Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Радиационные эффекты в системе нейтрофильных гранулоцитов человека и возможности их модификации .13
1.1. Основные закономерности иммунных ответов на действие ионизирующей радиации 14
1.2. Роль нейтрофильных гранулоцитов в поддержании генетического гомеостаза организма
1.3. Система нейтрофильных гранулоцитов у лиц, подвергшихся радиационному воздействию .22
1.4. Радиочувствительность отдельных функций нейтрофильных гранулоцитов 34
1.5. Модификация радиационно-индуцированных нарушений системы нейтрофильных гранулоцитов .39
1.5.1. Применение цитокинов для лечения радиационно-индуцированных нейтропений .39
1.5.2. Применение стволовых клеток для лечения радиационно-индуцированных нейтропений
Глава 2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Характеристика обследованных лиц 47
2.2. Методы исследования 54
2.2.1. Получение лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов 54
2.2.2. Оценка функциональной активности и апоптоза нейтрофилов периферической крови, а также содержания КСФ-Г и КСФ-ГМ в сыворотке крови .55
2.2.3. Исследование реакции нейтрофилов периферической крови у лиц группы сравнения на острое -облучение in vitro 63
2.2.4. Применение фетальных ГК для коррекции отдаленных нейтропений у облученных лиц .63 2.3. Методы статистической обработки данных 65
Глава 3. Влияние хронического радиационного воздействия на систему нейтрофильных гранулоцитов ..68
3.1. Состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у жителей прибрежных сел реки Теча в отдаленные сроки 68
3.1.1. Функциональная активность и интенсивность апоптоза нейтрофилов периферической крови у облученных лиц .68
3.1.2. Функциональная активность нейтрофилов у лиц, перенесших ХЛС, и имеющих отдаленную нейтропению .80
3.2. Влияние факторов радиационной и нерадиационной природы на состояние нейтрофилов периферической крови 87
3.2.1. Зависимость выявленных изменений от дозы и мощности дозы облучения ККМ .87
3.2.2. Влияние нерадиационных факторов на систему нейтрофильных гранулоцитов у облученных лиц .92
3.3. Зависимость функциональных параметров нейтрофильных гранулоцитов периферической крови человека от дозы острого -излучения in vitro 95
3.4. Влияние фетальных гемопоэтических клеток (ГК) на функциональное состояние системы нейтрофильных гранулоцитов у облученных лиц в условиях нейтропении 104
Заключение .115
Выводы .128
Практические рекомендации .130
Список сокращений .131
Список литературы .133
- Роль нейтрофильных гранулоцитов в поддержании генетического гомеостаза организма
- Применение цитокинов для лечения радиационно-индуцированных нейтропений
- Получение лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов
- Функциональная активность и интенсивность апоптоза нейтрофилов периферической крови у облученных лиц
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Одной из важнейших проблем современной иммунологии является анализ влияния различных экологических факторов на иммунный ответ, а также на развитие иммунодефицитов и иммунозависимой патологии. Особенно велико значение данной проблемы в современных условиях возрастающей техногенной нагрузки на окружающую среду (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.М. Экологическая иммунология. М.: ВНИРО, 1995. 219 c.; Черешнев В.А. Будущее Российского Севера: доктринальные основы социальной и экологической региональной политики. Вестник Уральской медицинской академической науки. 2005. № 2. С. 54-56.; Смолягин А.И и др. Экспериментальное исследование влияния бензола и хрома на иммунную систему организма. Иммунология. 2013. № 1. С. 57-60.).
В настоящее время особо пристальное внимание привлекают медико-
биологические эффекты хронического радиационного воздействия с низкой
мощностью дозы, что обусловлено широким использованием источников
ионизирующей радиации (ИР) в промышленности, сельском хозяйстве,
медицине и науке. Значительный интерес к проблеме реакций иммунной
системы на хроническое радиационное воздействие также обусловлен
реальной возможностью пролонгированного облучения человека (например,
космонавтов в условиях длительных полетов, населения при
террористических актах или после радиационных аварий) (Recommendations of the International Commission on Radiological Protection. Аnnals of the ICRP. 2007. ICRP Publication 103. 332 p.). Как показала авария на АЭС Фукусима-1, современные технологии не в состоянии обеспечить безаварийную работу ядерных реакторов, что может привести к загрязнению обширных территорий радионуклидами, в том числе долгоживущими, и длительному облучению проживающего на них населения.
Необходимо отметить, что в ряде стран (Китай, Индия, Бразилия,
Иран и др.) имеются регионы, многие поколения жителей которых
подвергаются облучению вследствие повышенного естественного
радиационного фона (Boice J.D. et al. Low-dose rate epidemiology of high
background radiation areas. Radiat Res. 2010. Vol. 173, № 6. P. 1-6.). Уклад
жизни современного человека способствует длительному пребыванию людей
в помещениях, где могут создаваться достаточно высокие концентрации
радона (Darby S. et al. Radon in homes and risk of lung cancer: collaborative
analysis of individual data from 13 European case-control studies. BMJ. 2005. Vol.
330. P. 223-227.). Все это делает проблему хронического низкоинтенсивного
радиационного воздействия на иммунную систему современного человека
чрезвычайно актуальной и определяет ее как приоритетную в деятельности
таких международных организаций, как Всемирная организация
здравоохранения (ВОЗ), Международная комиссия по радиологической защите (МКРЗ), Научный комитет по действию атомной радиации Организации Объединенных Наций (НКДАР ООН) и других.
К настоящему времени получены клинические и экспериментальные данные, свидетельствующие о высокой радиочувствительности иммунной системы (UNSCEAR 2006 Report. Effects of ionizing radiation. New York: United Nations. 2009. Vol. 2. 334 p.). При этом важно отметить, что наиболее хорошо изученными являются ответы иммунной системы человека на острое облучение в высоких дозах (Черешнев В.А. и др. Иммунология комбинированных радиационных поражений. Екатеринбург: Издательство, 1997. 164 с.; Гребенюк А.Н., Легеза В.И. Противолучевые свойства интерлейкина-1. СПб.: Фолиант. 2012. 216 с.), тогда как отдаленные эффекты хронического облучения с низкой мощностью дозы остаются мало исследованными. Имеющиеся результаты показывают, что хроническое радиационное воздействие может индуцировать реакции не только со стороны адаптивного, но и врожденного иммунитета (Godekmerdan A. et al. Diminished cellular and humoral immunity in workers occupationally exposed to low levels of ionizing radiation. Arch Med Res. 2004. Vol. 35. P. 324-328.; Кириллова Е.Н. и др. Иммунный статус у работников ПО «Маяк» и жителей г. Озерска. Вопросы радиационной безопасности. 2006. № 2. С. 13-23.). Более того, иммуносупрессия, развивающаяся после хронического облучения, может сохраняться длительное время (Pecaut M.J., Nelson G.A., Gridley D.S. Dose and dose rate effects of whole-body gamma-irradiation. Lymphocytes and lymphoid organs. In Vivo. 2001. Vol. 15. P. 195–208.).
По мнению Генеральной Ассамблеи ООН (2011) наиболее важным
источником информации об эффектах хронического облучения человека
является наблюдение за жителями прибрежных сел реки Теча, которые
подверглись многолетнему радиационному воздействию с низкой
мощностью дозы, но в широком диапазоне доз вследствие сбросов жидких радиоактивных отходов (ЖРО) комбинатом «Маяк» в реку Теча. По результатам эпидемиологических исследований у них отмечен повышенный радиационный риск заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей и лейкозов (Krestinina L.Y. et al. Leukaemia incidence in the Techa River Cohort: 1953-2007. BJC. 2013. Vol. 109. P. 2886-2893.; Schonfeld S. et al. Solid cancer mortality in the Techa River Cohort (1950-2007). Radiat Res. 2013. Vol. 179. P. 183-189.).
Исходя из важной роли нейтрофилов в поддержании генетического
гомеостаза, а также в реализации иммунного надзора и противоопухолевой
защиты организма (Долгушин И.И, Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю.
Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса
нейтрофилов. М.: Издательство РАМН, 2009. 207 с.) представляло интерес
исследование функционального состояния системы нейтрофильных
гранулоцитов у жителей прибрежных сел реки Теча в отдаленном периоде,
когда реализуются соматико-стохастические эффекты. Важность
исследования определялась также тем, что в условиях длительного сочетанного воздействия внешнего - и внутреннего -излучения дозы на
красный костный мозг (ККМ), который является центральным органом иммунопоэза, достигали высоких значений (9 Гр).
Цель исследования
Изучить функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у жителей прибрежных сел реки Теча в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия.
Задачи исследования
-
Оценить показатели функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в отдаленные сроки у лиц, подвергшихся хроническому облучению в широком диапазоне доз облучения красного костного мозга. Исследовать их зависимость от мощности дозы и кумулятивной дозы облучения красного костного мозга, а также факторов нерадиационной природы (пол, этническая принадлежность, возраст на время облучения и исследования, наличие сопутствующей патологии, сезон исследования).
-
Исследовать интенсивность апоптоза нейтрофилов периферической крови, их способность образовывать внеклеточные ловушки, а также содержание гранулоцитарного и гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующих факторов в сыворотке крови у облученных лиц.
-
Изучить зависимость показателей адгезивной, фагоцитарной, лизосомальной активности, параметров внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови, интенсивности их апоптоза и способности образовывать внеклеточные ловушки in vitro от дозы острого -излучения у лиц пожилого возраста.
-
Исследовать влияние фетальных гемопоэтических клеток на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у облученных лиц с нейтропенией.
Методология и методы исследования
Исследование выполнено в соответствии с плановой тематикой научно-
исследовательских работ ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ в рамках
комплексной темы «Роль нейтрофилов в регуляции иммунитета,
антимикробной и антистрессорной резистентности организма» (№
государственной регистрации 01201153155). Исследование являлось рандомизированным. Исследуемую группу составили 318 жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся многолетнему радиационному воздействию в широком диапазоне доз на ККМ (0,08-4,69 Гр, средняя поглощенная доза – 1,09±0,05 Гр). По реакции гранулоцитарного ростка на облучение были выделены подгруппы людей, перенесших ХЛС (37 человек; средняя поглощенная доза – 0,73±0,1 Гр) и облученных лиц, имевших на время обследования нейтропению (25 человек; средняя поглощенная доза –
1,43±0,21 Гр). Группу сравнения составили 134 человека аналогичного возраста и пола, проживавших в тех же административных районах, доза облучения которых согласно НРБ – 99-2009 не превышала допустимые пределы для населения России.
Исследование функциональной активности нейтрофилов
периферической крови проводилось с использованием современных иммунологических методов. В целях изучения радиочувствительности отдельных функций нейтрофилов человека данные клетки, выделенные из периферической крови в составе лейкоцитарной взвеси или чистой фракции, in vitro подвергались острому -облучению в дозах 0,1; 0,25; 1; 4 и 10 Гр. Кроме того, в рамках ограниченного клинического исследования, проведенного в ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России, проспективно оценивалось влияние фетальных ГК на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у пациентов с отдаленной нейтропенией. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ФГБУН УНПЦ РМ (Протокол от 17.03.2008 года).
Статистическая обработка полученных данных проводилась методами непараметрической статистики с использованием пакетов прикладных программ Statistica 6.0 и SPSS 22.0.
Степень достоверности, апробация результатов и личное участие
автора
Достоверность полученных результатов обусловлена достаточным объемом выборки, четко сформулированными критериями включения-исключения в исследование, подбором сопоставимой по нерадиационным факторам группы сравнения, использованием адекватных поставленным задачам иммунологических методов исследования и современного сертифицированного оборудования, применением современных методов статистического анализа.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 9-ой
Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011 г.),
Международной конференции «Медико-биологические проблемы действия
радиации» (Москва, 2012 г.), 13-th International Congress of the International
Radiation Protection Association (Glasgow, Scotland, 2012), 10-ой Российской
конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012 г.), 57-th annual meeting of
the Health Physics Society (Sacramento, USA, 2012), 7-ой Всероссийской
конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г.
Челябинске» (Челябинск, 2012 г.), 39-th annual meeting of the European
Radiation Research society (Italy, Vietri sul Mare, 2012), Региональной научно-
практической конференции, посвященной 15-летию биологического
факультета ЧелГУ (Челябинск, 2013 г.), 4-ой Международной научно-
практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2013 г.), Global
Conference on Radiation Topics (Germany, Munich, 2013), 8-ой Всероссийской
конференции с международным участием «Иммунологические чтения»
(Челябинск, 2013 г.).
Автор принимал непосредственное участие в разработке дизайна
исследования, формулировании его цели и задач. Автором лично проведен
анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой
проблеме, сформированы исследуемые группы, проведено
иммунологическое исследование, анализ и статистическая обработка первичных данных, их интерпретация, результаты представлены в научных публикациях и докладах на конференциях, подготовлена диссертация.
Положения, выносимые на защиту
-
Система нейтрофильных гранулоцитов человека в условиях хронического облучения красного костного мозга (максимальная поглощенная доза 4,69 Гр) обладает достаточно высокой радиорезистентностью.
-
Адгезивная, фагоцитарная, лизосомальная активность, внутриклеточный кислородзависимый метаболизм и апоптоз нейтрофилов периферической крови человека in vitro характеризуются высокой толерантностью к острому -излучению, тогда как способность активированных пирогеналом нейтрофилов образовывать внеклеточные ловушки стимулируется малыми дозами радиации (0,1 Гр).
-
Инфузия фетальных гемопоэтических клеток облученным лицам с нейтропенией (доза 1,4106/кг массы тела пациента) на фоне кратковременного повышения относительного содержания нейтрофилов в крови и сывороточного гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора вызывает угнетение их фагоцитарной активности.
Научная новизна
Впервые в отдаленные сроки (через 60 и более лет после начала облучения) у жителей прибрежных сел реки Теча, включая лиц, перенесших ХЛС, и имеющих в отдаленные сроки нейтропению, был проведен комплексный анализ системы нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, который включал оценку их функционального состояния, интенсивности апоптоза и способности образовывать внеклеточные ловушки. На фоне снижения числа нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови у облученных лиц установлено компенсаторное повышение уровня КСФ-ГМ в сыворотке крови. Нарушения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов (супрессия лизосомальной активности и активация внутриклеточного кислородзависимого метаболизма) были наиболее выраженными у облученных людей с нейтропенией. Спонтанная интенсивность апоптоза и способность нейтрофилов периферической крови образовывать внеклеточные ловушки у облученных лиц в отдаленные сроки не отличались от таковых в группе сравнения. Выявленные изменения в системе нейтрофильных гранулоцитов, как правило, не зависели от мощности и дозы облучения ККМ, что свидетельствовало о существенном
влиянии в отдаленном периоде факторов нерадиационной природы. Не получено убедительных доказательств, что отдаленная нейтропения у облученных лиц является следствием угнетения гранулоцитопоэза в период максимального радиационного воздействия.
Впервые исследована зависимость интенсивности апоптоза
нейтрофилов периферической крови и их способности образовывать внеклеточные ловушки in vitro от дозы острого -излучения. Установлено, что активация нейтрофилов пирогеналом стимулирует образование НВЛ при облучении в малых дозах (0,1 Гр), тогда как средние (0,25 и 1 Гр) и большие (4 и 10 Гр) дозы не влияли на способность активированных нейтрофилов образовывать НВЛ. Не было отмечено влияния -излучения в диапазоне доз 0,1-10 Гр на интенсивность апоптоза нейтрофилов у пожилых людей in vitro.
Впервые по результатам проспективного наблюдения (более трех лет) оценено влияние фетальных ГК на функциональное состояние нейтрофилов периферической крови у пациентов с нейтропенией. Отмечено существенное снижение активности фагоцитоза нейтрофилов, достигавшей минимальных значений через 13-36 мес. после введения фетальных ГК.
Теоретическая и практическая значимость работы
Исследование позволило оценить функциональное состояние
нейтрофильных гранулоцитов у людей, подвергшихся хроническому
облучению в широком диапазоне доз на фоне инволюционных процессов.
Значимость работы определяется комплексным анализом системы
нейтрофильных гранулоцитов человека после многолетнего облучения ККМ,
что позволяет оценить возможную роль этой системы в формировании
отдаленных радиационных последствий. В исследованиях in vitro показано,
что функциональная активность зрелых нейтрофильных гранулоцитов
является достаточно резистентной к действию острого -излучения.
Выявленное иммуносупрессивное действие фетальных ГК предполагает
разработку строгих показаний для терапии стволовыми клетками (СК) и
регулярный мониторинг функционального состояния нейтрофилов
периферической крови.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования используются в учебной деятельности на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, на кафедре радиобиологии ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет» Министерства образования и науки РФ, а также в практической деятельности ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины» Федерального медико-биологического агентства.
Публикации
Соискатель имеет 17 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 13 научных работ общим объемом 3,3 печатных листа, в том числе 4 статьи в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 4 работы в зарубежных научных изданиях; 7 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 159 страницах компьютерного текста и включает 24 таблицы, 15 рисунков, 1 фотографию. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего работы 115 отечественных и 110 иностранных авторов.
Роль нейтрофильных гранулоцитов в поддержании генетического гомеостаза организма
Хорошо известно, что нейтрофилы, которые являются фагоцитирующими клетками врожденного иммунитета и обеспечивают первую линию защиты организма от инфекций, представляют самую многочисленную популяцию лейкоцитов. Жизненный цикл предшественников и зрелых нейтрофилов длится 10-15 дней, время нахождения в крови колеблется в пределах 6-12 часов, в тканях – до 5 суток [20]. Нейтрофилы наделены рядом свойств (высокая мобильность, способность к адгезии, наличие большого спектра бактерицидных и цитотоксических продуктов), позволяющих им быстро мигрировать в ткани, эффективно распознавать, поглощать, убивать и переваривать микробные клетки [27, 72]. На ведущую роль нейтрофилов в противоинфекционном иммунитете указал И.И. Мечников, отводя особую роль в элиминации патогенов фагоцитарному процессу. В последующие годы был проведен ряд фундаментальных работ, позволивших подробно исследовать особенности ультраструктуры, метаболизма нейтрофилов, а также описать свойства и функции этих клеток [10, 29, 54, 127, 147, 162]. В настоящее время установлено, что помимо бактерицидных и цитотоксических продуктов нейтрофилы продуцируют целый спектр биологически активных веществ: хемокины, провоспалительные цитокины: ФНО, ИЛ-1, ИЛ-8, ИЛ-12, ИНФ, КСФ-ГМ, простагландины, лейкотриены, различные ферменты, низко- и среднемолекулярные пептиды, гормоны, пептиды-антибиотики и другие [71, 72, 98, 99, 115], что позволяет им активно влиять на функции макрофагов, лимфоцитов, эозинофилов, эндотелиоцитов, фибробластов, систему комплемента, калликреин кининовую систему, систему фибринолиза, а также оказывать влияние на функционирование отдельных органов и систем [25]. Особая роль в реализации противомикробной активности нейтрофилов принадлежит пептидам-антибиотикам: -дефенсинам и кателицидинам. Данные субстанции, секретируясь во внеклеточную среду, помимо антимикробной активности могут способствовать развитию гуморального и клеточного иммунного ответа [98]. Кроме того, благодаря своим уникальным свойствам, а также наличию на поверхности клеточной мембраны большого количества рецепторов к различным биологически активным веществам, нейтрофилы быстро реагируют на малейшие изменения постоянства внутренней среды организма, изменяя свою метаболическую активность, модифицируя биоцидные и цитотоксические функции, а также перестраивая ультраструктуру. Это является необходимым условием для немедленного ответа клетки на генетически чужеродный объект, поступивший в организм [20].
По всей видимости, основными функциями нейтрофильных гранулоцитов являются биоцидная (реализуется в процессах фагоцитоза и секреции), цитотоксическая (основной механизм - антителозависимая клеточная цитотоксичность) и регуляторная. Для осуществления этих функций нейтрофил должен обладать рядом свойств, которые условно делят на три группы: аффекторные (восприятие сигналов), интегративные (трансформация сигналов и развитие пострецепторных событий в клетке) и эффекторные (хемотаксис, адгезивная способность, поглощение и внутриклеточное переваривание, секреторная дегрануляция и метаболический взрыв) [19]. В последние годы появились сообщения, указывающие на неоднозначную роль нейтрофильных гранулоцитов в реализации противоопухолевой защиты организма. С одной стороны известно, что нейтрофилы играют ведущую роль в обеспечении противоопухолевого иммунитета за счет способности распознавать опухолевые клетки, контактно взаимодействовать с ними, и запускать в них процессы апоптоза, либо лизировать их по механизму антителозависимой клеточной цитотоксичности [58, 130, 131, 152, 153]. С другой стороны, нейтрофильные гранулоциты под влиянием опухолевого микроокружения могут секретировать факторы роста, стимулировать продукцию эндотелиоцитами факторов ангиогенеза, тем самым способствуя инвазивному росту опухоли и ее васкуляризации [58, 128,195], а селектин-опосредованная адгезия атипичных клеток к мембране нейтрофильных гранулоцитов может способствовать их гематогенной диссеминации [209].
Для восприятия сигналов и осуществления своих функций нейтрофилы имеют богатый рецепторный аппарат. Многообразие рецепторов нейтрофилов описано в ряде монографий [25, 27, 71, 98, 175, 184]. Для нейтрофильных гранулоцитов характерным является наличие цитоплазматических гранул, в состав которых входят ферменты, позволяющие клетке перемещаться в тканях и деградировать поглощенные патогены, рецепторы, широкий спектр биоцидных субстанций, флавоцитохромы и другие вещества. Состав нейтрофильных гранул также подробно описан в ряде работ [72, 138, 225]. Исходя из вышесказанного становится понятным, что нарушения со стороны хотя бы одной из функций нейтрофилов могут привести возникновению целого ряда патологических состояний [61, 172]. Значимость нейтрофильного звена врожденного иммунитета в жизнедеятельности организма становится отчетливо видна при развитии нейтропений, сопровождающихся целым комплексом инфекционно-воспалительных заболеваний, приводящих нередко к летальному исходу [172]. В настоящее время известно, что для осуществления своих функций нейтрофильные гранулоциты находятся в тесной кооперации с другими клетками иммунной системы, а также с эндотелиоцитами [25, 115]. В недавних исследованиях с использованием метода проточной цитометрии было показано, что примерно 25% нейтрофилов периферической крови ассоциировано с тромбоцитами, образуя, так называемые, тромбоцитарно-нейтрофильные комплексы, увеличение которых в крови отмечено в экспериментальной модели системного воспаления [191]. В последние годы появляются работы, свидетельствующие о функциональной неоднородности популяции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови [15]. Так, по активности НАДФН-оксидазной системы и различиям в адгезивной способности популяция нейтрофилов была разделена на два класса: нейтрофилы-киллеры и нейтрофилы-кейджеры. Нейтрофилы–киллеры обладают высокой НАДФН-оксидазной активностью и способностью активно продуцировать АФК, поэтому их относят к потенциальным фагоцитам, в то время как нейтрофилы-кейджеры обладают меньшей способностью продуцировать АФК и, вероятно, выполняют транспортную функцию, доставляя фагоцитированные частицы в определенные органы. К нейтрофилам-киллерам относятся клетки маргинального пула, а также часть клеток циркулирующего пула (примерно 82,5% от всей популяции нейтрофилов периферической крови). Известно, что нейтрофилы подвергаются апоптозу вследствие лишения их контакта с субстратом. Поскольку способностью прикрепляться к субстрату обладают, в основном, нейтрофилы-киллеры, то это означает, что путем апоптоза погибают, как правило, представители данной субпопуляции нейтрофилов [15]. В 2004 году группой исследователей во главе с A. Zychlinsky был описан процесс образования активированными нейтрофилами фибриллярных внеклеточных структур, названных впоследствии нейтрофильными внеклеточными ловушками (НВЛ) [127]. При исследовании структуры и состава НВЛ было установлено, что они образованы ядерной ДНК в комплексе с гистоновыми белками и ферментами нейтрофильных гранул. Активацию нейтрофилов и образование ими ловушек эффективно индуцируют ИЛ-8, форбол-миристат-ацетат, липополисахариды грам отрицательных бактерий [28, 81, 82, 147]. Результаты экспериментальных исследований показали, что НВЛ в избытке имеются в очагах воспаления. Предположительно, НВЛ выполняют следующие функции: фиксация грам положительных и грам-отрицательных бактерий, их киллинг, деградация факторов патогенности, поддержание высокой локальной концентрации антимикробных агентов, создание физического барьера, препятствующего дальнейшему распространению микроорганизмов из очага инфекции, кроме того, секвестрация гранулярных протеинов в НВЛ препятствует их диффузии и предотвращает повреждение тканей за пределами очага воспаления [127]. Вместе с тем, НВЛ могут также оказывать вредное влияние на организм хозяина, поскольку формирование экстрацеллюлярных гистоновых комплексов способно играть роль в развитии аутоиммунных заболеваний, например, системной красной волчанки [127]. К настоящему времени изучено влияние целого комплекса факторов физической, химической и биологической природы на способность нейтрофилов образовывать внеклеточные ловушки [16, 27, 30, 81, 82, 108]. Однако данных о влиянии ИР на способность нейтрофилов формировать НВЛ в доступной литературе найдено не было.
Применение цитокинов для лечения радиационно-индуцированных нейтропений
Исследования, посвященные терапии радиационно-индуцированной миелосупрессии при помощи цитокинов, немногочисленны. Показано, что свойствами стимулировать гемопоэз и иммунопоэз обладают ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-6, КСФ-Г, КСФ-ГМ, эритропоэтин, тромбопоэтин, фактор стволовых клеток, ФНО [160, 183, 185]. Первые попытки применения колониестимулирующих факторов для коррекции нейтропении были предприняты еще в 1970-х годах [7]. В современной литературе, в основном, описано применение данных цитокинов для коррекции нарушений гемопоэза, развившихся вследствие острого радиационного воздействия [74, 79, 83, 129, 158, 193, 224]. Однако отдаленные эффекты применения цитокинов на состояние иммунной системы не изучены [133]. Исследований, демонстрирующих эффективность цитокинотерапии для лечения нейтропений после хронического облучения и, особенно, в отдаленные сроки, в доступной литературе не встречалось. Группа препаратов цитокинового ряда, способных стимулировать гемопоэз и, в частности, гранулоцитопоэз, в настоящее время представлена: препаратами КСФ-Г и КСФ-ГМ, ИЛ-1, ИНФ, тромбопоэтина. До настоящего времени не исследована эффективность цитокинов в терапии нейтропений нетерапевтического генеза у человека. Оценка их эффективности проводилась, в основном, в экспериментах на животных, а также у онкологических больных с радиационно-индуцированными нейтропениями и, в единичных случаях, у лиц, пострадавших в результате радиационных аварий [133].
Возможность использования препаратов КСФ-Г и КСФ-ГМ с целью коррекции радиационно-индуцированной миелосупрессии связана с их способностью повышать выживаемость костномозговых предшественников нейтрофилов, а также стимулировать их пролиферативную активность и способность к последующей дифференцировке. Кроме того, КСФ-Г и КСФ-ГМ способны повышать функциональную активность зрелых нейтрофилов [171, 219]. Данные препараты существенно ускоряют восстановление числа нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови к 3-6 суткам у пациентов после интенсивной миелосупрессивной терапии, в том числе при трансплантации ККМ и ГСК [163, 182, 201]. В экспериментах на мелких и крупных лабораторных животных (мыши и собаки) с использованием разных типов облучения (гамма-, рентгеновское, нейтронное, протонное) было показано, что препараты КСФ-Г оказывают стимулирующее влияние на гранулоцитопоэз, уменьшая частоту развития радиационно-индуцированной нейтропении, снижая ее выраженность и уменьшая длительность проявления, ослабляя проявления ОЛС и, в конце концов, повышая выживаемость облученных животных [79, 83, 196, 224]. При этом отмечается, что у облученных мышей под влиянием терапии КСФ-Г способность нейтрофилов периферической крови образовывать АФК и экспрессировать маркеры активации (CD11b и CD18) не нарушаются [196]. В настоящее время, КСФ-Г рассматривается в качестве наиболее перспективного средства активной терапии, направленной на восстановление гранулоцитопоэза при ОЛС и других состояниях, сопровождающихся нейтропенией [9, 133]. В экспериментах на собаках, облученных в дозе 4 Гр, выявлена большая эффективность терапии гематологических нарушений с использованием КСФ-Г, чем КСФ-ГМ [133]. Однако применение КСФ-Г не способствовало стимуляции гемопоэтической функции ККМ при облучении животных в дозе 6 Гр [180, 203]. На основе КСФ-Г в настоящее время создан препарат пролонгированного действия «Пегфилграстим», обладающий способностью более активно и в течение более длительного времени стимулировать гранулоцитарный росток кроветворения [196]. Сегодня препараты на основе КСФ разрешены в США для использования в качестве стимуляторов гранулоцитопоэза при нейтропениях, однако ни один из этих препаратов пока не одобрен для лечения радиационно-индуцированной аплазии ККМ [133]. Считается, что большой вклад в персистенцию нарушений иммунного статуса в период отдаленных последствий облучения вносит дефект со стороны Т-лимфоцитов [133]. Дефекты Т-звена, возможно, вовлечены в механизмы нарушений со стороны других звеньев иммунной системы, в том числе системы нейтрофильных гранулоцитов. В настоящее время установлено, что ряд цитокинов, таких как ИЛ-2, 4, 7, 17, c-kit – лиганд, flt-3 (FL), тимический стромальный лимфопоэтин и фактор роста кератиноцитов связаны с дифференцировкой, пролиферацией и восстановлением функциональной активности Т-клеток [118, 154]. Из них ИЛ-7, тимический стромальный лимфопоэтин, FL и фактор роста кератиноцитов рассматриваются как потенциальные терапевтические агенты для ускорения тимопоэза и, в конечном счете, восстановления иммунной системы [133]. Предполагается, что комбинированные препараты будут значительно более эффективными для терапии нейтропений. Так, «Прогенипоэтин» (содержит FL и КСФ-Г) в большей степени ускоряет восстановление нейтрофильного звена после острого облучения, чем FL и КСФ-Г в отдельности. Такой же эффективной в отношении восстановления нейтрофильного звена как «Прогенипоэтин» оказалась комбинация FL и КСФ-Г [133]. Применение комплекса цитокинов (FL, тромбопоэтин, ИЛ-3), обладающих антиапоптотической активностью, для терапии гемопоэтических и иммунных нарушений у мышей спустя 2 и 24 часа после тотального облучения в дозе ЛД90 существенно повышало раннюю выживаемость облученных животных [151]. Необходимым условием эффективного использования данных препаратов для восстановления иммунного статуса и кроветворной функции ККМ после острого радиационного воздействия является их применение в самые ранние сроки после облучения [133].
Получение лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов
Забор крови у пациентов проводился утром, натощак из кубитальной вены в шприц с гепарином в объеме 5 мл. Для выделения лейкоцитарной взвеси из периферической крови в центрифужной пробирке смешивали 3 мл цельной гепаринизированной крови с 2,5 мл 1% раствора желатина. Кровь с желатиной инкубировали в термостате в течение 1 часа при температуре 37С. После инкубации лейковзвесь дозатором переносили в сухую центрифужную пробирку. Клетки трижды отмывали раствором Хэнкса путем центрифугирования со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 7 минут, после чего надосадочную жидкость сливали, а лейкоциты ресуспендировали в 3 мл среды 199. Концентрация клеток в среде, подсчитанная в камере Горяева, составляла 2106 клеток/мл. По 1 мл стандартизованной клеточной суспензии помещали в 3 пробирки – «сапожка»: 1-ая пробирка использовалась для постановки спонтанного НСТ-теста; 2-ая пробирка – для фагоцитоза и индуцированного НСТ-теста; 3-я пробирка – для оценки лизосомальной активности нейтрофилов. На дне пробирок предварительно размещалась половина покровного стекла. Пробирки инкубировались в термостате при 37С в течение 1 часа. После инкубации клетки дважды отмывались средой 199. При этом хорошо адгезирующиеся клетки (нейтрофилы, моноциты) оставались на стекле, а слабо адгезирующиеся (лимфоциты) удалялись. После второго отмывания в каждую пробирку – «сапожок» добавлялся 1 мл среды 199. Далее лейковзвесь использовалась для оценки фагоцитарной, лизосомальной активности и проведения НСТ-теста. Выделение чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов проводили в стерильных условиях путем центрифугирования предварительно разбавленной физиологическим раствором венозной крови (соотношение крови и физиологического раствора 2:3) на двойном градиенте плотности фиколл-урографина (Serva, Germany; Schering, Germany) в течение 40 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077 г/мл, нижнего – 1,093-1,095 г/мл. Выделенные клетки двукратно отмывали стерильным физиологическим раствором в течение 7 минут при 1500 оборотах в минуту, после чего их концентрацию в суспензии доводили до 5106 клеток/мл. Полученная таким образом чистая фракция нейтрофилов использовалась для определения адгезивной способности, интенсивности апоптоза нейтрофилов и их способности образовывать внеклеточные ловушки.
Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови во вторую пробирку – «сапожок» добавляли 100 мкл рабочего раствора латекса, после чего содержимое пробирки тщательно перемешивали и клетки инкубировали в течение 30 минут при 37С [95]. Учет проводили с помощью микроскопа Axio Imager. A2 (Carl Zeiss, Germany) в световом режиме. Объектив – 63, окуляр – 10. Подсчитывалось число нейтрофилов, захвативших частицы латекса, на 100 клеток. Этот показатель определялся как активность фагоцитоза нейтрофилов – АФН. Также оценивалось число поглощенных частиц латекса в 100 подсчитанных нейтрофилах – интенсивность фагоцитоза нейтрофилов (ИФН). Фагоцитарное число определялось как отношение показателей интенсивности и активности фагоцитоза этих клеток и характеризовало среднее число частиц латекса, захваченное одним фагоцитировавшим нейтрофилом. Оценка внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов проводилась путем постановки НСТ-теста в модификации А.Н. Маянского и М.К. Виксмана (1979) [53]. В первую пробирку - «сапожок» (спонтанный НСТ-тест) ничего не добавляли. Во вторую пробирку (индуцированный НСТ-тест) добавляли 100 мкл рабочего раствора латекса, затем содержимое пробирки тщательно перемешивали. Обе пробирки помещали в термостат и инкубировали 30 минут при температуре 37С. Чистое предметное стекло, разделенное стеклографом на две половины соответственно спонтанному и индуцированному НСТ-тесту, помещалось в чашку Петри. На каждую половину наносили реактив НСТ. Рабочий раствор НСТ готовился заранее и хранился в морозильной камере при температуре -20С. После инкубации лейкоцитов обе пробирки извлекались из термостата, во второй пробирке – «сапожке» (индуцированный НСТ – тест) покровные стекла трижды отмывали от избытка латекса 2 мл физиологического раствора, при последней отмывке физиологический раствор не сливался. Покровное стекло с адгезированными к нему клетками извлекалось из пробирок и укладывалось клетками вниз в каплю реактива НСТ на соответствующую половину предметного стекла. Затем препараты в чашке Петри помещались в термостат на 20 минут при температуре 37С. После инкубации в термостате покровные стекла извлекались из реактива НСТ и располагались параллельно друг другу на заранее приготовленном предметном стекле клетками вверх. Клетки фиксировались 96% раствором этилового спирта, подсушивались. Фиксацию проводили несколько раз в течение 15 минут. Готовые мазки окончательно высушивались и окрашивались рабочим раствором сафранина в течение 3-5 минут. Учет реакции проводили при помощи микроскопа Axio Imager. A2 (Carl Zeiss, Germany) в световом режиме под масляной иммерсией. Объектив – 63, окуляр – 10. Подсчитывалось число НСТ-положительных нейтрофилов на 100 фагоцитов. Лизосомальная активность нейтрофилов оценивалась по методу И.С. Фрейдлин (1986) [96]. Для этого в третью пробирку – «сапожок», содержащую суспензию лейкоцитов, добавляли 200 мкл рабочего раствора акридинового оранжевого, после чего ее интенсивно встряхивали. Затем клетки инкубировали в термостате в течение 30 минут при температуре 37С. После инкубации клетки трижды отмывались 2-мя мл физиологического раствора. При последней отмывке физиологический раствор не сливался. Пробирку помещали в темную камеру. Последующие действия производились в темной комнате. Покровное стекло извлекалось из пробирки – «сапожка» и располагалось на чистом предметном стекле клетками вниз. Лизосомальная активность оценивалась с помощью микроскопа Axio Imager. A2 (Carl Zeiss, Germany) под масляной иммерсией в люминесцентном режиме. Объектив – 100, окуляр – 10. Результаты расчитывались на 100 клеток. Определяли лизосомальную активность нейтрофилов (ЛАН) – процент нейтрофильных гранулоцитов, имеющих лизосомальные гранулы. Затем проводилась полуколичественная оценка содержания лизосом в нейтрофилах (обозначения: «+++» – цитоплазма нейтрофила полностью заполнена лизосомами, «++» – наполовину заполненная лизосомами цитоплазма клетки, «+» – наличие в цитоплазме нейтрофила единичных лизосом). При отсутствии лизосом в цитоплазме клетка считалась «нулевой». Суммарная лизосомальная активность нейтрофилов (СЛАН), характеризующая лизосомальную активность нейтрофилов одного литра крови, расчитывалась по формуле: СЛАН=ЛАН количество нейтрофилов в 1 л крови / 100 (1) Полученный показатель выражался в условных единицах.
Функциональная активность и интенсивность апоптоза нейтрофилов периферической крови у облученных лиц
Как видно из таблицы 3.1, количество лейкоцитов в периферической крови в группе облученных лиц не обнаруживало статистически значимых различий с группой сравнения. В то же время у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, имело место статистически значимое снижение как абсолютного, так и относительного содержания нейтрофилов в периферической крови, что было обусловлено преимущественным снижением числа зрелых сегментоядерных клеток. Доля палочкоядерных нейтрофилов и индекс ядерного сдвига у облученных лиц не отличались от таковых в группе сравнения. При анализе частоты лейкопении и нейтропении у облученных лиц и в группе сравнения (таблица 3.2) было установлено, что случаи умеренной и выраженной лейкопении (число лейкоцитов 4,0109/л и 3,3109/л, соответственно) у облученных лиц встречались с такой же частотой, что и в группе сравнения. Частота случаев умеренной (число нейтрофилов 2,0109/л) и выраженной нейтропении (число нейтрофилов 1,3109/л) у облученных лиц также статистически значимо не отличалась от таковой в группе сравнения. Критерии лейко- и нейтропении соответствовали ранее использовавшимся [2, 80]. Как отмечалось, влияние радиационного воздействия на способность нейтрофилов периферической крови образовывать НВЛ практически не изучено. Вместе с тем показано, что формирование НВЛ является важным механизмом защиты организма от инфекции [27, 82, 108, 127]. В связи с этим, в отдаленные сроки после хронического воздействия ионизирующей радиации, у облученных лиц оценивалась спонтанная и индуцированная способность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови образовывать НВЛ. Как видно из таблицы 3.3, доля различных морфологических форм нейтрофилов (нейтрофилов с сегментированным ядром, нейтрофилов с недифференцированным ядром и НВЛ) при активации препаратом «Пирогенал» и без активации у облученных лиц статистически значимо не отличалась от группы сравнения.
Активация нейтрофильных гранулоцитов у облученных лиц препаратом «Пирогенал» вызывала статистически значимое снижение доли клеток с сегментированным ядром одновременно с увеличением доли клеток с недифференцированным ядром и НВЛ. Аналогичная реакция нейтрофилов периферической крови на стимулирующее влияние препарата «Пирогенал» прослеживалась и у лиц группы сравнения. После активации у них отмечалось снижение доли нейтрофилов с сегментированным ядром, повышение доли НВЛ, а также нейтрофилов с недифференцированным ядром, являющихся непосредственными предшественниками НВЛ [27]. Для оценки частоты случаев выраженного снижения (М-2) и повышения (М+2) различных морфологических форм нейтрофилов в сравниваемых группах, используя референтные значения, оценивалась доля лиц, чьи показатели выходят за пределы данных значений (таблица 3.4). Видно, что частота случаев выраженной супрессии или активации показателей, характеризующих способность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови образовывать внеклеточные ловушки, в сравниваемых группах статистически значимо не отличалась. Исключение составило статистически значимое снижение частоты случаев выраженного повышения доли сегментоядерных нейтрофилов у облученных лиц относительно группы сравнения после активации препаратом «Пирогенал». Как видно из таблицы 3.5, основные показатели, характеризующие функциональную активность нейтрофилов периферической крови (фагоцитарную, лизосомальную и процессы внутриклеточного кислородзависимого метаболизма) у лиц сравниваемых групп статистически значимо не отличались. Средние значения показателей, характеризующих способность нейтрофилов прикрепляться к биосубстратам и мембранам других клеток, в отдаленные сроки у облученных лиц также статистически значимо не отличались от таковых в группе сравнения (таблица 3.6). Принимая во внимание, что среднегрупповые значения показателей не учитывают распределения их индивидуальных значений, в сравниваемых группах была оценена доля лиц, имеющих выраженное угнетение и активацию отдельных функций нейтрофилов периферической крови. В соответствии с рекомендациями ГНЦ Института иммунологии ФМБА России [70] с использованием референтных значений была оценена частота выраженного изменения фагоцитарной, лизосомальной, адгезивной активности, внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови и концентраций КСФ-Г и КСФ-ГМ в сыворотке крови у облученных лиц и в группе сравнения. Результаты представлены в таблице 3.7. Среди облученных людей не было отмечено статистически значимого увеличения частоты случаев выраженного угнетения показателей нейтрофильного звена врожденного иммунитета по сравнению с группой сравнения. Однако в группе облученных лиц статистически значимо чаще регистрировались случаи избыточного повышения индекса фагоцитоза нейтрофилов и доли НСТ-положительных нейтрофилов периферической крови (по данным индуцированного НСТ-теста) относительно группы сравнения.
Как отмечалось ранее, наиболее хорошо исследованными формами гибели нейтрофилов после воздействия ионизирующей радиации являются их репродуктивная гибель и некроз [33]. Роль апоптоза в поддержании гомеостаза нейтрофильного звена иммунитета в период отдаленных последствий облучения человека остается малоизученной. Известно, что апоптоз представляет собой процесс запрограммированной клеточной гибели, в ходе которого элиминируются клетки, имеющие генетические повреждения [114, 211]. Анализ спонтанных и индуцированных стандартными нагрузками (инкубация нейтрофилов периферической крови в питательной среде и острое -облучение в дозе 1 Гр) поздних необратимых апоптотических изменений позволили не только определить активность апоптоза, но и оценить наличие скрытых (сублетальных) пострадиационных генетических изменений в нейтрофилах.
