Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы: Значение иммунологического мониторинга у пациентов после трансплантации печени 11
1.2 Особенности течения послеоперационного периода у пациентов после трансплантации печени 16
1.3 Современная концепция формирования иммунного ответа организма на АГ 18
1.4 Возможности лабораторной диагностики острого клеточного отторжения и инфекционных осложнений 26
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1 Характеристика клинического материала 33
2.2 Методы лабораторных исследований 38
2.3 Методы статистического анализа 42
Глава 3. Результаты собственных исследований 43
Мониторинг количества, состава и функции иммунокомпетентных клеток периферической крови пациентов в ранний период после трансплантации печени 43
3.1 Динамика общего количества лейкоцитов в периферической крови 43
3.2 Динамика количества нейтрофилов 48
3.3 Динамика общего числа лимфоцитов 53
3.4 Динамика количества CD3+лимфоцитов (Т-лимфоцитов) 57
3.5 Динамика количества CD3+CD4+ лимфоцитов 61
3.6 Динамика количества CD3+CD8+ лимфоцитов 65
3.7 Динамика соотношения CD4+/CD8+ лимфоцитов (иммунорегуляторный индекс - ИРИ) 69
3.8 Динамика количества CD3-CD16+ CD56+ лимфоцитов (NK-клетки) 72
3.9 Динамика количества В-лимфоцитов (CD19+) 75
3.10 Анализ динамики уровня иммуноглобулинов A, M, G 79
3.11 Изменение функциональной активности нейтрофилов 86
Глава 4. Анализ наиболее информативных иммунологических показателей у пациентов сравниваемых групп на 2, 5, 12, 14 сутки после трансплантации печени 99
4.1 Изменения иммунологических показателей на 2 сутки после ТП 99
4.2 Изменения иммунологических показателей на 5 сутки после ТП 103
4.3 Изменения иммунологических показателей на 12 сутки после ТП 105
4.4 Изменения иммунологических показателей на 14 сутки после ТП 106
Глава 5. Анализ изменений диагностически значимых иммунологических показателей при формировании воспалительных процессов различного генеза.
5.1 Динамика диагностически значимых иммунологических показателей у пациентов с осложнениями бактериальной природы
5.2 Динамика диагностически значимых иммунологических показателей у пациентов с осложнениями вирусной природы
5.3 Динамика диагностически значимых иммунологических показателей у пациентов с острым клеточным отторжением
Глава 6. Создание диагностического алгоритма проведения дифференциальной диагностики воспалительных процессов инфекционной и неинфекционной природы.
Заключение:
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы.
- Возможности лабораторной диагностики острого клеточного отторжения и инфекционных осложнений
- Мониторинг количества, состава и функции иммунокомпетентных клеток периферической крови пациентов в ранний период после трансплантации печени
- Изменения иммунологических показателей на 2 сутки после ТП
- Динамика диагностически значимых иммунологических показателей у пациентов с осложнениями бактериальной природы
Введение к работе
Актуальность темы
В современном мире все большее распространение получает проведение трансплантации органов у пациентов в терминальной стадии заболеваний жизненно важных органов – сердца, печени, почек и т.д. Накоплен большой опыт по трансплантации органов, созданы фармакологические препараты для проведения эффективной иммуносупрессивной терапии, совершенствуются схемы и методы иммуносупрессии. Однако остаются нерешенными проблемы ранней диагностики острого клеточного отторжения, дифференциальной диагностики клеточного отторжения и воспалительных процессов бактериальной и вирусной природы. Изменения клинико-биохимических показателей не являются ранними и специфическими маркерами воспаления. Пункционная тонко-игольная биопсия, считающаяся в настоящее время «золотым стандартом», в силу своей инвазивности может привести к осложнениям, также возможны расхождения гистологической картины с клинико - лабораторными данными [М.Ш.Хубутия, В.И. Шумаков 2005, С.В. Арзуманов 2008]. В связи с вышеизложенным поиск молекулярных маркеров иммунологического конфликта является приоритетным направлением в трансплантационной иммунологии с 80-х годов ХХ века [G.Kohler, C. Milstein, 1975].
Воспаление является общебиологическим процессом, имеющим гомео-статический характер, которое направлено на поддержание постоянства внутренней среды организма [В.В. Серов 1995]. Следовательно, активация иммунокомпетентных клеток в ответ на внедрение чужеродного антигена является нормальным физиологическим процессом, направленным на сохранение и поддержание внутреннего гомеостаза организма. Выраженность иммунного ответа (воспалительной реакции) и пролиферация иммунокомпе-тентных клеток, участвующих в воспалении, зависит от особенностей антигена и состояния иммунной системы организма. На современном этапе изучения механизмов формирования иммунного ответа известно, что при вне-
дрении в организм человека антигенов различной природы (вирусных, бактериальных, аллоантигенов), в пролиферацию вступают и выполняют эффек-торную функцию разные клоны иммунокомпетентных клеток [Taylor 2004, A.Nel 2004, Golshan D. 2007, М.В. Пащенков., Б.В. Пинегин 2010, А.А.Ярилин 2010].
Активация иммунных процессов в организме в ответ на пересадку ал-логенного органа развивается с первых минут после трансплантации. Наиболее значительные изменения в иммунной системе реципиента происходят в первые 2-3 недели после трансплантации [J.Y. Niederkorn 2006]. Иммунный ответ на аллоантигены значительно превышает ответ на вирусные и бактериальные антигены [Д.В. Казанский 2005, D.Golshan 2007]. В силу этого, анализ динамики иммунокомпетентных клеток реципиента в ранние сроки после трансплантации может быть информативным для определения этапов формирования посттрансплантационного иммунитета, развития процессов отторжения или иммунного ответа на инфекцию и способствовать ранней ма-лоинвазивной диагностике и проведению дифференциальной диагностики осложнений различной природы.
Однако в настоящее время нет единой точки зрения на клиническое значение изменений отдельных иммунологических показателей периферической крови при формировании воспалительных процессов инфекционной природы и при отторжении трансплантата. В доступной литературе нами не найдены сведения о необходимом объеме лабораторных исследований, не определено диагностическое значение иммунологических исследований, отсутствуют данные об оптимальных сроках обследования пациентов после трансплантации печени (ТП). Поиск ответов на указанные вопросы определил цель и задачи нашей работы.
Цель исследования
Оптимизация диагностики ранних послеоперационных осложнений различной этиологии (инфекционно-воспалительного процесса и острого клеточного отторжения) на основании мониторинга иммунологических показателей в ранний период после трансплантации печени.
Задачи исследования:
-
На основании ежедневного мониторинга иммунологических показателей определить этапы формирования посттрансплантационного иммунного ответа у пациентов в ранние сроки после трансплантации печени.
-
Оценить выраженность и направленность иммунного ответа у пациентов с неосложненным течением послеоперационного периода, а также с воспалительными процессами различной этиологии (острым клеточным отторжением и инфекционными осложнениями бактериальной или вирусной природы).
-
Выявить прогностически и диагностически значимые иммунологические маркеры острого клеточного отторжения и воспалительных процессов различной этиологии; установить динамику изменений иммунологических маркеров в указанный период.
-
Разработать и апробировать алгоритм дифференциальной диагностики воспалительных процессов различной этиологии в первые две недели после трансплантации печени.
Научная новизна работы
Впервые проведен мониторинг основных популяций лимфоцитов, уровня иммуноглобулинов A, M, G, поглотительной активности и кислородного метаболизма нейтрофилов у пациентов в ранние сроки после ТП, позволивший проанализировать этапы формирования посттрансплантационного иммунитета.
Установлено, что наиболее информативными сроками для оценки формирования посттрансплантационного иммунитета являются 2, 5, 12 и 14 сутки после ТП.
Впервые определена клинико-диагностическая значимость изменений иммунологических показателей у пациентов с различным течением раннего периода после ТП.
Определены изменения анализируемых иммунологических показателей у пациентов с неосложненным течением раннего периода после ТП, соответствующие адекватному иммунному ответу («норме патологии») организма на операцию.
Установлено, что уже на 2 сутки после ТП анализ динамики количества лейкоцитов, нейтрофилов, абсолютного содержания CD8+лимфоцитов и уровня ИРИ (CD4+/CD8+) позволяет оценить силу иммунного ответа на трансплантацию аллогенного органа и прогнозировать возможные осложнения.
Показаны статистически достоверные различия в иммунологических показателях у пациентов с инфекционными осложнениями различной природы и острым клеточным отторжением, что позволяет проводить дифференциальную диагностику инфекционных осложнений в первые 2 недели после ТП в78-86% случаев, а острое клеточное отторжение в 75% случаев.
Практическая значимость работы
Сформулированы принципы оценки иммунологических показателей и сроки проведения исследований после ТП, которые позволяют прогнозировать возможные осложнения различного генеза.
Комплекс иммунологических тестов, используемых в мониторинге, позволяет оценить индивидуальный иммунный ответ на трансплантацию алло-генного органа и проводимую иммуносупрессивную терапию, и, при необходимости, корректировать иммуносупрессивную нагрузку на организм реципиента.
Разработанный диагностический алгоритм дает возможность с помощью малоинвазивного анализа крови провести дифференциальную диагностику осложнений инфекционной природы и/или острого клеточного отторжения в ранние сроки после ТП и сократить время до начала этиотропной терапии.
Основные положения, выносимые на защиту
Проведен анализ результатов иммунологического мониторинга периферической крови пациентов в первые 2 недели после ТП, определены этапы формирования посттрансплантационного иммунитета и диагностически значимые сроки иммунологического обследования - 2, 5, 12, и 14,сутки после трансплантации печени.
Выявлены разнонаправленные изменения анализируемых иммунологических показателей при воспалительных процессах различного генеза, которые уже на 2 сутки после ТП позволяют выделить пациентов с высоким риском бактериальных осложнений, активации вирусной инфекции или острым клеточным отторжением.
Предложен комплекс диагностически значимых иммунологических показателей, анализ которых помогает проводить дифференциальную диагностику острого клеточного отторжения, воспалительных процессов вирусной или бактериальной природы.
Сформулирован и апробирован диагностический алгоритм, позволяющий в ранние сроки после ТП прогнозировать риск развития осложнений и проводить дифференциальную диагностику воспалительных процессов различного генеза.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 1-й конференции Межрегиональной общественной организации «Общество трансплантологов» (Москва. 2009 г.); городском семинаре «Современные лабораторные технологии в диагностике неотложных состояний» (Москва, 2010 г.); VI Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2012г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 3 статьи и 3 тезисов в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 159 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственно исследований, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 112 источников, в том числе 86 иностранных. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 8 таблицами.
Возможности лабораторной диагностики острого клеточного отторжения и инфекционных осложнений
Острое клеточное отторжение (ОКО) трансплантата является физиологическим процессом и обусловлено целым комплексом иммунологических реакций, направленных на элиминацию чужеродной белковой структуры (ткани, отдельных клеток, целого органа) и развивается в период от нескольких дней (5-7сутки) до нескольких недель после трансплантации [27, 93].
Первые экспериментальные работы по анализу изменений состава лимфо-идных клеток при отторжении органов появились в 70-х годах ХХ века [45, 58, 62, 77]. После получения в 1975 году G.Kohler и C. Milstein моноклональных антител (МКАТ) и выпуска в начале 80-х годов первых коммерческих наборов, стало возможным проведение фенотипирования клонов лимфоцитов во многих лабораторных центрах мира. Получение МКАТ к рецепторам иммунокомпетент-ных клеток позволило начать исследования периферической крови и биоптатов органов у пациентов с различными патологическими состояниями. Уже с начала 80-х годов стали появляться публикации, в которых проводился анализ спектра рецепторов лимфоцитов периферической крови у пациентов после трансплантации сердца, почки и кожи [40, 49, 55, 60, 65 , 66, 76, 82, 83, 92, 98, 99, 100, 106,108]. Полученные результаты оказались весьма противоречивыми. Исследователями обнаружены количественные различия субпопуляций лимфоцитов OKT4 (T helper/inducer) и OKT8 (T suppressor/cytotoxic) (CD3+ CD4+ лимфоцитов хелперов и CD3+ CD8+ цитотоксических лимфоцитов) и изменение соотношения OKT4/OKT8 (CD4+ /CD8+) у реципиентов почек и сердца с отторжением и без отторжения органа. Часть авторов, при сопоставлении с данными биопсии, вывела корреляционную зависимость между соотношением лимфоцитов CD4+ /CD8+ (ИРИ) в периферической крови и риском развития отторжения органа [92, 98, 99, 106]. Авторы других публикаций данной корреляции не обнаружили, но выявили достоверную зависимость (р=0,001) между обратимостью отторжения почки в результате проведения пульс-терапии КС и ИРИ [55, 65, 100]. В исследовании, проведенном в 1985 году, на основании биопсий и анализа соотношения лимфоцитарных популяций крови у группы больных после трансплантации почки (30 наблюдений) доказывалась несостоятельность прогноза отторжения с помощью ИРИ, а в качестве единственно верного способа диагностики отторжения утверждалась биопсия трансплантата [108].
При проведении иммуногистохимического анализа материала биопсий почечного трансплантата разными исследователями были получены прямо противоположные данные о популяционном составе клеточного инфильтрата при отторжении [40, 49]. Hancock W. в своей работе указывал на преобладание в инфильтрате при отторжении почки CD4+ лимфоцитов, которым приписывал эф-фекторную функцию [49]. В другом исследовании Claesson K. обнаружил при отторжении органа увеличение числа цитотоксических CD8+ лимфоцитов [40]. Ibrahim с соавторами (1993г.) выявили статистически достоверное увеличение числа CD8+ клеток в биоптате при отторжении трансплантата почек и печени [56]. В более поздних работах, основанных на экспериментальных данных, при анализе биоптатов и периферической крови реципиентов печени, было подтверждено участие в клеточном отторжении CD4+ и CD8+ лимфоцитов. При этом эф-фекторная роль отводилась цитотоксическим CD8+ лимфоцитам [36, 74, 79, 85, 90, 110]. Авторы наблюдали статистически достоверное увеличение популяции CD8+цитотоксических лимфоцитов в биотате при отторжении органа и реализацию отторжения при истощении популяции CD4+ лимфоцитов с помощью моно-клональных АТ [74, 79, 85, 90, 110].
Несомненно, «золотым стандартом» для диагностики ОКО по-прежнему остается пункционная биопсия трансплантата, но поиск маркеров для неинвазивной диагностики ОКО является приоритетным направлением в развитии трансплантационной иммунологии на настоящем этапе, что подтверждает большое число публикаций на эту тему в последние годы [3, 21, 22, 35, 36, 43, 50 , 53, 73,87, 97,103].
В настоящее время для ранней диагностики ОКО предлагается целый ряд иммунологических маркеров, определяемых в периферической крови. К ним относится определение неоптерина–маркера активности моноцитарно-макрофа-гальной системы. Тест на определение уровня неоптерина характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью (90 и 100%, соответственно) при диагностике ОКО у пациентов после трансплантации сердца [22, 23]. Однако определение данного маркера при диагностике ОКО после трансплантации печени и почек мало информативно [23, 24]. В качестве иммунологических маркеров активности посттрансплантационных процессов современные исследователи предлагают использовать определение в периферической крови уровня растворимых рецепторов sCD30, CD15s, CD103, CD28, CD38, интерлейкинов (IL-2, IFN, IL-4, IL-5, IL-6), соотношения растворимых рецепторов апоптоза sFas/FasL и ряд других параметров [3, 21, 22, 35, 36, 43, 50, 53, 73, 87, 103]. В последние годы появились исследования, подтверждающие информативность анализа активацион-ных маркеров лимфоцитов (рецепторов, экспрессируемых на мембране лимфоцита при получении сигнала активации), для диагностики ОКО, определяемых методом проточной цитометрии [33, 35, 53, 97]. В представленных работах указывается на высокую специфичность (85%) и чувствительность (89%) при ОКО экспрессии таких рецепторов активации лимфоцитов, как CD69+ на CD8+ лимфоцитов, а так же уровня регуляторных клеток (Tregs) с фенотипом CD4+ CD25high CD127low. Имеются данные о значительном усилении экспрессии рецепторов CD38+ и CD28+ на CD3+ лимфоцитах при ОКО, в отличие от инфекционного процесса (34). В то же время, определение таких рецепторов активации, как CD25 и HLADR на CD3+ лимфоцитах, не имеет диагностической ценности, т.к. повышение экспрессии этих рецепторов отмечается, так же, при наличии инфекционного процесса [53]. В этой же публикации авторы указывают на отсутствие информативности стандартной цитометрической оценки основных популяций лимфоцитов для диагностики ОКО. Однако, в другой работе авторы считают необходимым проведение количественного анализа CD8+ и CD4+ лимфоцитов, как основных клеточных элементов, взаимодействующих с молекулами МНС и классов, соответственно, и определяющих характер иммунного ответа организма на трансплантат [87]. В ряде публикаций указывается так же на индивидуальность иммунного ответа пациента на трансплантат и возможности, на основании проведения иммунологических исследований, изменять иммунносупрессивную нагрузку на организм в зависимости от активности иммунологических реакций в посттрансплантационном периоде [33, 43 , 53, 87].
Расхождение мнений об информативности стандартного цитометрического анализа популяций лимфоцитов при диагностике ОКО обусловлено отсутствием четких лабораторных критериев ОКО и других воспалительных процессов, формирующихся после трансплантации органа на фоне иммуносупрессивной терапии.
Многочисленные клинико-лабораторные наблюдения доказывают, что в формировании ОКО на разных этапах его развития активизируются и пролифе-рируют разные клоны иммунокомпетентных клеток и, как следствие, меняется спектр медиаторов и продуктов воспаления (цитокинов, растворимых рецепторов, молекул адгезии) [41, 97, 98, 99, 100]. Кроме того, некоторые цитокины являются продуктами активированных клеток иммунной системы короткодистант-ного действия. После синтеза и поступления в межклеточное пространство они быстро вступают во взаимодействие с комплементарными рецепторами иммуно-компетенных клеток или, при отсутствии таковых, инактивируются ферментами сыворотки крови [35, 87]. Следовательно, ориентироваться на один показатель (маркер) для характеристики такого сложного многофакторного процесса, как формирование посттрансплантационого иммунитета и ОКО, ненадежнo и малоинформативно.
Мониторинг количества, состава и функции иммунокомпетентных клеток периферической крови пациентов в ранний период после трансплантации печени
На первом этапе исследований проводили анализ количества, состава и функции иммунокомпетентных клеток у пациентов, включенных в исследование, выявляли изменения в иммунной системе при развитии осложнений в послеоперационном периоде. Определяли динамику изменения исследуемых иммунологических показателей в ранний период после ТП. Выявляли закономерности изменения иммунологических показателей у пациентов всех анализируемых групп, различия в динамике и выраженности изменений показателей клеточного и гуморального звена иммунной системы у пациентов с различным течением раннего послеоперационного периода.
При анализе результатов обследования пациентов без разделения на группы сравнения установлено, что динамика общего числа лейкоцитов периферической крови в ранние сроки после ТП носит волнообразный характер (рис.2 А). В течение анализируемого периода удалось зарегистрировать две волны подъема данного показателя: на 2 сутки (точка А1) и на 12 сутки наблюдения (точка А3). С 4-х (точка А2) по 6 сутки зарегистрировано минимальное значение количества лейкоцитов в периферической крови у пациентов после ТП (7425,0кл/мкл). При этом точки А1 и А3 располагались выше верхнего интервала референтных значений лейкоцитов на 7,3 и 20,3 %, соответственно, а точка А2 находилась в пределах референтных значений. Различия между точками А1 и А2, А2 и А3 носят статистически достоверный характер (р 0,05). Статистически достоверных различий между точками А1 и А3 не выявлено.
Следует отметить, что до операции (0 сутки) среднее содержание лейкоцитов и у пациентов всех групп составило 5488,0±2018,9 кл/мкл. Первая волна подъема показателя общего числа лейкоцитов (точка А1) сформировалась в течение одних суток, весьма интенсивно (суточный прирост составил 47,1%) и соответствовала среднему значению 9660,7±5802,8 кл/мкл: разница между значениями показателя в 0 сутки и на 2 сутки (точка А1) после ТП составляла 76%. В то же время вторая волна подъема показателя (точка А3) нарастала медленно - с 7 до 12 суток, значительно меньшими темпами (суточный прирост показателя не превышал 6,6 % от предыдущего значения). Среднее значение числа лейкоцитов на 12 сутки составило 10830,2 ± 6007,2 кл/мкл, что на 45,9% превышало уровень лейкоцитов на 4сутки (точка А2).
Учитывая сроки и характер динамики увеличения общего числа лейкоцитов, можно предположить, что первая волна подъема общего числа лейкоцитов (точка А1) обусловлена реакцией организма пациентов на операционную травму и применение в интраоперационный период КС. Вторая волна увеличения данного показателя (точка А3), по-видимому, связана с воспалительной реакцией организма на АГ (или аллоАГ) и, вероятно, характеризует этап формирования посттрансплантационного иммунитета после ТП.
Таким образом, установленный волнообразный характер (статистически достоверны различия между точками А1 и А2 и А2 и А3) динамики количества лейкоцитов подтверждает этапность формирования иммунного ответа на АГ (аллоАГ) в ранний посттрансплантационный период.
При анализе динамики количества лейкоцитов по группам сравнения (рис.2Б) изменения данного параметра по всем группам носили аналогичный характер. Однако, степень выраженности этих изменений была различная. В 1-2 сутки после ТП в группах пациентов (кроме 2 гр.) зафиксирован рост числа лейкоцитов. Прирост клеток на следующие сутки после операции (2 сутки) у пациентов контрольной группы и 1гр. составил относительно 0 суток 44,7 и 86,4 %, соответственно. Содержание лейкоцитов у пациентов контрольной группы оставалось в пределах референтных значений, у пациентов 1 гр. число лейкоцитов превышало значения в контрольной группе на 34,9% (р 0,05), а верхнюю границу интервала референтных значений на 18,1 %. У пациентов 3 гр. число лейкоцитов в сравнении с 0 сутками выросло в 3 раза и превышало число лейкоцитов в контрольной группе на 63,1% (р 0,05), а верхнюю границу референтных значений - на 42,7%. У пациентов 2 гр. число лейкоцитов после ТП (2 сутки) не увеличивалось и изменялось в пределах референтных значений, при этом регистрировалось на 21,0% ниже значений в контрольной группе. Отметим, что у пациентов 3 гр. и 1 гр. на 2 сутки после ТП количество лейкоцитов было больше, чем в контрольной группе на 63,1 и 34,9% соответственно (р 0,05), а у пациентов 2 гр. на 21,0% меньше, чем в контрольной группе (рис.2Б).
На 3 сутки наблюдения выявлены разнонаправленные тенденции в изменении числа лейкоцитов у пациентов по группам сравнения. У пациентов 1 гр. число лейкоцитов продолжало увеличиваться, но прирост клеток был небольшим и составил 3,7% по отношению ко 2 суткам. У пациентов 3 гр. количество лейкоцитов незначительно снизилось (на 5,6%) и оставалось на 34,6% выше верхней границы интервалал референтных значений. У пациентов контрольной и 2 групп также зарегистрировано снижение числа клеток на 5,5 и 27,7%, соответственно, но изменения происходили в пределах рефе-ренрных значений.
У пациентов всех групп на 4-5 сутки наблюдения зарегистрировано снижение среднего количества лейкоцитов до уровня референтных значений. С 6 суток отмечен постепенный рост числа лейкоцитов во всех группах. К 7 суткам у пациентов 1 гр. зафиксировано превышение данного показателя выше верхней границы референтного интервала на 16 % и аналогичного по aказателя в контрольной группе на 44,3 % (р 0,05). У пациентов 2 гр. число лейкоцитов зарегистрировано в пределах нижней границы референтных значений и ниже, чем в контрольной группе на 36,8% (р 0,05). Содержание лейкоцитов у пациентов контрольной группы и 3 гр. на 7 сутки находилось в пределах референтных значений, достоверных отличий выявлено не было.
В ходе дальнейшего мониторинга (8-12 сутки) зарегистрирован постепенный рост числа лейкоцитов у пациентов всех групп сравнения (рис.2Б).
На 12 сутки наблюдения достоверные различия (р 0,05) в содержании лейкоцитов отмечены между группами: контрольной и 2 гр., 1 гр. и 2 гр., а так же между 1 гр. и 3 гр. Количество лейкоцитов у пациентов 2 гр. регистрировалось на 46,1% меньше, чем у пациентов контрольной группы; у пациентов 1 гр. - на 15,2% выше, чем у пациентов контрольной группы и в 2,1 раза выше, чем у пациентов 2 гр. У пациентов 3 гр. количество лейкоцитов было на 23,9% меньше, чем у пациентов контрольной группы и на 34,1% меньше, чем у пациентов 1 гр.
Изменения иммунологических показателей на 2 сутки после ТП
На основании проведенных исследований нами условно выделены «ключевые точки» наблюдения (КТН) за пациентами. В качестве этих КТН нами выделены 2, 5, 12 и 14 сутки после ТП. В эти сроки у пациентов после ТП наблюдались наиболее выраженные и прогностически значимые изменения параметров иммунной системы при формировании иммунного ответа на трансплантат. Нами проведен анализ иммунологических показателей у пациентов сравниваемых групп в указанные сутки. Для комплексной оценки 10 наиболее информативных показателей применен метод лепестковой диаграммы, который оказался удобной и наглядной формой одновременного представления большого количества данных. Изменения иммунологических показателей у пациентов с осложнениями бактериальной, вирусной этиологии или острым клеточным отторжением представлены на диаграмме в процентах относительно среднего значения показателей в контрольной группе в соответсвующие сроки.
На рисунке 18 в графической форме представлен сравнительный анализ иммунологических показателей пациентов сравниваемых групп на 2 сутки после ТП. У пациентов всех групп срвнения (1, 2 и 3 групп) установлены отклонения относительно контрольной группы. Однако выраженность этих изменений и их направленность по группам существенно отличались.
У пациентов с бактериальными осложнениями (1 гр.) отмечены умеренные разнонаправленные отклонения показателей от значений «нормы патологии»: 5 показателей из 10 выделенных превышали, 4 были ниже, а один равен значениям «нормы патологии». Данное состояние можно охарактеризовать как состояние умеренной гиперэргии иммунной системы. Количество лейкоцитов, нейтрофилов, NK-клеток, В-лимфоцитов и уровень IgA повышен на 33-52% относительно аналогичных показателей контрольной группы. В то же время, установлено снижение числа CD4+ и CD8+лимфоцитов на 25%, КМ нейтрофилов в спНСТ - тесте и уровня IgM на 30,4 и 9,1%, соответственно в сравнении с контрольной группой.
У пациентов с вирусными осложнениями (2 гр.) зарегистрирован гипо-эргический характер иммунного ответа: отмечено снижение практически всех (8 из10) значимых показателей иммунного ответа в сравнении с контрольной группой. Исключение составили NK- клетки, число которых превышало на 15% количество в контрольной группе. Показатель ИРИ соответствовал значению в контрольной группе. В то же время число нейтрофилов снижено на 38,6%, количество CD4+и CD8+лимфоцитов - на 23 и 50%, соответственно, а снижение продукции кислородных радикалов в спНСТ-тесте достигло 53% (рис.18).
Следует подчеркнуть, что у 1 и 2 групп зарегистрированы разнонаправленные отклонения отдельных показателей от значений «нормы патологии», а при совпадении направления изменений их выраженность была различной (рис.18.)
У пациентов с ОКО (3 гр.) изменения сравниваемых показателей на 2 сутки носило ярко выраженный гиперэргический характер: 7 из 10 выделенных параметров превышали значения контрольной группы. Превышение количества лейкоцитов, нейтрофилов, В-лимфоцитов было значительным и составляло от 50 до 81,8 % в сравнении с контрольной группой, а превышение числа NK- клеток и CD8+лимфоцитов достигло 182,5 и 205%, соответственно. В результате увеличения в 3 раза числа CD8+лимфоцитов, величина ИРИ была ниже 1,0. В то же время относительно контрольной группы определялась сниженная активность КМ нейтрофилов в спНСТ - тесте и сниженный уровень IgМ.
Следует отметить, что зарегистрировано превышение количества NK-клеток на 2 сутки после ТП относительно «нормы патологии» у пациентов с любыми видами послеоперационных осложнений. Однако, степень этого превышения по группам имела достоверные различия. Так у пациентов с вирусными осложнениями (2 гр.) число NK- клеток регистрирваолось на 23% выше в сравнении с контрольной группой, у пациентов с бактериальными осложнениями (1 гр.) – на 55%, а упациентов с ОКО (3 гр.) - на 282%.
В эти же сроки у пациентов групп с осложнениями отмечено снижение показателя сп.НСТ-теста на 27-53% и уровня IgM на 17-25%. Изменения таких показателей, как количества лейкоцитов, нейтрофилов, CD4+ и CD8+ лимфоцитов, ИРИ, CD19+лимфоцитов, уровня IgA по группам имели разнонаправленный характер.
Статистически достоверные различия по группам на 2 сутки отмечены по количеству лейкоцитов (за счет нейтрофилов). У пациентов 1 и 3 групп число нейтрофилов было повышено относительно контрольной группы на 35 и 63%, соответственно, а у пациентов 2 группы снижено на 29%. Также значительно отличалось содержание CD4+и CD8+лимфоцитов и, как следствие, ИРИ у пациентов сравниваемых групп. У пациентов с ОКО (3 гр.) количество CD8+ лимфоцитов на 205% превышало уровень в контрольной группе, а CD4+ лимфоцитов – на 45%, поэтому ИРИ регистрировали ниже значений в контрольной группе на 36%. У пациентов с бактериальной и вирусной инфекциями число CD4+ и CD8+лимфоцитов было снижено на 45 и 52%, 23 и 25%, соответственно, но ИРИ регистрировали в пределах значений в контрольной группе. Уровень CD19+лимфоцитов у пациентов с бактериальными осложнениями и ОКО превышал значения «нормы патологии» на 29,3 и 81,8%, а у пациентов с вирусными инфекциями определяли на 8,9% ниже значения в контрольной группе (рис.18).
Таким образом, комплексный анализ наиболее информативных иммунологических показателей у пациентов на 2 сутки после ТП позволяет определить характер раннего иммунного ответа на трансплантацию печени, оценить выраженность индивидуального иммунного ответа пациентов и иметь большую прогностическую значимость при определении риска развития послеоперационных осложнений и их характера.
Динамика диагностически значимых иммунологических показателей у пациентов с осложнениями бактериальной природы
Анализ иммунологических показателей пациентов, у которых в первые 15 суток после ТП развились бактериальные осложнения (1 гр.) проводили в сравнении с пациентами контрольной группы, неимевших осложнений в аналогичные сроки (табл.2).
Клинические проявления воспалительных процессов у пациентов отмечали, начиная с 6 суток после ТП. Средний срок начала осложнений составил 10 ± 2 суток. Спектр осложнений бактериальной природы представлен в таблице 3. Диагностика воспалительных процессов проводилась на основании клинических признаков (ухудшение самочувствия, нарастание слабости, повышение t0 тела выше 37,00), инструментальных (РГ, УЗИ, КТ) и лабораторных методов обследования. Бактериальная этиология воспаления, при наличии доступа к очагу воспаления, подтверждалась с помощью посева биологических жидкостей (кровь, мокрота, отделяемого по дренажам и др.).
В ранние сроки после ТП практически у всех пациентов наблюдались изменения лабораторных показателей: снижение гемоглобина, водно-электролитные нарушения, коагулопатия. Однако, наиболее важное значение для оценки функции трансплантата печени имели биохимические показатели, указывающие на сохранность гепатоцитов и их синтетической функции.
Снижение синтетической функции трансплантата печени и признаки цитолиза гепатоцитов обнаружены как у пациентов с воспалительными процессами бактериальной природы, так и у пациентов контрольной группы. Подобные нарушения функции трансплантата печени могут наблюдаться у большинства пациентов в ранний период после ТП, являются следствием хо-лодовой ишемии трансплантата и, как правило, обратимы. Однако при формировании воспалительного процесса отмечали более выраженные нарушения функции трансплантата печени, проявляющиеся в увеличении ферментов. У пациентов 1 гр. концентрации билирубина на 79,1% (46,2 ± 37,7 мкмоль/л.) превышала значение в контрольной группе (25,8±16,8 мкмоль/л.). Средний уровень ферментов АЛТ и АСТ составил 135,8 Е/л и 57,7 Е/л, что на 28,4 и 62,0%, соответственно, выше значений в контрольной группе (105,7 Е/л и 35,6 Е/л), однако эти различия статистически не достоверны.
Результаты инструментальных методов оценки состояния трансплантата (УЗИ, КТ) указывали на неспецифические изменения (увеличение размеров органа, воспалительная инфильтрация, нарушение микроциркуляции и др.), характерные для различных патологических состояний и не могли использоваться для проведения дифференциальной диагностики осложнений различного генеза (вирусная инфекция, бактериальные осложнения, ОКО).
При развитии осложнений бактериальной этиологии выявлены статистически достоверные различия по некоторым диагностически значимым иммунологическим показателям в сравнении с контрольной группой (рис.19). У пациентов с бактериологическими осложнениями зарегистрировано достоверное (р 0,05) увеличение среднего количества лейкоцитов до 11652±4838 (медиана- 11293) кл/мкл, которое превышало число лейкоцитов в контрольной группе (6384,2 кл/мкл) в 1,8 раза; 25%о составил 6925кл/мкл, 75%о -14915 кл/мкл. У пациентов контрольной группы 25%о составил 4990 кл/мкл, а 75 %о - 7580 кл/мкл (рис.19 А). Числа нейтрофилов превышало аналогичный показатель в контрольной группе в 2,1 раза и составил 11597,2 ± 5313,1 (медиана-11210) кл/мкл; 25%о-й составил 7050 кл/мкл. При этом 75-й %о составил 13850 кл/мкл, т.е. больше, чем в 50% наблюдений содержание ней-трофилов превысило верхнее значение референтного интервала - 5800 кл/мкл. У пациентов контрольной группы среднее количество нейтрофилов изменялось в пределах референтных значений и составило 5510,9±2152 (медиана-4976) кл/мкл (рис.19 Б).
При этом у пациентов 1гр. 25-й %о составил 8%, а 75-й %о - 25%. В результате, 58% наблюдений превысили верхнюю границу референтных значений, которая составляет 15%. Среднее значение показателя спНСТ - теста у пациентов 1гр. превысило среднее значение показателя у пациентов контрольной группы на 23%, однако различия по группам не достоверны (рис. 19 В).
Среднее значение ИРИ у пациентов 1 гр. и пациентов контрольной группы составило 2,5±1,1 (медиана 2,4) и 2,1±0,7 (медиана 2,0: 25-й %о составил 1,6, а 75-й %о 2,5), соответственно. Средний показатель соотношения у пациентов 1 гр. на 19,0% превышал показатель у пациентов контрольной группы, значение 25- го%о и 75- го%о составили 1,7, и 3,2, соответственно, при этом больше 50% наблюдений находятся выше 2,3 (уровень нормы). У пациентов контрольной группы 73% наблюдений находились в пределах референтных значений. Необходимо отметить, что в обеих группах ИРИ определялся, как правило, выше 1,0 (рис.19Г).
Содержание CD8+лимфоцитов у пациентов 1 гр. и пациентов контрольной группы существенно не отличалось и составляло в среднем 110,8 (медиана 76,0; 25-й %о - 40,0, а 75-й %о -141,0) и 114,6 (медиана 111,0; 25-й %о -86,0, а 75-й %о -137,0) кл/мкл, соответственно.
Количество В-лимфоцитов у пациентов контрольной и 1 групп изменялось в широком диапазоне и составляло в среднем 333,2±206,0 (медиана 190,0) и 227,4±111,2 (медиана 162,0) кл/мкл, соответственно, достоверных различий не выявлено. Число NK-клеток у пациентов 1 и контрольной групп регистрировали ниже интервала референтных значений: 64,5±25,8 (медиана-48,0) и 55,3±36,2(медиана 44,0) кл/мкл, соответственно. Различий в содержании NK- клеток по группам не выявлено.
По результатам ROC- анализа наибольшая площадь под кривой (AUC) для лейкоцитов составила 0,71, для нейтрофилов - 0,87, что подтверждает хорошую диагностическую значимость этих показателей. При оценке с помощью ROC-анализа спНСТ- теста, площадь под кривой составила 0,5, что позволяет считать диагностическую значимость данного показателя низкой (рис.20). Высокой чувствительностью и специфичностью для диагностики бактериального воспалительного процесса обладало число лейкоцитов и ней-трофилов. Значение ИРИ при высокой чувствительности, обладало низкой специфичностью (табл.6).
Таким образом, выявлено, что у пациентов с бактериальными осложнениями диагностическое значение имели в сравнении с контрольной группой в те же сутки число лейкоцитов и нейтрофилов .
Анализ показателей, вошедших в диагностический комплекс для пациентов с бактериальными осложнениями, на 2 сутки после ТП выявил прогностически значимые изменения у 65,7% пациентов. В период клинических проявлений бактериального воспаления диагностически значимые изменения двух указанных показателей определялись у 78% пациентов этой группы, у 22% пациентов содержание нейтрофилов и ИРИ регистрировалось в пределах референтных значений. Содержание CD8+ и В-лимфоцитов, число NK-клеток было сопоставимо по значениям с контрольной группой.
Похожие диссертации на Иммунологический мониторинг пациентов после трансплантации печени
