Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Структура и каталитический механизм пероксидаз растений 7
2 1 1 Классификация гем-содержащих пероксидаз и реакционный цикл 7
2 1.2 Структура пероксидаз и механизм расщепления пероксида водорода 9
2.1.3. Структурные и каталитические особенности нативной пероксидазы табака 14
2.1.4. Проблема субстратной специфичности пероксидаз 18
2 1.4.1. Субстрат-связывающий центр лигнинпероксидазы 19
2.1.4 2 Субстрат-связывающие центры пероксидазы хрена 22
2.1.5. Роль кальция в структуре и активности пероксидаз 27
2.1.6. Инактивация пероксидазы пероксидом водорода 28
2 2. Методы получения рекомбинантных пероксидаз 31
2.2 1. Экспрессия в растениях 31
2.2.2. Экспрессия в дрожжах и грибах 32
2.2.3. Экспрессия в Е coll 32
2 3. Механизм окисления люминола под действием пероксидаз 34
3 Экспериментальная часть 37
3.1. Материалы 37
3.2. Методы исследования 37
3 2.1. Клонирование гена пероксидазы табака 37
3.2.2. Направленный мутагенез пероксидазы табака 38
3.2.3. Экспрессия пероксидазы табака в клетках Е coh 38
3.2.4. Выделение пероксидазы табака 3 8
3.2.5. Рефолдинг пероксидазы табака 38 3 2 6 Очистка пероксидазы табака 39
3.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез) 39
3.2.8. Определение молекулярной массы пероксидаз 40
3 2.9 Спектрофотометрическое определение активности пероксидаз 40
3.2.10. Расчет констант скорости по данным стационарной кинетики 42
3.2.11. Совместное окисление фенола и резорцина 42
3.2.12. Совместное окисление 23НМ и 34НМ 42
3 2 13. Радиоинактивация пероксидаз 42 3.2.14. Определение концентрации пероксида водорода в ходе радиолиза 43
3.2.14. Реакция окисления люминола 43
4. Результаты и их обсуждение 44
4.1. Рефолдинг рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа 44
4 1.1. Оптимизация экспрессии и рефолдинга по активности 44
4 1.2 Наработка препаративных количеств фермента дикого типа 47
4 1.3. Особенности кристаллической структуры пероксидазы табака 51
4.2. Получение мутанта рекомбинантной пероксидазы табака GluUlPhe 57
4.2.1. Сравнение выходов при рефолдинге ферментов дикого типа и мутанта 57
4.2.2. Очистка рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа и мутанта 58
4.3. Сравнение свойств ферментов дикого типа и мутанта 67
4.3.1. Субстратная специфичность 67
4.3.2. Влияние катионов кальция на окисление ABTS
и электрохимические свойства 69
4.3.3. Стабильность водных растворов ферментов в условиях радиолиза 78
4.3.4. Люминесцентные свойства ферментов 87
4.4. Механизм совместного окисления фенолов и ABTS под действием пероксидазы табака 97
4.4.1. Окисление фенола и резорцина 97
4.4.2. Окисление 23НМ и 34НМ 109
5. Выводы 118
6. Список литературы
- Классификация гем-содержащих пероксидаз и реакционный цикл
- Направленный мутагенез пероксидазы табака
- Особенности кристаллической структуры пероксидазы табака
- Механизм совместного окисления фенолов и ABTS под действием пероксидазы табака
Введение к работе
Усовершенствование старых и разработка новых вариантов ферментативного анализа для целей здравоохранения и охраны окружающей среды является одним из важнейших и перспективных направлений современной биотехнологии, поскольку именно ферментативные методы обеспечивают высокочувствительное и селективное определение физиологически активных веществ. Поэтому поиск, получение и характеристика новых ферментов для аналитической биотехнологии является актуальной задачей
В нашей лаборатории в 90-е годы был проведен скрининг низших грибов и растений, в результате которого было установлено, что анионная пероксидаза листьев табака (ТОР) значительно более активна в хемилюминесцентной реакции окисления люминола, чем пероксидаза хрена (HRP) [1]. Для получения значительных количеств фермента в 1994-98 проводились совместные работы с проф. Лагримини (Университет Небраски-Линкольна, США), предоставившим трансгенные растения табака и томатов, суперпродуцирующих ТОР [2]. Таким образом, удалось наработать значительные количества фермента и провести изучение его каталитических свойств [3-5].
Фермент действительно является лучшим катализатором окисления люминола и не требует добавления усилителей хемилюминесценции благодаря высокой активности Соединения II [1]. ТОР из трансгенных растений табака в условиях люминесцентного ИФА показала себя на порядок лучше по активности по сравнению с HRP, что явилось отражением большей стабильности фермента при модификации пероксидом водорода при рН 9,5 [6], [7] Таким образом, для целей люминесцентного ИФА новая пероксидаза представляет несомненный практический интерес.
В дополнение к необычно высокой стабильности Соединения I, что отличает пероксидазу табака от всех остальных пероксидаз растений, фермент показал необычную регуляцию спектральных и каталитических свойств под действием катионов кальция [3]. В присутствии 100 мМ Са2+ фермент способен катализировать окисление вератрового спирта с рН-оптимумом 1,8 [3].
Структурная модель фермента была получена к.ф.-м.н. Упоровым И.В. методом гомологичного моделирования на основании кристаллической структуры пероксидазы хрена и аминокислотной последовательности пероксидазы табака. Модель продемонстрировала основное отличие активных центров пероксидазы табака и пероксидаз арахиса и хрена, состоящее в присутствии на входе в активный центр фермента остатка глутаминовой кислоты-141, которая может отвечать за выявленные необычные свойства фермента [8]. Проверка этого предположения потребовала проведения клонирования гена пероксидазы табака и его экспрессии в Ecoli, разработки процедуры рефолдинга фермента дикого типа с последующей кристаллизацией, получения мутантной формы TOP GluNlPhe и сравнения ее каталитических свойств с ферментом дикого типа.
Ген пероксидазы табака был любезно предоставлен проф. Лагримини, конструирование плазмид, экспрессирующих рекомбинантный фермент дикого типа и мутантную форму, было проведено к.х.н. Савицким ПА. и к.х.н. Рожковой A.M.
Задачей настоящей диссертационной работы является:
Оптимизация условий экспрессии гена ТОР в клетках Ecoli, рефолдинга фермента из телец включения и очистки рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа с целью ее последующей препаративной наработки и кристаллизации;
Оптимизация рефолдинга мутантной формы Glul41Phe пероксидазы табака;
Сравнительное изучение субстратной специфичности и стабильности обоих ферментов, в особенности в реакции люминесценции;
Изучение стабильности ферментов в условиях радиолиза (имитация инактивации в ходе реакции);
Изучение влияния ионов Са на кинетические параметры окисления ABTS;
Изучение совместного окисления ABTS и фенолов (фенол, резорцин и т.д) под действием различных форм пероксидазы табака,
Диссертационная работа выполнена в рамках и при финансовой поддержке гранта РФФИ 04-04-48286.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Структура и каталитический механизм пероксидаз растений
2.1.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ГЕМ-СОДЕРЖАЩИХ ПЕРОКСИДАЗ И РЕАКЦИОННЫЙ ЦИКЛ
Гем-содержащие пероксидазы (КФ 1.11.1.X, где X определяется природой биологического восстановителя) подразделяются на 2 суперсемейства: пероксидазы растений и животных. Ферменты катализируют окисление различных электронодонорных субстратов пероксидом водорода. Каталитический цикл начинается с быстрого взаимодействия фермента и пероксида водорода с образованием т.н. Соединения I. Соединение I содержит 2 окислительных эквивалента: оксиферрил-гем и свободный радикал. Соединение I восстанавливается донором электронов с образованием Соединения II, а затем нативного фермента, как показано на Схеме 1. Оксигеназный цикл, как предполагается, действует при окислении гормона роста растений, индолил-уксусной кислоты.
Суперсемейство пероксидаз растений подразделяется на 3 класса на основе гомологии аминокислотных последовательностей и особенностей посттрансляционной модификации [9]. Класс I включает микробиальные (прокариотические) пероксидазы: бактериальные каталазы-пероксидазы (КФ 1.11.1.6), дрожжевую цитохром С пероксидазу (КФ 1.11.1.5) и аскорбатпероксидазы растений (КФ 1.11.1.11). Класс II - это пероксидазы грибов, включающие лигнинпероксидазу, марганец-пероксидазу и секреторные пероксидазы растительного типа. Класс III - это т. н. классические пероксидазы растений. Пероксидазы двух последних классов (КФ 1.11.1.7) гликозилированы и содержат 4 дисульфидные связи и 2 катиона кальция на молекулу
е-,Н+
^Fe(IV)—
Соединение І н20
л-катион радикал
е-, Н+.
— Fe(ll)— Н
Ферро-фермент
о.
Пероксидазный ^~ ПЭ(1П^ цикл
Ферри-фермент
основное состояние
Оксидазный цикл
— Fe(IV>—
Соединение II
— Re(lll)—
Соединение III
Схема 1. Пять различных состояний активного центра пероксидаз растений. Основное состояние представлено ферри-ферментом, который при одноэлектронном восстановлении образует ферро-форму; последняя присоединяет молекулу кислорода и образует т.н. Соединение III. Каталитический цикл пероксидазной реакции включает Соединение I, которое образуется при двухэлектронном окислении железа активного центра и представляет собой феррил-форму и катион-радикал на порфириновом кольце, и Соединение II -продукт одноэлектронного восстановления Соединения I. Под действием избытка пероксида Соединение II образует Соединение III, однако при таком способе образования оно быстро разлагается под действием избытка пероксида (не показано).
2.1.2. СТРУКТУРА ПЕРОКСИДАЗ И МЕХАНИЗМ РАСЩЕПЛЕНИЯ
ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА
Прогресс белковой инженерии гем-содержащих пероксидаз и установление их кристаллической структуры (цитохром С пероксидаза [10], аскорбатпероксидаза гороха [11], лигнин- [12], [13] и марганец- [14] пероксидазы Phanerochaete chrysosponum, грибная пероксидаза Coprinus cinereus [15] I Arthromyces ramosus [16], пероксидаза арахиса [17], рекомбинантная пероксидаза хрена (HRP) [18] и пероксидаза ячменя [19], пероксидаза сои [20], две изоформы пероксидазы арабидопсиса [21]—[22]) позволили предложить постадийный механизм, описывающий гетеролитическое расщепление пероксида водорода в активном центре и его последующее восстановление молекулой фенольного субстрата (Схема 2)
Главную роль в гетеролитическом расщеплении пероксида играют дистальные остатки гистидина-42 и аргинина-38. Пероксидаза содержит три гистидиновых остатка - 40, 42 и 170. Последний является проксимальным лигандом железа (рис.1). Химической модификации подвергаются только 40 и 42 остатки [23]
Проксимальный His 170 отвечает за прочное связывание гема в активном центре. При его замене на аланин константа скорости образования Соединения I падает на 5 порядков. Добавление имидазола позволяет увеличить константу в 1500 раз, восстанавливая лишь процент ферментативной активности [24]. Полагают, что проксимальный лиганд гема His 170 образует водородную связь с Asp247, которая увеличивает его основность, облегчает стабилизацию заряда в окисленных формах пероксидазы и позволяет поддерживать атом железа с координационным числом 5 [18].
Дистальный или, как его еще называют, каталитический гистидин-42 отвечает за расщепление пероксида водорода. Механизм образования Соединения I включает переходное образование комплекса трехвалентного железа и перокси-аниона при протонировании дистального гистидина (см. Схему 2). Перенос
протона с дистального гистидина на гидроксильную группу и образование молекулы воды генерирует оксиферрил-гем и катион-радикал на порфириновом кольце - Соединение І. В Соединениях I и II не обнаружена водородная связь между феррильным кислородом и дистальным гистидином [25]
При замене дистального гистидина на Ala, Leu, Val константы скорости первой стадии реакции падают на много порядков [26,27]; так, замена на лейцин уменьшает константу второго порядка в реакции с пероксидом водорода на 5 порядков по сравнению с нативной и рекомбинантной формами HRP, а константа первого порядка гетеролитического расщепления 0-0 связи при образовании Соединения I падает на 4 порядка В случае мутанта His42Ala добавление 2-замещенных имидазолов частично восстанавливало каталитическую активность благодаря образованию альтернативного центра связывания протонов. Создание двойного мутанта Phe41His/His42Ala восстанавливает каталитическую активность фермента [28] Мутант His42Glu [29] (имитация хлоропероксидазы) на 4 порядка менее активен при взаимодействии с пероксидом водорода. При этом в отличие от хлоропероксидазы присутствие дистального остатка аргинина является критическим (двойной мутант His42Glu/Arg38Ser неактивен)
Важной структурной особенностью является водородная связь His42-Asn70 [30] и далее к Glu64 и до дистального Са -связывающего центра, как показано на рис 1.
Предполагается, что для максимальной эффективности пероксидазного катализа требуется совершенно определенная ориентация имидазольного кольца His42 по отношению к порфириновому кольцу, которая и реализуется посредством водородной связи между His42 и Asn70 [30], [31]. При замене Asn70 на валин [30], [32] разрушается водородная связь с гистидином и фермент демонстрирует очень низкую каталитическую активность.
Дистальный остаток Arg38 играет важную роль на всех ступенях катализа [33-35]. Замена его на лизин уменьшает скорость образования Соединения І в 500 раз, а замена на лейцин-в 1200 раз Анализ мутации Arg38Ser пероксидазы из
Arg38+
His42+
a \
H>.
HN = C(NH2)2
0'
E + H202
3+
EI + H20
Arg38+
His42+
EI + S
В His42+
EII + S ->
Phe-R
HN = C(NH2)2 ,H— 6
* -> EII + S* Pro139
Arg38+ HN = C(NH2)2
Prol39
Phe-R
Схема 2 Участие Arg38 и His42 в образовании молекулы воды (а); восстановление Соединений I (б) и II (в) фенольным субстратом, иллюстрирующее возможную роль молекулы воды активного центра [25].
-И-
Рис.1. Общий вид молекулы пероксидазы хрена со стороны входа в активный центр, формируемого четырьмя остатками фенилаланина - 142, 143, 179, 68. Последний остаток имеет конформацию крышки, которая при связывании ингибитора - бензгидроксамовой кислоты - «закрывается» (см. рис.3).
корней хрена спектрально показал присутствие дополнительного промежуточного соединения, предшествующего Соединению I и имеющего спектр отличный от Соединения 0 (переходное промежуточное соединение наблюдалось при низкой температуре, что, как полагают, может характеризовать связывание перокси-аниона) Изучение квантовых моделей электронных спектров предполагаемых переходных промежуточных соединений показало, что назначением этого нового промежуточного соединения является нейтральное связывание пероксида в активном центре Замена аргинина на лейцин уменьшала на три порядка константу скорости образования комплекса фермент-пероксид водорода и 6-кратное падение константы скорости распада этого комплекса с образованием Соединения II. Эти данные согласуются с предположением, что аргинин выполняет две функции при каталитическом образовании Соединения I: во-первых, участвует в связывании пероксида водорода и тем самым стимулирует перенос протона с Н2О2 к имидазольной группе His42 для облегчения связывания пероксид-аниона с гемом, и, во-вторых, перераспределяет электронную плотность между атомами кислорода при гетеролитическом разрыве 0-0 связи, то есть способствует и правильной ориентации пероксида водорода в активном центре, и его гетеролитическому расщеплению
Остаток аргинина участвует в стабилизации Соединения I, образуя водородную связь с кислородом феррила [25]. По данным мутагенеза, Arg38, в отличие от His42, принимает участие в связывании ароматических субстратов. Замена его на лейцин привела к значительному уменьшению константы связывания пероксидазы с бензгидроксамовой кислотой [36], гваяколом и «-крезолом [33]. По данным рентгеноструктурного анализа комплекса пероксидазы хрена с цианидом и феруловой кислотой (см. ниже), этот остаток напрямую участвует в связывании субстратов пероксидазы. Таким образом, помимо контролирования реакционной способности пероксидазы в отношении пероксида водорода, этот остаток играет важную роль в связывании и ориентировании доноров электронов в активном центре.
Молекула воды, обнаруженная в активном центре HRP и ее комплексах с феруловой кислотой и цианидом, также присутствует в кристаллических структурах других пероксидаз растений [37] в отличие от грибных и микробиальных пероксидаз. Остаток пролина, кислород которого образует водородную связь с молекулой воды активного центра, присутствует во всех пероксидазах суперсемейства растений. Основываясь на кристаллических структурах вышеупомянутых комплексов HRP [37], авторы предложили механизм окисления субстратов с участием молекулы воды активного центра (Схема 2) [25]. Сначала Arg38 образует водородную связь с фенольным кислородом субстрата-восстановителя, что помогает переносу протона с фенольного кислорода на His42 посредством участия молекулы воды активного центра, удерживаемой в нужном положении водородной связью с кислородом Pro 139. Перенос электрона происходит на порфириновое кольцо гема. При восстановлении Соединения II перенос протона, синхронный переносу электрона, может происходить через молекулу воды активного центра (Схема 2).
2.1.3. СТРУКТУРНЫЕ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НАТИВНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ТАБАКА
Моделирование структуры пероксидазы табака было осуществлено кф.-м.н.Упоровым ИВ. с помощью программы Insight II (version 95,0, Biosym/MSI, San Diego, CA, USA) на основе аминокислотной последовательности фермента и координат кристаллической структуры изофермента С пероксидазы хрена. На рис. 2 представлена модель структуры пероксидазы табака, полученная методом гомологического моделирования. Активный центр пероксидазы табака принципиально не отличается от пероксидаз арахиса и хрена, за исключением наличия отрицательно заряженного остатка Glul41 вместо Phel43.
На активный центр в модельной структуре пероксидазы табака влияет электростатическое отталкивание Glul41, пропионатов гема и триады Asp-76, 79, 80, что приводит к увеличению расстояния между этими остатками до 19-23 А.
Вход в активный центр у пероксидазы табака оказывается экранированным как остатком Glul41, так и остатком Phel40 (см. рис.2). При этом дистальный гистидин смещен от атома железа гемина в сторону отрицательно заряженного Glul41.
Изучение нативной пероксидазы табака (М.в. 36 кД, pi 3,6), выделенной из трансгенных растений табака, суперпродуцирующих фермент, показало, что этот фермент имеет ряд необычных свойств.
Во-первых, если получение Соединения I пероксидазы хрена представляет большую проблему и при добавлении эквимолярного количества пероксида водорода к ферменту наблюдается смешанный спектр Соединений I и И, то для пероксидазы табака проблемой является регистрация Соединения П. В кислой среде (рН 4,0-5,0) это соединение пероксидазы табака не удается зарегистрировать, и даже при большом избытке пероксида наблюдается спектр Соединения I, который превращается в спектр Соединения III при молярном соотношении пероксида и фермента выше 1000.
Соединение III также очень стабильно и распадается с образованием т.н. Соединения Р-670 без промежуточного детектирования Соединения II [2]. Соединение II удается зарегистрировать при рН 7,5 при 30-50-кратном избытке пероксида водорода, причем форма и сдвиг пика Соре говорят о присутствии Соединения I
Таким образом, пероксидаза табака принципиально отличается от других пероксидаз растений большей стабильностью к инактивации пероксидом водорода и, по-видимому, меньшей активностью Соединения I, чем Соединения П. Такими же свойствами характеризуется пероксидаза грибов Arthromyces ramosus, которая известна своей высокой активностью по отношению к люминолу [38]. Пероксидаза табака также оказалась исключительно активной в реакции с люминолом, с чувствительностью обнаружения фермента на уровне десятых долей пикомоля в литре, что на порядок лучше, чем детекция пероксидазы хрена в реакции усиленной хемилюминесценции [1]. Измерение констант скорости взаимодействия окисленных соединений пероксидазы табака с люминолом методом остановленной
Рис. 2. Модель пероксидазы табака, полученная методом гомологичного моделирования по кристаллической структуре HRP С.
струи при рН 8,0 показало, что активность Соединений I и II сравнима между собой и находится в пределах 106-107 МГ'с"1 [1]. Если учесть, что щелочные рН уменьшают активность Соединения II пероксидазы, то очевидно, что предположение о его более высокой активности в кислой среде, сделанное на основе спектральных исследований, правомерно.
Во-вторых, пероксидаза табака намного стабильнее, чем пероксидаза хрена, как при хранении в растворе, так и во время реакции. Особенно это заметно при экстремально низких значениях рН в присутствии ионов кальция и проявляется в наличии ферментативной активности по отношению к вератровому спирту при рН < 2 [3]. Кальций не только способствует повышению стабильности фермента в кислых средах, но и модулирует спектральные характеристики фермента [3]. Спектр пероксидазы табака в присутствии ионов кальция при рН 1,8 практически совпадает со спектром лигнинпероксидазы при рН 6: имеет пик Соре на 409 нм и коэффициент экстинкции на 403 нм в полтора раза выше, чем пероксидазы растений Магний вызывает схожие эффекты, но в меньшей степени, а именно -стабилизации фермента в экстремально кислых рН не наблюдается. Добавление кальция к пероксидазе табака при рН 5,0 приводит к падению константы скорости взаимодействия с пероксидом водорода в 3 раза [39]. Таким образом, кальций является специфическим модулятором активности и стабильности пероксидазы табака, и природа этого влияния в настоящее время неизвестна. Одно из гипотетических предположений состояло в возможности взаимодействия иона кальция с остатком Glul41 на входе в активный центр пероксидазы табака [39]. Альтернативное предположение состоит либо в нестабильности дистального центра связывания кальция в пероксидазе табака, либо в необходимости насыщения поверхности фермента положительными зарядами для преодоления дестабилизирующего влияния электростатического отталкивания пропионатов гема и триады остатков аспарагиновой кислоты.
В-третьих, по сравнению с пероксидазой хрена, пероксидаза табака практически не обладает активностью по отношению к йодиду (всего в 2-3 раза превосходит скорость фоновой реакции) и на порядок более активна по отношению
к неорганическому субстрату - ферроцианиду [2], [40]. Иодид является двухэлектронным донором электронов и взаимодействует непосредственно с активным центром пероксидазы. Наличие отрицательного заряда на входе в активный центр может вызывать электростатическое отталкивание субстрата и приводить к невозможности его взаимодействия с активным центром Низкая активность по фенолу может быть интерпретирована двояко. Известно, что мутация остатка Glu64, обеспечивающего фиксацию дистального иона кальция в пероксидазе хрена, приводит к почти полному исчезновению активности по фенолу, но существенному увеличению активности по ABTS [41]. Объяснением этого факта является разрушение системы водородных связей в области дистального кальция и каталитического гистидина, приводящее к 6-координированному состоянию атома железа активного центра Это приводит к стерическим затруднениям для проникновения молекулы фенола в активный центр и для участия каталитического гистидина в протонировании и депротонировании молекулы субстрата (например, опосредованно через молекулу воды активного центра, как показано на Схеме 2). Разрушение водородных связей приводит к увеличению окислительного потенциала окисленных соединений мутантнои формы пероксидазы хрена [40], что выражается в повышенной активности по ABTS, осуществление которой не требует протонирования или депротонирования субстрата каталитическим гистидином.
Таким образом, свойства пероксидазы табака могут быть объяснены как экранированием активного центра отрицательным зарядом глутаминовой кислоты, так и потерей дистального кальция и разрушением системы водородных связей, ведущим к шестикоординированной форме атома железа гема.
2.1.4. ПРОБЛЕМА СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПЕРОКСИДАЗ
Вышеприведенные схемы предполагают взаимодействие протонов субстрата с дистальным остатком Arg, присутствующим во всех пероксидазах, секвенированных к настоящему времени. Однако субстратная специфичность классических пероксидаз растений остается проблемой, ждущей своего решения
Каждый фермент имеет свой собственный профиль субстратной специфичности, и в настоящее время нет рациональной основы для предвидения активности фермента по отношению к выбранному донору электронов. Прокариотические и грибные пероксидазы имеют свои специфические субстраты в дополнение к искусственным донорам электронов В лигнинпероксидазе Тгр171 играет роль специфического сайта связывания вератрового спирта [42]. Мутант Serl68Trp марганец-пероксидазы, имитирующий лигнинпероксидазу, активен по отношению к вератровому спирту [43]. Таким образом, существует цепь переноса электронов между активным центром лигнинпероксидазы и Тгр 171, расположенным от него на расстоянии 16 А (рис. 3).
2.1.4.1. Субстрат-связывающий центр лигнинпероксидазы
При изучении кристаллических структур двух изоферментов лигнинпероксидазы из белого гриба Phanerochaete chrysospormm было показано наличие значительной электронной плотности у (5-атома углерода Тгр171 [44]. Принимая во внимание геометрическое расположение и водородные связи, была определена гидроксильная группа. Гидроксилирование (3-атома углерода у Тгр171 является автокаталитической реакцией, для которой требуется лишь небольшой избыток пероксида водорода и небольшое число оборотов фермента [45]. Рекомбинантный фермент модифицируется в течение нескольких первых оборотов.
Прямыми доказательствами существования двух различных субстрат-связывающих центров в лигнинпероксидазе явились кристаллическая структура нативного фермента, отсутствие модификации Тгр171 у рекомбинантного фермента и полная потеря активности по вератровому спирту у мутантов TrpUlPhe и Trpl71Ser при сохранении активности по другим донорам электронов [42]. Таким образом, у лигнинпероксидазы первый (неспецифический) субстрат-связывающий центр находится на границе гем-связывающей области, а второй (специфический), необходимый для окисления вератрового спирта и проявления им медиаторных свойств - вблизи Тгр171 (рис. 3) Скорость-лимитирующим этапом реакции восстановления Соединения II лигнинпероксидазы вератровым
спиртом является перенос электрона. Был предложен механизм взаимодействия катион-радикального комплекса лигнинпероксидаза - вератровый спирт с дополнительной молекулой вератрового спирта, ключевым моментом которого является стабилизация катион-радикала белковым микроокружением [46]. Изучение кристаллической структуры LIP показывает, что ближайшее окружение Тгр171 является электроотрицательным и может вносить свой вклад в стабилизацию катион-радикала вератрового спирта.
Субстратом Mn-пероксидазы является ион двухвалентного марганца, локализованный внутри молекулы фермента [14], [47]. Направленный мутагенез остатков, координирующих ион марганца (он находится на расстоянии 11 А от железа гема) приводит к уменьшению каталитической активности фермента [48-50]. Изящная работа по направленному мутагенезу Mn-пероксидазы, выполненная в лаборатории проф. Оста [43], показала, что замена остатка серина, занимающего позицию, аналогичную остатку 171 в лигнинпероксидазе, на триптофан позволяет создать центр связывания вератрового спирта в Mn-пероксидазе. Было показано, что в отличие от нативной и рекомбинантной форм мутант Serl68Trp не только полностью сохраняет активность по отношению к Мп2+, но и окисляет многочисленные субстраты LIP - как маленькие молекулы, так и полимерные формы. «Введенный» в молекулу МпР триптофан стал центром для эффективного окисления различных субстратов LIP, которые для нативной формы МпР являются плохим субстратами или не являются таковыми вообще Функциональное подобие мутантной формы Serl68Trp МпР и LIP служит доказательством исключительной роли триптофана-171 в субстратной специфичности лигнинпероксидазы [43].
Рис. 3. Общий вид молекулы лигнинпероксидазы. Показаны 2 катиона кальция, гем, дистальный гистидин-47. Вход в активный центр контролируется водородной связью His82-Glul46, которая определяет низкий рН-оптимум действия фермента. Остаток триптофана-171 является субстрат-связывающим центром специфического субстрата лигнинпероксидазы - вератрового спирта.
2.1.4.2. Субстрат-связывающие центры пероксидазы хрена
В настоящее время сложилось мнение, что субстраты классических пероксидаз растений можно принципиально разбить на 3 группы К первой относят двухэлектронные доноры электронов, для которых принципиальным является связывание вблизи активного центра или даже проникновение внутрь (иодид, тиоанизол, стирол) [51]. Вторые - достаточно простые одноэлектронные ароматические субстраты - связываются вблизи активного центра, как это показано для феруловой кислоты (см.ниже). Третьи - субстраты, окисляющиеся по цепи переноса электронов (ABTS, IAA).
В первом случае механизм окисления включает перенос феррильного кислорода на субстрат, те необходимо прямое взаимодействие субстрата с феррильным кислородом. Повышенная активность переноса кислорода в мутантах His42Ala [26;27], His42Glu и в двойном мутанте His42Val/Arg38His является прямым доказательством большей открытости дистального кармана при введении указанных мутаций [52].
Субстраты второй группы связываются вблизи активного центра. Результаты белковой инженерии HRP и определение кристаллической структуры комплексов фермента с ингибитором и одним из субстратов (см. ниже) указывают на доступность активного центра для фенольных субстратов
Изучение связывания ингибитора пероксидазы хрена - бензгидроксамовой кислоты [53;54] - показало, что мутант His42Leu связывает бензгидроксамовую кислоту в 1000 раз слабее, чем нативный или рекомбинантный ферменты. Замена как гистидина, так и аргинина резко ослабляет связывание.
Кристаллическая структура комплекса пероксидазы хрена с бензгидроксамовой кислотой [55] часто рассматривается как модель связывания пероксида водорода в активном центре пероксидазы, хотя бензгидроксамовая кислота является специфическим ингибитором именно HRP, но не пероксидазы табака, например. Очень интересным является тот факт, что Phe68 образует крышку гидрофобного кармана (рис 4), что приводит к принципиально другой кристаллической структуре комплекса по сравнению с рекомбинантным
ферментом, а именно - если рекомбинантный фермент образует кристаллическую ячейку с переменным числом молекул, то комплекс дает четкую кристаллическую ячейку с двумя молекулами. Эти данные хорошо соотносятся с результатами, полученными в нашей лаборатории при изучении поведения димерной формы рекомбинантной HRP в обращенных мицеллах [56], а именно продемонстрированным влиянием субстратов на равновесие мономер-димер рекомбинантной HRP.
Феруловая кислота [(3-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-2-пропионовая кислота] является субстратом растительных пероксидаз in vivo. В работе [37] представлены кристаллические структуры двойного комплекса пероксидазы хрена с феруловой кислотой (рис. 5) и тройного комплекса пероксидазы хрена с феруловой кислотой и цианидом. Присутствие цианида в качестве шестого лиганда создает стерические затруднения в дистальном кармане гема, и в некоторой степени этот эффект подобен присутствию феррильного кислорода в Соединениях I и II. Структуры комплексов демонстрируют подвижность, гибкость и динамичный характер центра связывания ароматических субстратов в пероксидазе хрена; авторы также выделяют роль дистального аргинина (Arg38) в процессе окисления субстрата и связывании лиганда. Этот остаток образует водородные связи с цианидом, стабилизируя таким образом комплекс пероксидаза - цианид, и способен, по мнению авторов, принимать участие в стабилизации переходного состояния и последующем расщеплении 0-0 связи. Также он вовлечен в сеть водородных связей между дистальным гистидином, молекулой воды и Pro 139.
Пероксид водорода проникает в активный центр по каналу, размер и гидрофобность которого контролируют доступ к железу гема. В случае пероксидазы хрена канал образуют множественные остатки Phe (41, 68, 142, 143, 179) Методом направленного мутагенеза был идентифицирован остаток, связывающий ароматические молекулы - Phe 179 [57]. Замена его на аланин привела к 80-кратному падению связывания цианокомплекса фермента с бензгидроксамовой кислотой. Замена на серии также отрицательно сказалась на возможности связывания, а вот замена на гистидин не привела к столь резкому
Рис. 4. Связывание бензгидроксамовой кислоты в активном центре пероксидазы хрена с заменой Phel79Ser, открывающей доступ к железу гема. Характерна измененная позиция кольца Phe68, которое как крышка закрывает активный центр сверху.
падению связывания цианокомплекса HRP с ВНА. Показано, что другие Phe-остатки (Phe68 и Phel42) гораздо менее значимы. Полученные результаты являются первым прямым экспериментальным доказательством участия Phel79 при связывании ароматических молекул. Таким образом, один из центров связывания субстратов пероксидазы хрена находится вблизи остатка Phel79
В нашей лаборатории был получен мутант пероксидазы хрена Phel43Glu, субстратная специфичность которого претерпела изменения, а именно: активность упала по отношению к йодиду и фенолу, но выросла по отношению к аминофенолам и бензидинам [58]. Таким образом, были получены доказательства роли остатка 143 в контролировании доступа субстратов к железу гемина.
В третьем случае, если предполагать отсутствие специфических взаимодействий субстрата с активным центром, очевидно, что субстратная специфичность должна определяться редокс-потенциалами субстратов и окисленных форм фермента и их стабильностью [59], поскольку каталитический процесс представляет собой окислительно-восстановительную реакцию. Тривиальное мнение о контролировании субстратной специфичности окислительным потенциалом Соединений I и II основано на данных Данфорда [60] о возрастании констант скорости восстановления Соединений I и II с ростом восстановительного потенциала в ряду замещенных аминов и фенолов [61]. Скорости реакций таких субстратов HRP, как фенолы и производные ІАА, с Соединением I хорошо соотносятся с восстановительными потенциалами соответствующих катион-радикальных продуктов [62]. Константы скорости реакции второго порядка восстановления Соединений I и И HRP фенолами были интерпретированы в рамках теории электронного переноса Маркуса [63], и более низкая активность Соединения II объяснялась большим расстоянием электронного переноса (от железа гема к субстрату) по сравнению с Соединением I (от катион-радикала порфирина к субстрату). Однако такой подход хорошо объясняет только поведение субстратов внутри одной группы схожего химического строения, отличающихся лишь природой заместителя, но неприменим для сравнения субстратов различного химического строения.
His42
Phe68
Чг АгдЗо фЄруЛОвая кислота
Phe41
Phe179
Рис. 5. Вид на активный центр комплекса пероксидазы хрена с феруловой кислотой.
2.1.5. РОЛЬ КАЛЬЦИЯ В СТРУКТУРЕ И АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗ
В ранних исследованиях было показано, что молекула HRP содержит два иона Са и их удаление приводит к дестабилизации и инактивации фермента [64-67] Изучение эффектов, вызванных замещением кальция на другие двухвалентные металлы и Ln+, продемонстрировало неэквивалентность проксимального и дистального кальций-связывающих центров [65]. Именно последний является менее специфичным к природе металла, и именно этот центр теряет кальций в первую очередь Применение современных физических методов позволило еще раз подтвердить важность проксимального кальция для структуры фермента и седлообразной конформации гема, обеспечивающей выполнение им каталитических функций [68] Дистальный кальций в большей степени важен для стабильности структуры дистального домена фермента, и его подвижность приводит к инактивации при хранении или в экстремальных значениях рН. И в том, и в другом случае присутствие в растворе 1 мМ кальция предохраняет фермент от инактивации [69].
Катионная пероксидаза арахиса значительно менее активна и стабильна, чем пероксидаза хрена, и причиной этого, по-видимому, является большая подвижность дистального кальция. Кальций необходим для стабилизации даже концентрированных препаратов фермента, и только его присутствие способствует поддержанию значения RZ при длительном хранении препаратов [70].
В случае пероксидазы ячменя была показана принципиальная роль кальция в активации фермента. Кристаллическая структура неактивной формы пероксидазы ячменя была получена при рН 5,5, 7,5 и 8,5 и, как оказалось, содержала 1 ион кальция и 1 ион натрия [19]. В отсутствие кальция в дистальном центре каталитический гистидин находится на расстоянии более 8 А от железа гема и не может принимать участия в катализе расщепления пероксида водорода в активном центре. Только протонирование фермента с последующим встраиванием кальция восстанавливает активность пероксидазы по отношению к пероксиду водорода [71].
Таким образом, у ряда пероксидаз растений при высокой гомологии и практически одинаковом фолдинге глобулы подвижность дистального кальция может отличаться в широких пределах, что влияет на активность и стабильность препаратов фермента.
В случае пероксидаз грибов диссоциация кальция из дистального центра имеет серьезные последствия. Принципиальное различие между пероксидазами растений и грибов состоит в различном расположении дисульфидной связи (Cys49-Cys44 в пероксидазе хрена). У пероксидаз растений дисульфидная связь поддерживает структуру дистальной области и в отсутствие кальция, в то время как у пероксидаз грибов дисульфидная связь не компенсирует отсутствие кальция в дистальном центре и не в состоянии поддерживать структуру белка [72]. Результатом этой структурной особенности является значительно меньшая стабильность грибных ферментов, у которых потеря кальция приводит к сильным структурным изменениям и полной потере активности [73].
Только введение дополнительной дисульфидной связи двойной мутацией Ala38Cys/Ala63Cys, по аналогии с пероксидазами растений, повышает термостабильность марганец-пероксидазы [74].
2.1.6. ИНАКТИВАЦИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА
В настоящее время рассматривают два случая инактивации пероксидазы под действием Н202: в отсутствие восстанавливающих субстратов и в их присутствии. Если в реакционной смеси отсутствует восстанавливающий субстрат или концентрация пероксида водорода намного выше концентрации субстрата, то пероксидаза подвергается обратимой и необратимой инактивации. На Схеме 3 представлена схема инактивации пероксидазы в отсутствие восстанавливающих субстратов.
При обратимой инактивации на первом этапе происходит окисление молекулы фермента пероксидом водорода до Соединения I. Далее сильная окислительная способность Соединения I позволяет пероксиду водорода выступать в качестве донора электронов. Таким образом, восстановление Соединения I может
протекать путем двухэлектронного восстановления с выделением молекулы кислорода или одноэлектронного восстановления с выделением супероксид-аниона и образованием Соединения И. Далее Соединение II подвергается дальнейшему окислению пероксидом водорода с образованием Соединения III, которое в дальнейшем очень медленно разлагается до нативного фермента [75].
При взаимодействии Соединения I с пероксидом водорода происходит также необратимая инактивация фермента с образованием неактивной формы фермента, т н. Соединения Р-670.
Как уже отмечалось выше, в присутствии восстанавливающих субстратов схема инактивации пероксидазы заметно упрощается. На примере изучения инактивации пероксидазы пероксидом водорода в присутствии ABTS показано, что восстанавливающие субстраты защищают пероксидазу от инактивации [76]. Это прежде всего объясняется тем, что большинство восстанавливающих субстратов являются более реакционноспособными по отношению к Соединению I и II, чем Н202
До тех пор, пока концентрация субстрата больше концентрации Н202, каталитический цикл пероксидазы ограничивается только Соединениями I и II, т.е. восстанавливающий субстрат защищает пероксидазу от инактивации [75;76].
Н202
Пероксидаза
"** Соединение I
Соединение III
Соединение II
Н202
Соединение I * Н2О2
Соединение Р-670
Схема 3. Инактивация пероксидазы под действием Н202 в отсутствие восстанавливающих субстратов.
2.2. Методы получения рекомбинантных пероксидаз
2.2.1. ЭКСПРЕССИЯ В РАСТЕНИЯХ
При экспрессии в растениях, как правило, получается активный фермент, хотя гликозилирование может быть более гетерогенным, чем у нативного фермента. При экспрессии пероксидазы табака в трансгенных томатах, как оказалось, степень гликозилирования значительно ниже, чем при гомологичной экспрессии в растениях табака, что сказалось на ухудшении стабильности при использовании фермента в иммуноферментном анализе, а именно при проведении модификации фермента при рН 9,5 [6]. Проблемами производства пероксидаз в растениях являются как трудности получения трансгенных растений, так и их выращивание, поскольку фермент является каталитически активным и вызывает увядание растений (как полагают, за счет разрушения гормона роста, IAA) и кроме того избыточную лигнификацию. Поэтому получение достаточных количеств биомассы является проблематичным, хотя содержание фермента составляет более 60 мг с 1 кг листьев табака и 20 мг с 1 кг плодов томатов [40]. При выделении пероксидазы табака из листьев основной проблемой является отделение фермента от полифенольных пигментов. Эта проблема практически отсутствует при экспрессии в томатах
Во всех случаях фермент является гетерогенно гликозилированным, что препятствует его кристаллизации. Для изучения структурно-функциональной зависимости экспрессия в растениях слишком трудоемка и требует длительного времени С точки зрения практического применения, напротив, пероксидаза из растений практически не отличается по стабильности от нативной благодаря гликозилированию. Наличие гликозилирования делает фермент малопригодным для использования в безреагентных сенсорах с золотыми электродами, для которых является принципиальным наличие прямого электронного переноса между электродом и молекулой фермента [77].
2.2.2. ЭКСПРЕССИЯ В ДРОЖЖАХ И ГРИБАХ
К сожалению, в литературе отсутствуют удачные примеры экспрессии пероксидазы растений в дрожжах из-за проблемы избыточного гликозилирования. Грибные пероксидазы успешно экспрессируются как в грибных системах экспрессии, так и в дрожжах, в активной форме. Система экспрессии допускает проведение направленной эволюции методом случайного мутагенеза и последующим скринингом на устойчивость к рН 10,5 в присутствии пероксида водорода. Одним из самых успешных примеров направленной эволюции как подхода является получение мутанта пероксидазы Coprinus cinereus при экспрессии в Saccharomyces cerevisiae, когда удалось повысить в 174 раза термостабильность ив 100 раз устойчивость к инкубации с пероксидом водорода [78], хотя удельная активность мутантов была значительно ниже, чем у нативного фермента
2.2.3. ЭКСПРЕССИЯ В E.COLI
Система экспрессии Ecoli наиболее популярна при проведении фундаментальных исследований в области пероксидазного катализа, поскольку позволяет довольно быстро получить мутантные варианты и проанализировать их свойства. Отсутствие гликозилирования, хотя и незначительно (в 2-3 раза) снижает стабильность фермента, позволяет проводить его кристаллизацию. За исключением пероксидазы арахиса, все кристаллические структуры пероксидаз растений были получены при кристаллизации рекомбинантных ферментов, экспрессированных в Е coli.
Общепринятый подход - реактивация фермента из телец включения. Достоинство этого подхода в возможности предварительной очистки телец включения от сорбированных бактериальных белков при обработке повышенными концентрациями соли и стандартными концентрациями ПАВ. При рефолдинге пероксидаз проводят оптимизацию по основным параметрам и компонентам, а именно - концентрации гемина, кальция, окисленного глутатиона,
восстановленного глутатиона (или дитиотреитола, DTT), мочевины, а также рН (см. Таблицу 1). Для замедления сворачивания можно добавлять 10-20% глицерина в среду для рефолдинга, что позволяет слегка (5-10%) увеличить выход реактивации.
Таблица 1. Условия рефолдинга пероксидаз растений из телец включения.
В случае пероксидазы С из корней хрена в нашей лаборатории за счет оптимизации обработки телец включения выход реактивации удалось увеличить с 2-3 мг активного фермента до 20 мг с л среды. Методика, разработанная в нашей лаборатории, была успешно воспроизведена М. Танакой с соавт. при проведении работ по направленному мутагенезу пероксидазы хрена Методики рефолдинга пероксидазы ячменя и арабидопсиса были разработаны в лаборатории проф. Карин Велиндер [79], однако выход реактивации нигде в публикациях не указывается.
В работе [80] была сделана попытка получить активный фермент в цитозольной фракции клеток при использовании совместной экспрессии с шаперонами и фолдазами. Было показано, что при совместной экспрессии с периплазматическими фолдазами в комбинации DsbA-DsbB или DsbC-DsbD удается получить активную пероксидазу хрена в цитозольной фракции (фолдаза А катализирует образование дисульфидных связей, фолдаза В - их изомеризацию, фолдазы С и Д обеспечивают активность фолдаз А и В соответственно). Активность по ABTS составляла около 100-120 Е на литр среды; для сравнения -выход активной пероксидазы при рефолдинге из телец включения с литра среды по методике, разработанной в нашей лаборатории, составляет не менее 20 000 Е.
Таким образом, усилия, направленные на получение активной пероксидазы хрена в растворимой форме, пока не принесли существенного успеха.
В этой связи хочется упомянуть довольно нетипичный случай в научной практике: опубликованная в 1999 году статья по направленной эволюции пероксидазы хрена С при экспрессии в Ecoli, выполненная в Калифорнийском Институте Технологии (Калтэк) [81], в 2000 г была отозвана авторами как ошибочная. Таким образом, примеры успешной направленной эволюции при экспрессии пероксидаз растений пока отсутствуют.
2.3. Механизм окисления люминола под действием пероксидаз
Реакция окисления люминола, катализируемая пероксидазой, происходит по следующей трехстадийной схеме:
Е + Н202 *—> EI + Н20 (1)
EI + LH- —>EII + L" (2)
ЕЙ + ЬЬГ 3—> Е + L" (3)
где Е, EI и ЕП - ферри-форма фермента и Соединения I и II, соответственно, a LH" и L*" - люминол и продукт его радикального одноэлектронного окисления.
В случае HRP скорость-лимитирующей стадией является реакция (3) восстановления Соединения II Поэтому для полного завершения каталитического цикла в реакционную смесь часто добавляют другой субстрат (т.н. усилитель хемилюминесценции) с более высоким значением к}, чем у люминола. В последние годы реакция совместного окисления люминола и различных субстратов-усилителей (фенолов, нафтолов, бензотиазолов, ароматических аминов или борных кислот), катализируемая пероксидазой хрена, используется как аналог метода меченых радиоактивных изотопов в иммуноанализе (напр. ELISA) и анализе ДНК.
Предел чувствительности метода усиленной хемилюминесценции зависит от чистоты используемой воды и реагентов. Кроме того, на предел чувствительности влияет константа диссоциации связи гемин-апофермент. В пероксидазах растений эта связь нековалентная, поэтому при растворении фермента может происходить
медленная (5-10 мин) диссоциация гема в раствор, что приводит к нарушению линейной зависимости каталитической активности от концентрации фермента. Эту нелинейность можно использовать для расчета константы диссоциации гема. Для HRP она составляет 10'12 М при рН 4,5 - 8,5, а при более высоких значениях рН константа увеличивается, например при рН 9,1 она уже составляет 2x10' М [74,82]. Этот факт и объясняет, почему рН-оптимум реакции окисления люминола, катализируемой пероксидазой хрена, составляет 8,6, а предел чувствительности находится в диапазоне 0,1-1 пМ фермента. В случае пероксидазы табака взаимодействие Соединения II с люминолом не является скорость-лимитирующим фактором, поэтому использование усилителей не требуется.
Сравнение пероксидазы хрена и выделенной в нашей лаборатории пероксидазы табака [1] показало, что к3 для ТОР составляет
х Ю"6 rVT'c"1, в то время как для HRP эта константа меньше на 2 порядка -
х lO^M'V. Также были оптимизированы условия реакции хемилюминесценции для ТОР. Они составили: рН 9,3-9,5; 2 мМ пероксида водорода и 2 мМ люминола. Для пероксидазы хрена эти условия несколько отличаются: рН 8,3,2 мМ пероксида водорода и 1 мМ люминола.
Пероксидаза табака более стабильна в присутствии пероксида водорода, что позволяет получить предел обнаружения 1 пМ при использовании 20 мМ Н2О2. Для HRP в тех же условиях эта величина составляет 20 пМ. Предел обнаружения в оптимальных условиях составляет менее 0,1 пМ и 1 пМ для ТОР и HRP соответственно
Одним из главных отличий пероксидазы табака от пероксидазы хрена является абсолютно другой вид кривой хемилюминесценции Для ТОР характерно быстрое падение сигнала до ~60% и его дальнейшее медленное затухание. Для HRP- сигнал быстро достигает максимума и затем происходит его медленное снижение.
Было показано, что хемилюминесценция, катализируемая ТОР в анаэробных условиях, ингибируется почти в 3 раза, в то время как для HRP не было выявлено
подобных эффектов [1]. Это также демонстрирует разницу в механизмах реакций окисления люминола без усилителя (и-иодфенол) и в его присутствии.
При ферментативном окислении люминола помимо пероксидазного цикла, как полагают, протекает ряд неферментативных радикальных реакций, приводящих к появлению аддукта гидропероксида люминола (LOOH"), который является предшественником вещества, испускающего свет, те 3-аминофталата (3-АР). Существует два пути его образования. Во-первых, тн. азахиноновая последовательность реакций
2L- >L + LH" (4)
L + Н02' > LOOH' > 3-АР + N2 + hv (5)
а во-вторых, образование через супероксид (02*")
L" + 02 -г-— L + 02"
1Л + 02'"' >LOOH' >3-AP + N2 + hy (6)
Оба процесса происходят одновременно, и доминирование одного пути над другим зависит от определенных условий протекания реакции (концентрации фермента, субстратов, кислорода, рН). При низких концентрациях кислорода и высоких значениях рН преобладает второй вариант, а первый - доминирует при высоких концентрациях субстрата и фермента.
Для реакции окисления люминола в присутствии пероксидазы табака характерно смещение рН-оптимума в щелочную область, что указывает на преобладание супероксидного пути образования 3-аминофталата. В случае реакции усиленной хемилюминесценции в присутствии HRP его вклад незначителен [1]
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы
В работе были использованы 2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) аммония (ABTS), фенол, 4-аминоантипирин, иодид калия, гваякол, ферроцианид калия, ацетат натрия, цитрат натрия, лимонная кислота, индол ил-3-уксусная кислота, резорцин, вератровый спирт, ремазол, феруловая кислота, п-кумаровая кислота, о-фенилендиамин, 2-гидрокси-З-метоксибензиловый спирт (23НМ), З-гидрокси-4-метоксибензиловый спирт (34НМ), додецилсульфат натрия (SDS), трис(оксиметил)аминометан (трис), хлорид кальция фирмы Sigma (США). Рекомбинантная пероксидаза хрена получена в нашей лаборатории по методике, описанной ранее [58]. Пероксидаза табака была получена из трансгенных растений табака, как описано ранее [2]. Концентрацию Н202 определяли по поглощению на 240 нм, пользуясь коэффициентом экстинкции 43,6 М* см"1 [83].
3.2. Методы исследования
3.2.1. Клонирование гена пероксидазы табака
Ген пероксидазы табака был любезно предоставлен проф Марком Лагримини (Head of Department of Agronomy and Horticulture, University of Nebraska-Lincoln, 279 Plant Science Lincoln, NE, USA). Генно-инженерные работы по клонированию гена и конструированию мутанта были проведены к.х.н. Савицким П.А. и к.х.н. Рожковой A.M. Ген был амплифицирован методом ПЦР с использованием следующих праймеров:
5'-CATATGCAATTAAGTGCAACATTTTATGATACC-3'
h5'-GTCGACGAATTCT-TAATTAACCCTCTT-3.
Продукт ПЦР был клонирован в промежуточный вектор pCRII-TOPO. Фрагмент
Ndel-Xhol размером 0,9 kb, содержащий ген пероксидазы табака, был затем
переклонирован в экспрессионный вектор рЕТ40Ь по сайтам Ndel и Sail. Из двух
независимых клонов плазмиды были выделены и секвенированы. Плазмиды были использованы для трансформации Е coh BL21(DE3) и BL21(DE3)CdPlus.
3.2.2. Направленный мутагенез пероксидазы табака
Введение мутации GluNlPhe осуществляли с помощью праймера E141FJwd:5' - ССТ AGC CCC TTT ТТС АСА CTT GCT GTA - 3' и антипраймера E141F_rev: 5' - ТАС AGC AAG TGT GAA AAA GGG GCT AGG - 3' по методу и с помощью набора QuikChange фирмы Stratagene (США). Эффективность введения мутации составляла 100%, как было показано секвенированием плазмид из 3 отдельных клонов.
3.2.3. Экспрессия пероксидазы табака в клетках E.coli
Трансформированные клетки Е coli BL21(DE3)CdPlus культивировали в 0,5-2 л LB-среды, приготовленной на 10 мМ трис-HCl буфере, рН 8,0, содержавшем 40 мкг/мл канамицина при 37. Экспрессию гена индуцировали добавлением 0,2 мМ IPTG в середине логарифмической фазы роста клеток.
3.2.4. Выделение пероксидазы табака из телец включения
Биомассу собирали и разрушали ультразвуком (22 кГц, 10 мин) в присутствии 2 М NaCl и 10 мМ дитиотреитола (DTT). Смесь инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре и затем повторяли обработку ультразвуком. Надосадочную жидкость удаляли и осадок промывали 0,05 М трис-буфером, рН 8,5, с последующей солюбилизацией в 20-60 мл 6 М мочевины, содержавшей 1 мМ DTT
3.2.5. Рефолдинг пероксидазы табака
Солюбилизированный апобелок (95% чистоты, 5 мг/мл) приливали по каплям к среде для рефолдинга (200-600 мл) и инкубировали при 4. Оптимизацию среды для рефолдинга проводили, варьируя концентрации мочевины (1,8-2,3 М), окисленного глутатиона (0,1-0,7 мМ), DTT (0,1-1 мМ), при концентрации СаСІг
5 мМ, гемина 5 мкМ, глицерина 5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 8,4-9,5. В процессе инкубации измеряли активность по ABTS и после прекращения роста активности среду насыщали сульфатом аммония (60%), осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 30 мл воды. Альтернативным методом концентрирования фермента после процедуры рефолдинга являлась ультрафильтрация на ячейке Amicon через мембрану YM-10
3.2.6. Очистка пероксидазы табака
Полученный концентрированный раствор фермента наносили порциями по 5-7 мл на колонку (5,2x80 см) с Sephacryl S-200, уравновешенным 0,05 М трис-НСІ буфером, рН 8,5. При необходимости стадию гель-фильтрации проводили повторно. Активные фракции собирали и концентрировали.
Для получения препарата пероксидазы в количестве свыше ста миллиграммов использовали колонку объемом 500 мл с Sephacryl S-200, а объем наносимых на нее образцов не превышал 10 мл. Активные фракции собирали и концентрировали.
3.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)
Электрофорез по методу Лэмли проводили на приборе Miniprotean II фирмы "Biorad" (США) по протоколам фирмы-изготовителя. Для этого использовались следующие растворы:
Буфер А: 1,5 М трис-НСІ, 0,25 г/л SDS, рН 8,8.
Буфер Б: 0,5 М трис-НСІ, 0,25 г/л SDS, рН 6,8.
Раствор, содержащий акриламид (30%) и бис-акриламид (0,8%). -10% раствор SDS.
Буфер для нанесения образцов: буфер Б 2,5 мл, глицерин 2 мл, 10% SDS 3 мл, 2-меркаптоэтанол 0,3 мл, 0,2% бромфеноловый синий, деионизованная вода 2,2 мл.
Раствор для окраски геля: 0,1 % Кумасси R-250, 40% этанола и 10% уксусной кислоты.
Раствор для отмывки: 40% этанола и 10% уксусной кислоты.
Концентрирующий гель (5%): буфер Б 1,25 мл, акриламид/бис-акриламид 750 мл, деионизованная вода 3 мл.
Классификация гем-содержащих пероксидаз и реакционный цикл
Прогресс белковой инженерии гем-содержащих пероксидаз и установление их кристаллической структуры (цитохром С пероксидаза [10], аскорбатпероксидаза гороха [11], лигнин- [12], [13] и марганец- [14] пероксидазы Phanerochaete chrysosponum, грибная пероксидаза Coprinus cinereus [15] I Arthromyces ramosus [16], пероксидаза арахиса [17], рекомбинантная пероксидаза хрена (HRP) [18] и пероксидаза ячменя [19], пероксидаза сои [20], две изоформы пероксидазы арабидопсиса [21]—[22]) позволили предложить постадийный механизм, описывающий гетеролитическое расщепление пероксида водорода в активном центре и его последующее восстановление молекулой фенольного субстрата (Схема 2)
Главную роль в гетеролитическом расщеплении пероксида играют дистальные остатки гистидина-42 и аргинина-38. Пероксидаза содержит три гистидиновых остатка - 40, 42 и 170. Последний является проксимальным лигандом железа (рис.1). Химической модификации подвергаются только 40 и 42 остатки [23]
Проксимальный His 170 отвечает за прочное связывание гема в активном центре. При его замене на аланин константа скорости образования Соединения I падает на 5 порядков. Добавление имидазола позволяет увеличить константу в 1500 раз, восстанавливая лишь процент ферментативной активности [24]. Полагают, что проксимальный лиганд гема His 170 образует водородную связь с Asp247, которая увеличивает его основность, облегчает стабилизацию заряда в окисленных формах пероксидазы и позволяет поддерживать атом железа с координационным числом 5 [18].
Дистальный или, как его еще называют, каталитический гистидин-42 отвечает за расщепление пероксида водорода. Механизм образования Соединения I включает переходное образование комплекса трехвалентного железа и перокси-аниона при протонировании дистального гистидина (см. Схему 2). Перенос протона с дистального гистидина на гидроксильную группу и образование молекулы воды генерирует оксиферрил-гем и катион-радикал на порфириновом кольце - Соединение І. В Соединениях I и II не обнаружена водородная связь между феррильным кислородом и дистальным гистидином [25]
При замене дистального гистидина на Ala, Leu, Val константы скорости первой стадии реакции падают на много порядков [26,27]; так, замена на лейцин уменьшает константу второго порядка в реакции с пероксидом водорода на 5 порядков по сравнению с нативной и рекомбинантной формами HRP, а константа первого порядка гетеролитического расщепления 0-0 связи при образовании Соединения I падает на 4 порядка В случае мутанта His42Ala добавление 2-замещенных имидазолов частично восстанавливало каталитическую активность благодаря образованию альтернативного центра связывания протонов. Создание двойного мутанта Phe41His/His42Ala восстанавливает каталитическую активность фермента [28] Мутант His42Glu [29] (имитация хлоропероксидазы) на 4 порядка менее активен при взаимодействии с пероксидом водорода. При этом в отличие от хлоропероксидазы присутствие дистального остатка аргинина является критическим (двойной мутант His42Glu/Arg38Ser неактивен)
Важной структурной особенностью является водородная связь His42-Asn70 [30] и далее к Glu64 и до дистального Са -связывающего центра, как показано на рис 1.
Предполагается, что для максимальной эффективности пероксидазного катализа требуется совершенно определенная ориентация имидазольного кольца His42 по отношению к порфириновому кольцу, которая и реализуется посредством водородной связи между His42 и Asn70 [30], [31]. При замене Asn70 на валин [30], [32] разрушается водородная связь с гистидином и фермент демонстрирует очень низкую каталитическую активность.
Дистальный остаток Arg38 играет важную роль на всех ступенях катализа [33-35]. Замена его на лизин уменьшает скорость образования Соединения І в 500 раз, а замена на лейцин-в 1200 раз Анализ мутации Arg38Ser пероксидазы из
Общий вид молекулы пероксидазы хрена со стороны входа в активный центр, формируемого четырьмя остатками фенилаланина - 142, 143, 179, 68. Последний остаток имеет конформацию крышки, которая при связывании ингибитора - бензгидроксамовой кислоты - «закрывается» (см. рис.3). корней хрена спектрально показал присутствие дополнительного промежуточного соединения, предшествующего Соединению I и имеющего спектр отличный от Соединения 0 (переходное промежуточное соединение наблюдалось при низкой температуре, что, как полагают, может характеризовать связывание перокси-аниона) Изучение квантовых моделей электронных спектров предполагаемых переходных промежуточных соединений показало, что назначением этого нового промежуточного соединения является нейтральное связывание пероксида в активном центре Замена аргинина на лейцин уменьшала на три порядка константу скорости образования комплекса фермент-пероксид водорода и 6-кратное падение константы скорости распада этого комплекса с образованием Соединения II. Эти данные согласуются с предположением, что аргинин выполняет две функции при каталитическом образовании Соединения I: во-первых, участвует в связывании пероксида водорода и тем самым стимулирует перенос протона с Н2О2 к имидазольной группе His42 для облегчения связывания пероксид-аниона с гемом, и, во-вторых, перераспределяет электронную плотность между атомами кислорода при гетеролитическом разрыве 0-0 связи, то есть способствует и правильной ориентации пероксида водорода в активном центре, и его гетеролитическому расщеплению
Остаток аргинина участвует в стабилизации Соединения I, образуя водородную связь с кислородом феррила [25]. По данным мутагенеза, Arg38, в отличие от His42, принимает участие в связывании ароматических субстратов. Замена его на лейцин привела к значительному уменьшению константы связывания пероксидазы с бензгидроксамовой кислотой [36], гваяколом и «-крезолом [33]. По данным рентгеноструктурного анализа комплекса пероксидазы хрена с цианидом и феруловой кислотой (см. ниже), этот остаток напрямую участвует в связывании субстратов пероксидазы. Таким образом, помимо контролирования реакционной способности пероксидазы в отношении пероксида водорода, этот остаток играет важную роль в связывании и ориентировании доноров электронов в активном центре.
Направленный мутагенез пероксидазы табака
Введение мутации GluNlPhe осуществляли с помощью праймера E141FJwd:5 - ССТ AGC CCC TTT ТТС АСА CTT GCT GTA - 3 и антипраймера E141F_rev: 5 - ТАС AGC AAG TGT GAA AAA GGG GCT AGG - 3 по методу и с помощью набора QuikChange фирмы Stratagene (США). Эффективность введения мутации составляла 100%, как было показано секвенированием плазмид из 3 отдельных клонов.
Трансформированные клетки Е coli BL21(DE3)CdPlus культивировали в 0,5-2 л LB-среды, приготовленной на 10 мМ трис-HCl буфере, рН 8,0, содержавшем 40 мкг/мл канамицина при 37. Экспрессию гена индуцировали добавлением 0,2 мМ IPTG в середине логарифмической фазы роста клеток.
Биомассу собирали и разрушали ультразвуком (22 кГц, 10 мин) в присутствии 2 М NaCl и 10 мМ дитиотреитола (DTT). Смесь инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре и затем повторяли обработку ультразвуком. Надосадочную жидкость удаляли и осадок промывали 0,05 М трис-буфером, рН 8,5, с последующей солюбилизацией в 20-60 мл 6 М мочевины, содержавшей 1 мМ DTT
Солюбилизированный апобелок (95% чистоты, 5 мг/мл) приливали по каплям к среде для рефолдинга (200-600 мл) и инкубировали при 4. Оптимизацию среды для рефолдинга проводили, варьируя концентрации мочевины (1,8-2,3 М), окисленного глутатиона (0,1-0,7 мМ), DTT (0,1-1 мМ), при концентрации СаСІг мМ, гемина 5 мкМ, глицерина 5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 8,4-9,5. В процессе инкубации измеряли активность по ABTS и после прекращения роста активности среду насыщали сульфатом аммония (60%), осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 30 мл воды. Альтернативным методом концентрирования фермента после процедуры рефолдинга являлась ультрафильтрация на ячейке Amicon через мембрану YM- Полученный концентрированный раствор фермента наносили порциями по 5-7 мл на колонку (5,2x80 см) с Sephacryl S-200, уравновешенным 0,05 М трис-НСІ буфером, рН 8,5. При необходимости стадию гель-фильтрации проводили повторно. Активные фракции собирали и концентрировали.
Для получения препарата пероксидазы в количестве свыше ста миллиграммов использовали колонку объемом 500 мл с Sephacryl S-200, а объем наносимых на нее образцов не превышал 10 мл. Активные фракции собирали и концентрировали.
Электрофорез по методу Лэмли проводили на приборе Miniprotean II фирмы "Biorad" (США) по протоколам фирмы-изготовителя. Для этого использовались следующие растворы: - Буфер А: 1,5 М трис-НСІ, 0,25 г/л SDS, рН 8,8. - Буфер Б: 0,5 М трис-НСІ, 0,25 г/л SDS, рН 6,8. - Раствор, содержащий акриламид (30%) и бис-акриламид (0,8%). -10% раствор SDS. - Буфер для нанесения образцов: буфер Б 2,5 мл, глицерин 2 мл, 10% SDS 3 мл, 2-меркаптоэтанол 0,3 мл, 0,2% бромфеноловый синий, деионизованная вода 2,2 мл. - Раствор для окраски геля: 0,1 % Кумасси R-250, 40% этанола и 10% уксусной кислоты. - Раствор для отмывки: 40% этанола и 10% уксусной кислоты. - Концентрирующий гель (5%): буфер Б 1,25 мл, акриламид/бис-акриламид 750 мл, деионизованная вода 3 мл. - Разделяющий гель (12%): буфер А 2,5 мл, акриламид/бис-акриламид 4 мл, деионизованная вода 3,5 мл.
Для инициирования реакции полимеризации добавляли 10% раствор персульфата аммония до конечной концентрации 0,05% В качестве катализатора полимеризации использовали TEMED в конечной концентрации 0,05% (0,1% для концентрирующего геля). Электрофорез проводили в условиях, рекомендованных фирмой-изготовителем, при постоянном напряжении 200 В в течение 45 минут.
Для визуализации полос белка гель на 30 минут помещали в раствор для окрашивания. Для удаления фона после окрашивания гель отмывали 3 раза по 20 минут в свежей порции раствора для отмывки. Чувствительность окраски с помощью Кумасси R-250 составляет 1 мкг белка в полосе.
Концентрацию белка (мкг/мл) определяли спектрофотометрически по формуле 183А2зо-75,8А2бо [84]. Ранее нами было показано, что спектрофотометрический метод дает совпадающие результаты с методом определения белка по Бредфорду [85]. Концентрацию фермента определяли по поглощению при 403 нм, используя коэффициент экстинкции, равный 108 мМ см"1 [3]. Молекулярную массу пероксидаз определяли методом SDS-PAGE.
Особенности кристаллической структуры пероксидазы табака
Рекомбинантная пероксидаза табака дикого типа, наработанная нами в препаративных количествах, была передана для работ по кристаллизации в Центр Кристаллизации Белка Университета Копенгагена, Дания, руководимый проф. Сине Ларсен. Полученные первые кристаллы (рис.11) были использованы для расшифровки структуры фермента с разрешением 2,7 А. Координаты структуры были переданы в нашу лабораторию. Как оказалось, использование 1 мМ кальция приводит к его нехватке в проксимальном центре связывания (рис. 12), поэтому ион кальция был внесен в координаты вручную. В настоящее время получены более крупные кристаллы при использовании дополнительного кальция в среде для кристаллизации.
В кристаллической ячейке находится 4 молекулы белка, их расположение можно описать как два димера (см рис. 12), причем в димере молекулы фермента ориентированы так, что вход в активный центр экранирован. Ранее такая ориентация наблюдалась для пероксидазы хрена в комплексе с бензгидроксамовой кислотой по данным кристаллической структуры, а в нашей лаборатории было показано существование такого димера в мицеллах. Ориентация молекул пероксидазы табака в кристаллической ячейке позволяет полагать, что этот фермент также имеет тенденцию к димеризации, что может быть предметом дальнейших исследований.
Сравнение кристаллической структуры рекомбинантной пероксидазы табака с ее модельной структурой, полученной методом гомологичного моделирования на основе кристаллической структуры изофермента С пероксидазы хрена, к ф -м.н И В. Упоровым, показывает, что модель, которая была нами использована при планировании и проведении мутагенеза, практически не отличается от реальной структуры - смещение цепей при наложении структур не превышает 0,4 А (не показано)
Анализ структурных особенностей анионной пероксидазы табака приводит к выводу, что фермент имеет структуру, практически совпадающую с анионной пероксидазой арабидопсиса: проксимальный домен в меньшей степени контролирует доступ в активный центр по сравнению с пероксидазой хрена, а именно, остаток Phel79 (177 у пероксидазы табака), участвующий в связывании субстратов у пероксидазы хрена, в обоих анионных пероксидазах (табака и арабидопсиса) достаточно удален от входа в активный центр и ориентирован в сторону (рис 13) Экранирование гема осуществляется остатком пролина 137 (139), который в свою очередь защищен остатком глутаминовой кислоты, связанной водородной связью с остатком глутамина-149 (или лизина-151 у арабидопсиса), причем явно, что у пероксидазы табака наличие соседнего остатка фенилаланина обеспечивает большее экранирование, нежели комбинация остатка изолейцина и глутаминовой кислоты у пероксидазы арабидопсиса. У пероксидазы хрена С такая водородная связь отсутствует, на месте глутаминовой кислоты и глутамина находятся невзаимодействующие фенилаланин-143 и серин-151 (см. рис. 13).
Положение остатка глутаминовой кислоты является примечательным -отрицательный заряд на входе в гем-связывающую полость очевидно препятствует включению гема, имеющего отрицательно заряженные остатки пропионовой кислоты, но и не исключено, что наличие такого остатка может выполнять и ориентирующую роль, направляя пропионаты гема в нужном направлении при встраивании в активный центр. Поэтому замена этого остатка на любой другой, не имеющий заряда, должна положительно сказаться на выходе реактивации при рефолдинге фермента. При введении остатка глутаминовой кислоты вместо остатка фенилаланина в рекомбинантную пероксидазу хрена в нашей лаборатории было показано уменьшение выхода реактивации с 30 до 7% [58]. В данной работе была проведена обратная мутация с целью подтверждения роли остатка в контролировании доступа гема в гем-связывающую полость.
Анализ структуры пероксидазы табака показывает наличие многочисленных отрицательно заряженных остатков, если сравнивать ее со структурой пероксидазы хрена. Поверхность пероксидазы табака должна иметь множественные неспецифические центры взаимодействия с ионами кальция, и возможно, что остаток глутаминовой кислоты, при условии разрыва водородной связи с глутамином-149, является одним из лигандов иона кальция вблизи входа в активный центр. Данные по нативной пероксидазе табака продемонстрировали ухудшение каталитических параметров расщепления пероксида водорода в присутствии 50 мМ хлорида кальция в растворе. Поэтому мутация остатка глутаминовой кислоты могла ответить и на вопрос о ее роли как возможного лиганда неспецифического поверхностного центра связывания кальция.
Недостаточное включение кальция в проксимальный центр пероксидазы табака является неожиданным со структурной точки зрения - проксимальный ион кальция имеет те же 7 координационных лигандов, что и в пероксидазе хрена и арахиса. В литературе описана лабильность дистального центра связывания кальция у пероксидаз арахиса и ячменя, но данных о неполном включении кальция в проксимальный центр пероксидаз растений ранее в литературе не было. Неполное включение кальция и образование активного фермента показывает, что наличие кальция в проксимальном центре не является обязательным для фолдинга проксимального домена, хотя влияет на стабильность фермента при хранении и разбавлении
Механизм совместного окисления фенолов и ABTS под действием пероксидазы табака
В нашей работе изучалось совместное окисление ABTS и фенола (или ABTS и резорцина), катализируемое нативной и рекомбинантными формами анионной пероксидазы табака. Нативная пероксидаза табака, выделенная ранее в нашей лаборатории, отличается высокой стабильностью в кислых средах [3] и практически неактивна по отношению к фенолу и иодид-аниону [2;39]. Рекомбинантные формы фермента также отличаются исключительно низкой активностью по фенолу. Практическое отсутствие ферментативной активности по отношению к фенолу позволяет изучать его совместное окисление с ABTS, пренебрегая его индивидуальным ферментативным окислением.
При анализе кинетических кривых окисления ABTS в присутствии фенола (рис. 29) обращает на себя внимание падение степени конверсии ABTS и установление некой стационарной концентрации продукта окисления ABTS. Степень конверсии падает пропорционально возрастанию концентрации фенола, в то время как начальная скорость окисления ABTS в пределах экспериментальной ошибки не зависит от концентрации фенола (рис 29, 30).
В пероксидазном катализе известно явление субстрат-субстратной активации [91; 101]. При такой активации наблюдается ускорение окисления трудноокисляемого или вообще не окисляемого («плохого») субстрата (Si) в присутствии легкоокисляемого («хорошего») субстрата (S2). Три различных механизма могут приводить к субстрат-субстратной активации. В первом случае Соединение I активно по отношению к «плохому» субстрату, в то время как Соединение II не взаимодействует с этим субстратом:
В этом случае «хороший» субстрат необходим для превращения Соединения II в исходную форму пероксидазы [102]. При таком механизме ускоряется реакция окисления «плохого» субстрата, а окисление «хорошего», наоборот, замедляется Чисто формально «плохой» субстрат выступает как конкурентный ингибитор по отношению к «хорошему» субстрату. Продуктивность связывания «плохого» субстрата в этом случае должна быть независимо доказана.
Во втором случае окисление «хорошего» субстрата не детектируется до тех пор, пока не исчерпается «плохой» субстрат. На кривых окисления «хорошего» субстрата наблюдается индукционный период, продолжительность которого пропорциональна концентрации «плохого». Механизм подобной активации может быть как ферментативным, так и неферментативным Если «плохой» субстрат окисляется при взаимодействии с комплексом фермент-окисленный «хороший» субстрат, который остается связанным на ферменте [102-107], можно говорить о ферментативном механизме активации: где EII-VA: - комплекс Соединения II лигнинпероксидазы с катион-радикалом вератрового спирта, Vald - вератровый альдегид, S2 - «плохой» субстрат и Р2 -продукт его окисления.
Образование такого комплекса между Соединением II лигнинпероксидазы и катион-радикалом вератрового спирта было подтверждено экспериментально [46; 108; 109] Неспособность катион-радикала вератрового спирта окислить некоторые субстраты в отсутствие фермента была интерпретирована как более высокий редокс-потенциал связанного с ферментом катион-радикала по сравнению с его свободной формой в растворе [110].
Третий случай - это прямое неферментативное взаимодействие ферментативно окисленного «хорошего» субстрата с «плохим»: восстановленная и окисленная форма фермента (лакказы или пероксидазы), А, А , А - 2,2 -азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) аммония (ABTS) и его катион-радикал и дикатион
Именно эта схема совместного окисления субстратов представляет большой практический интерес для разработки биотехнологических методов обесцвечивания/деполимеризации лигнина при производстве бумаги Такой тип взаимодействия был предложен для системы лакказа (медьсодержащая оксидаза, катализирующая окисление различных органических соединений молекулярным кислородом), лигнин и ABTS [111] При электрохимическом окислении ABTS сначала окисляется до катион-радикала ABTS и далее до дикатиона ABTS2+ [111]. Из данных электрохимических экспериментов в отсутствие фермента была рассчитана константа взаимодействия вератрового спирта с ABTS2+, равная 170 M V1 [111]. Авторами было высказано предположение, что катион-радикал ABTS является медиатором при окислении фенольных структур лигнина, а дикатион - нефенольных. В отличие от относительно дешевого медиатора -гидроксибензотриазола, ABTS - очень дорогой субстрат, применяемый лишь в лабораторных исследованиях. Экспериментально измеренная очень низкая константа скорости взаимодействия гидроксибензотриазола с вератровым спиртом, равная 2,5 M V1, по-видимому, отражает неприменимость разработанного электрохимического подхода, исходящего из обратимости окисления-восстановления медиатора [111].
