаммом Kip-94 (36,2 (30,0-41,1) pg/ml), и к 5-м суткам инкубации со штаммом P-196 (30,8 (23,1-35,0) pg/ml). Значения показателей продукции TNF, индуцируемых штаммами Kip-94 и P-196, значимо между собой не отличались (p 0,05) (табл.14).
Как видно из представленных данных в табл. 14, динамика продукции провоспалительных цитокинов (IL-8 и TNF) мононуклеарными лейкоцитами сопряжена с динамикой накопления изучаемых штаммов в супернатантах клеток. Вероятно, выявленная нами ранняя и умеренная продукция IL-8 и TNF мононуклеарными лейкоцитами под действием штаммов P-196 и Kip-94 способствует повышению на этих клетках экспрессии адгезионных и активационных молекул и усилению их цитотоксической активности. Можно предположить, что активация защитных функций клеток, в конечном итоге, обусловливает замедленное накопление штаммов P-196 и Kip-94 в супернатантах клеток. В то же время, зарегистрированные на 2-3 сутки высокие уровни продукции провоспалительных цитокинов, индуцируемые штаммом Dal, по-видимому, вызывают повреждение иммунокомпетентных клеток, и, тем самым, не предотвращают быстрого размножения вируса. Таким образом, модуляция штаммами вируса КЭ продукции провоспалительных цитокинов является одним из механизмов, обеспечивающих влияние вируса на развитие воспалительной реакции на ранних этапах инфекционного процесса.
