Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитокины, будучи эндогенными иммуномодуляторами, имеют универсальное значение в регуляции практически всех систем организма. По сравнению с экзогенными модуляторами (химического, бактериального или растительного происхождения) цитокины оказывают свои эффекты через специфические рецепторы и являются естественными регуляторами функциональной активности различных типов клеток. Эти свойства обусловливают перспективы применения цитокинов в лечении и профилактике различных иммунопатологических заболеваний, а также для генерации различных типов клеток при проведении клеточной иммунотерапии. В настоящее время в клинической практике используется целый ряд лекарственных препаратов на основе цитокинов (ИФН, ФНО, ИЛ-1, ИЛ-2, ГМ-КСФ, Г-КСФ и т.д.). Вместе с тем, побочные эффекты цитокинов, связанные с плейотропным характером их действия и экспрессией рецепторов на многих типах клеток отчасти ограничивают широкое внедрение указанных молекул в клиническую практику и диктуют необходимость всестороннего изучения биологических эффектов цитокинов.
Интерлейкин-18 (ИЛ-18) в ряду иммунорегуляторных медиаторов занимает особое положение, так как является одним из ключевых цитокинов, вовлеченных в формирование врожденного и приобретенного иммунного ответа. Обладая способностью стимулировать продукцию ИФН-, ГМ-КСФ [Dinarello C.A. et al., 1999; Udagawa N. et.al., 1997], ФНО [Fehniger T.A. et al., 1999; Moller B. et al., 2001], ИЛ-1 [Puren A.J., 1998], ИЛ-2 [Kohno K., 1997], молекул адгезии [Merendino R.A. et al. 2003; Wang J. et al., 2001] и факторов апоптоза Fas/FasL [Golab J., 2000], ИЛ-18 участвует в активации цитотоксических Т-лимфоцитов, НК-клеток, макрофагов, дендритных клеток и способствует формированию эффективного противоинфекционного и противоопухолевого иммунного ответа [Jablonska E. et al., 2006; Kito T. et al., 2003; Ueno N. et al., 2005].
Способность ИЛ-18 активировать клеточный иммунитет обосновывает значительный интерес к данному цитокину в качестве потенциального индуктора протективного иммунитета при онкологических и инфекционных процессах (вирусной и бактериальной природы). Действительно, многие заболевания сопровождаются снижением продукции иммунорегуляторных цитокинов и в частности ИЛ-18 [Vankayalapati R. et al., 2000]. Важно отметить, что в функционально-активных участках промотора гена ИЛ-18 обнаружено несколько одиночных нуклеотидных полиморфизмов, которые могут влиять на продукцию ИЛ-18. Поэтому уровень продукции ИЛ-18 может быть обусловлен генетическими механизмами. Важную роль в регуляции ИЛ-18 играет также блокатор ИЛ-18 – ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ), представляющий собой физиологическую ловушку-рецептор. ИЛ-18СБ может являться перспективным фактором для отмены нежелательных действий ИЛ-18, поскольку нейтрализует его эффекторные функции [Novick D. et al., 1999].
Учитывая перспективность клинического применения ИЛ-18 в лечении онкологических и инфекционных заболеваний, создание препаратов на основе ИЛ-18 и их тестирование является важной научно-практической задачей. Наиболее распространенными продуцентами, используемыми для получения генноинженерных форм цитокинов являются клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии, растения, как продуценты иммунорегуляторных белков, имеют ряд преимуществ: гликозилирование и фолдинг белков схож с таковыми в клетках млекопитающих, культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата. Однако сведения о биологических эффектах цитокинов и, в частности ИЛ-18, продуцируемых трансгенными растениями, практически отсутствуют.
Данные о значительной роли ИЛ-18 в регуляции большого числа иммунных реакций позволяют предположить, что ИЛ-18 и ИЛ-18СБ займут свое достойное место в арсенале препаратов для борьбы с множеством патологических состояний человека. Поэтому исследование биологических эффектов и механизмов действия рекомбинантного ИЛ-18, получаемого из различных источников (бактериальные и растительные продуценты) представляется чрезвычайно актуальным. При этом, учитывая особенности эффектов ИЛ-18, одним из востребованных направлений является разработка протоколов и схем использования этого белка не только в клинической практике, но и для регуляции функциональной активности клеток иммунной системы in vitro, что может быть успешно использовано при создании новых клеточных технологий. Поскольку имеются данные об эффективности перорального введения антигенов и цитокинов и использованию трансгенных растений, нам также представлялось актуальным оценить эффекты перорального применения трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.
В связи с вышесказанным была сформулирована цель работы: изучить биологические эффекты ИЛ-18 in vitro и на экспериментальных моделях животных in vivo, эффективность его использования в клеточных технологиях, а также при пероральном применении в составе трансгенных растений.
В рамках поставленной цели решались следующие задачи:
-
Охарактеризовать иммунохимическую и биологическую активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18, полученного по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа, по способности стимулировать продукцию ИФН-, ФНО мононуклеарными клетками in vitro и реакцию гиперчувствительности замедленного типа in vivo.
-
Охарактеризовать иммунохимическую и биологическую активность рекомбинантного ИЛ-18 связывающего белка, полученного по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа, по способности отменять специфические эффекты эндогенного и рчИЛ-18 в экспериментах in vitro и в модели ЛПС–индуцированной летальности экспериментальных животных in vivo.
-
Изучить противоопухолевую активность рекомбинантных ИЛ-18 и ИЛ-18 связывающего белка в экспериментальных моделях перевиваемых опухолей (ортотопической солидной и гематогенной меланомы В16) у мышей.
-
Изучить ассоциированность аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позициях -607 и - 137 с уровнем его продукции мононуклеарными клетками периферической крови человека.
-
Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов в промоторе гена ИЛ-18 в позициях -607 и – 137 в мононуклеарных клетках здоровых доноров и больных вирусным гепатитом В.
-
Изучить эффективность использования рИЛ-18 для индукции специфического иммунного ответа в культуре мононуклеарных клеток в присутствии дендритных клеток, нагруженных антигенами вируса гепатита В и M. tuberculosis.
-
Изучить биологические эффекты модифицированной по гену ИЛ-18 моркови Daucus carota L. в экспериментальных моделях на мышах при пероральном применении.
Научная новизна.
Впервые установлено, что блокирование ИЛ-18 с помощью ИЛ-18 связывающего белка полностью ингибирует продукцию ФНО КонА-стимулированными мононуклеарами человека (МНК). Установлено, что ИЛ-18 при введении in vivo оказывает разнонаправленный эффект на опухолевый рост в зависимости от модели опухолевого процесса, в частности ингибирует рост солидной опухоли и увеличивает количество метастатических очагов в модели гематогенной меланомы В16 у мышей. Получены новые данные о связи уровня продукции ИЛ-18 с аллельным полиморфизмом промотора гена в позиции -607 и – 137. Впервые выявлено снижение частоты встречаемости генотипов –607AA и –607AA/-137CG у больных хроническим вирусным гепатитом В и увеличение частоты встречаемости генотипа -607CC/-137CC, ассоциированного с низким уровнем спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-18 МНК. Получены новые данные об эффективности использования рИЛ-18 для стимуляции иммунного ответа МНК in vitro, в том числе, при совместном культивировании с дендритными клетками (ДК). В частности, добавление рИЛ-18 приводит к выраженной стимуляции антиген-индуцированной продукции ИФН-, достоверному повышению содержания ИФН-продуцирующих клеток. Впервые установлено, что ИЛ-18, экспрессируемый растительной клеткой, при пероральном применении оказывает характерные для него специфические эффекты в экспериментальных моделях на животных.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Блокирование продукции ФНО в культурах МНК в присутствии рИЛ-18 СБ свидетельствует о важной роли системы ИЛ-18/ИЛ-18СБ в регуляции провоспалительной активности мононуклеарных клеток. Способность ИЛ-18 ингибировать рост ортотопической солидной меланомы В16, а ИЛ-18СБ - гематогенной метастатической меланомы указывает на существование различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками. Выявленная ассоциация продукции ИЛ-18 с аллельными вариантами промоторного региона гена ИЛ-18 в позициях -607 и -137 свидетельствует о генетической детерминированности уровня продукции ИЛ-18. В свою очередь установленное возрастание частоты встречаемости генотипов, ассоциированных с низким уровнем продукции ИЛ-18 при хроническом вирусном гепатите В указывает на патогенетическую значимость ИЛ-18 при данной патологии.
Характеристика полученных по оригинальной методике белков ИЛ-18 и ИЛ-18СБ свидетельствует о возможности их использования в дальнейшей разработке лекарственных средств. Продемонстрированная эффективность рИЛ-18 в подавлении роста солидных опухолей и ИЛ-18СБ в гематогенной метастатической модели обосновывает целесообразность применения этих белков для цитокиновой и антицитокиновой иммунотерапии при онкопатологии. Способность рИЛ-18 усиливать функциональную активность мононуклеарных и дендритных клеток in vitro свидетельствует об эффективности использования данного цитокина при разработке клеточных технологий, в том числе на основе дендритных клеток. Эффективность перорального применения трансгенной моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, является экспериментальным обоснованием создания нового поколения иммуноактивных субстанций на основе трансгенных растений.
Положения, выносимые на защиту.
-
ИЛ-18 и ИЛ-18СБ оказывают противоопухолевые эффекты в зависимости от типа и стадии опухолевого процесса.
-
Полиморфные варианты в промоторном участке гена ИЛ-18 (в позициях -607 и -137) ассоциированы с различными уровнями продукции белка и частотой встречаемости у больных хроническим вирусным гепатитом В.
-
Использование рИЛ-18 эффективно для стимуляции клеточных иммунных реакций при взаимодействии ДК, презентирующих различные антигены, и мононуклеаров периферической крови.
-
Использование трансгенных растений, экспрессирующих ген ИЛ-18 человека, эффективно для модуляции иммунных реакций при пероральном применении.
Личный вклад автора в проведение исследования.
Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором или при его непосредственном участии.
Апробация материалов диссертации.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г), 2) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003г), 3) объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г.), 4) 8-ом Всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г), 5) конференции «Технология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005г), 6) 4-ой конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005г), 7) Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет» (Новосибирск, 2005г), 8) Всероссийской научно-практической конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005г), 9) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006г), 10) конференции «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2006г), 11) Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006г), 12) Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006г), 13) III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2007г), 14) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007г), 15) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2010г), 16) Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010г), 17) Annual conference on cancer immunotherapy and vaccination (Czech Republic, Mikulov, 2011). Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании Проблемной комиссии МНС 55.07 «Иммунология» с участием сотрудников НИИ клинической иммунологии СО РАМН 30 июня 2011 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 69 работ, из них 24 статьи, из них 14 статей в изданиях, включенных в системы цитирования, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ. Получено 3 патента.
Структура и объем диссертации.
Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Диссертация изложена на 210 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунками и 4 таблицами. Список цитируемой литературы включает 245 источников, из них 11 работ отечественных авторов.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии (руководитель лаборатории д.м.н., проф. Сенников С.В.) НИИ клинической иммунологии СО РАМН.
